光學(xué)顯微鏡的原理及應(yīng)用

光學(xué)顯微鏡的

原理及應(yīng)用2

顯微鏡發(fā)展史

顯微鏡，通常作為研究和科學(xué)發(fā)現(xiàn)的象征，從Leeuwenhoek發(fā)明簡(jiǎn)單放大器發(fā)展到今天精密復(fù)雜的儀器已有350多年。它的誕生突破了人類生理的限制，把視覺伸展到人眼不能分辨的微觀世界中去。

2023/2/153●顯微鏡的類型

顯微鏡的種類繁多，根據(jù)應(yīng)用范圍可分為“生物顯微鏡”、“金相顯微鏡”和“工業(yè)檢測(cè)顯微鏡”三大類。

根據(jù)照明光源的性質(zhì)來分，可分為“光學(xué)顯微鏡”（單式顯微鏡、復(fù)式顯微鏡）和“非光學(xué)顯微鏡”（電子顯微鏡）兩大類。

●

光學(xué)顯微鏡：

◆單式顯微鏡：

◆復(fù)式顯微鏡：

2023/2/154

●非光學(xué)顯微鏡

如電子顯微鏡2023/2/155●根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能顯微鏡又可分為：

1）

普通型：供一般常規(guī)鏡檢、教學(xué)和研究用；

2）特種型：供某種專門觀察和研究用。如：暗場(chǎng)、相襯、

偏光、微分干涉、熒光、體視、倒置、比較、

金相、顯微鏡攝影、電視顯示、電影攝影顯

微鏡等；

3）

高級(jí)型：又稱萬能顯微鏡2023/2/156顯微鏡的分類法尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，歸納起來可概括如下：

單式顯微鏡各種放大鏡、平臺(tái)解剖鏡

光學(xué)顯微鏡

普通型（小型）常規(guī)鏡檢、教學(xué)用

復(fù)式顯微鏡特種型（中型）專用或多用途研究用

高級(jí)型（大型）聯(lián)機(jī)多用途研究用

2023/2/157●顯微鏡的基本光學(xué)原理

2023/2/158

基本光學(xué)原理如圖，圖中左邊小的凸透鏡代表短焦距的一組透鏡，稱物鏡。右邊大的凸透鏡代表長(zhǎng)焦距的一組透鏡，稱目鏡。被觀察的物體（AB）放在物鏡焦點(diǎn)(f1)稍外的地方，物體的光線通過物鏡后在目鏡焦點(diǎn)（F2）稍內(nèi)方形成一個(gè)倒立的放大實(shí)像（B’A’）。觀察者的眼睛通過目鏡將該實(shí)像（B’A’）進(jìn)一步放大為一個(gè)倒立的虛像（B"A"）。2023/2/159◆折射和折射率

當(dāng)光線通過不同密度介質(zhì)的透明物體時(shí)，則發(fā)生折射現(xiàn)象，這是由于光在不同介質(zhì)中的傳播速度不同所造成的。當(dāng)與透明物面不成垂直的光線由空氣傳入透明物體時(shí)，光線在其界面改變了方向，并和垂直線構(gòu)成了折射角，產(chǎn)生該種介質(zhì)的折射率。2023/2/1510

光線從一種介質(zhì)（如空氣）投射到另

一種較為致密的介質(zhì)（如玻璃）中時(shí)會(huì)彎

向法線（與介質(zhì)交界面垂直的一條線），

如圖3中的BOA線。光線由致密介質(zhì)（玻璃）

進(jìn)到不致密介質(zhì)（空氣）中時(shí)會(huì)偏離“法線”，

如AOB線（圖3a）。

當(dāng)光線穿過聚光鏡玻璃（折射率為1.51）進(jìn)入空氣時(shí)同樣會(huì)偏離，向外折射，因此進(jìn)人物鏡的光量減少很多，像的分辨力也降低。使用100倍物鏡時(shí)，如果在物鏡和蓋玻片之間充以油液（折射率同樣為1.51）以隔絕空氣，則光線幾乎可以不折射地進(jìn)人物鏡，這就增加了圖像的亮度和分辨率。這種物鏡稱為油浸物鏡（圖3b）。2023/2/1511◆透鏡的性能

透鏡是組成顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)的最基本的光學(xué)原件，物鏡、目鏡及聚光鏡等部件均由單個(gè)和多個(gè)透鏡組成。依其外形的不同，可分為凸透鏡（又稱會(huì)聚透鏡、正透鏡）和凹透鏡（又稱散發(fā)透鏡、負(fù)透鏡）兩大類。

當(dāng)一束平行于光軸的光線通過凸透鏡后則相交于一點(diǎn)，這個(gè)點(diǎn)稱“焦點(diǎn)”，通過交點(diǎn)并垂直光軸的平面，稱“焦點(diǎn)平面”。焦點(diǎn)有兩個(gè)，在物方空間的焦點(diǎn)，稱“物方焦點(diǎn)”，該處的焦平面，稱“物方焦平面”；反之，在象方空間的焦點(diǎn)，稱“象方焦點(diǎn)”，該處的焦平面，稱“象方焦平面”。2023/2/1512

對(duì)于凹透鏡來說，當(dāng)一束平行于光軸的光線通過透鏡后，形成散射光，在象方空間不能相交于一點(diǎn)，只有它們的延長(zhǎng)線才能在物方空間相交于一點(diǎn)，這個(gè)點(diǎn)稱“虛焦點(diǎn)”，這個(gè)平面稱“虛焦點(diǎn)平面”。由于凸透鏡在物方所成的象是光線真正的交點(diǎn)，稱為“實(shí)象”；而凹透鏡則不同，它所形成的象是與物體處在同一方，固稱為“虛象”。2023/2/1513◆透鏡的成象質(zhì)量

透鏡所形成的象，應(yīng)滿足幾何相似的要求。一個(gè)點(diǎn)的象應(yīng)為一點(diǎn)；直線的象應(yīng)為一線。透鏡所形成的象除了象的位置、大小、倒正、虛實(shí)之外還有成象的質(zhì)量問題，也就是說，物體通過透鏡后所形成的象與理想象在形狀、顏色上有著一定的差異，這種差異稱為“象差”。象差直接影響顯微鏡成象的清晰度和象的變形。2023/2/1514象差的種類：

軸上復(fù)色象差－位置色差

復(fù)色象差－色差由色散影響象

象 軸外復(fù)色象差－放大率色差引起的清晰

差 軸上單色象差－球差由大孔徑成像引起

單色象差 慧差

軸外單色象差 象散

場(chǎng)曲不影響象的清晰度

畸變僅使象失真

球差象散慧差場(chǎng)曲負(fù)畸變正畸變2023/2/1515

當(dāng)白光通過凸透鏡時(shí)，波長(zhǎng)較短的光（藍(lán)、紫色），折射度大于長(zhǎng)波長(zhǎng)的光（紅、橙色），因此，成像時(shí)在像周出現(xiàn)各色光譜圍繞，并且有一圈藍(lán)色或紅色的輝光，這種顏色上的缺陷稱為色差。由于光線進(jìn)入（和離開）透鏡鏡面各部分的角度不同，從透鏡四周透過的光線與從透鏡中心透過的光線相比，其折射角度較大。因此，成像時(shí)在像周出現(xiàn)模糊而歪曲的影像。這種成像面彎曲的缺陷稱為球面差。

一系列形狀、結(jié)構(gòu)和距離不同的凸和凹透鏡組互相配合，便能最大限度地糾正色差和球面差，形成一個(gè)明亮、清晰而準(zhǔn)確的影像。這就是目鏡或物鏡分別由一組透鏡構(gòu)成的緣故。這種透鏡稱為消色差透鏡。2023/2/1516●顯微鏡的光學(xué)技術(shù)參數(shù)

包括：數(shù)值孔徑

分辨率

放大率

焦深

視場(chǎng)直徑

覆蓋差

鏡像亮度與視場(chǎng)亮度

工作距離2023/2/1517◆分辨率

分辨率又稱“鑒別率”或“分辨本領(lǐng)”，是衡量顯微鏡性能的一個(gè)重要參數(shù)。

正常人眼在照明良好的情況下，能分辨0.073mm距離的兩物體點(diǎn)，若小于這個(gè)距離，就分辨不清是兩個(gè)物體點(diǎn)，而被誤認(rèn)為是一點(diǎn)。因此，0.073mm為人眼的最小分辨距離。顯微鏡也是如此，其最小分辨距離也是有一定限度的。

(光學(xué)顯微鏡的最小分辨為0.4um左右）2023/2/1518◆放大率

放大率就是放大倍數(shù)，是指被檢物體經(jīng)物鏡、目鏡放大后，人眼所看到的最終圖象的大小與原物體大小的比值，是物鏡和目鏡放大倍數(shù)的乘積，如目鏡為10倍，物鏡為40倍，則放大倍數(shù)為40X10倍（放大400倍）。好的顯微鏡最大可放大2000倍，可分辨相距1X10－6cm的兩點(diǎn)。

觀察倍率(M)=物鏡倍率X

目鏡倍率

照相倍率(M)=物鏡倍率X

照相目鏡倍率

(BH/BH2系列產(chǎn)品連接熒光/微分干涉等附件時(shí)乘1.25)

視頻系統(tǒng)放大倍率

M=顯示器對(duì)角線(mm)/CCD像元件對(duì)角線(mm)

(1/3′:6mm,1/2′:8mm,2/3′:11mm)2023/2/15192023/2/1520

這些參數(shù)并不都是越高越好，它們之間是相互聯(lián)系又相互制約的，每個(gè)參數(shù)都有它本身一定的合理界限，在使用時(shí)，應(yīng)根據(jù)鏡檢的目的和實(shí)際情況來協(xié)調(diào)各參數(shù)之間的關(guān)系，但應(yīng)以保證分辨率為準(zhǔn)。2023/2/1521

顯微鏡基本結(jié)構(gòu)

光學(xué)顯微鏡在結(jié)構(gòu)上分為光學(xué)系統(tǒng)和機(jī)械裝置兩個(gè)部分。

光學(xué)系統(tǒng)主要包括目鏡、物鏡、聚光器、光闌及光源等部分。

機(jī)械裝置主要包括鏡筒、鏡柱、載物臺(tái)、鏡座、粗細(xì)調(diào)節(jié)螺旋等部分（見圖）。2023/2/15222023/2/1523●顯微鏡的光學(xué)部件

◆物鏡

一般應(yīng)于顯微鏡筒的下方，接近所觀察的物體，由8～10片透鏡組成。其作用一是放大（給物體造成一個(gè)放大的實(shí)像），二是保證圖像的質(zhì)量，三是提高分辨率。多個(gè)物鏡共同鑲在換鏡轉(zhuǎn)盤上，可以按需要轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)盤選擇不同倍數(shù)的物鏡。

2023/2/1524◆物鏡的種類

根據(jù)物鏡蓋玻片之間的介質(zhì)不同，可分為：部分干燥物鏡、水浸系物鏡、油浸系物鏡。

根據(jù)放大率可分為：低倍物鏡（1X～6X）

中倍物鏡（6X～25X）

高倍物鏡（25X～63X）

油浸物鏡（90X～100X）。2023/2/1525

根據(jù)物鏡象差校正的程度來分類：消色差物鏡、復(fù)消色差物鏡、半復(fù)消色差物鏡、平場(chǎng)物鏡、特種物鏡（帶校正環(huán)物鏡、帶虹彩光闌物鏡、相襯物鏡、無應(yīng)變物鏡、無熒光物鏡、無罩物鏡、長(zhǎng)工作距離物鏡）。

2023/2/1526◆目鏡

目鏡的作用是把物鏡放大的實(shí)象（中間象）再放大一次，并把物象映入觀察者的眼中，實(shí)質(zhì)上目鏡就是一個(gè)放大鏡。目鏡的結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單，一般由2~5片透鏡分兩組或三組構(gòu)成，上端的一塊（組）透鏡稱“接目鏡”，下端的透鏡稱“場(chǎng)鏡”。

按放大率可分為5倍、10倍和15倍三種。

2023/2/1527目鏡的種類：

惠更斯目鏡

冉姆斯登目鏡

凱爾勒目鏡

補(bǔ)償目鏡

平場(chǎng)目鏡

廣視場(chǎng)目鏡

照相目鏡

其它目鏡：如比較目鏡、投影目鏡、指示目鏡、

測(cè)微目鏡及網(wǎng)格目鏡等。2023/2/15282023/2/1529◆聚光鏡

聚光鏡又名聚光器，一般位于顯微鏡臺(tái)的下方?？蓮浹a(bǔ)光量的不足和適當(dāng)改變從光源射來的光線性質(zhì)，而且將光線聚焦于被檢標(biāo)本上，使標(biāo)本受到的光照均勻，以得到最強(qiáng)的照明光線。聚光器的下端裝有孔徑光闌（光圈）以控制光束的粗細(xì)。

2023/2/1530◆聚光鏡種類：

阿貝聚光鏡

消色差等光程聚光鏡

搖出式聚光鏡

極低倍聚光鏡

其它聚光鏡：如暗場(chǎng)聚光鏡、相襯聚光鏡、微分干涉襯

聚光鏡及長(zhǎng)工作距離聚光鏡等2023/2/1531●照明

顯微微鏡照明形式，可分為“透射式照明”和“落射式照明”兩大類。前者適用于透明或半透明的被檢物體，絕大多數(shù)生物顯微鏡屬于此類照明法；后者則適用于非透明的被檢物體，光源來自上方，又稱“反射式照明”，光學(xué)顯微鏡的照明光源位于聚光器的下方，為特制的照度均勻的強(qiáng)光燈泡，并且配有可變電阻，可以改變光線的強(qiáng)度。2023/2/15322023/2/15顯微鏡的使用342023/2/15352023/2/1536光路轉(zhuǎn)換100%80%20%100%2023/2/15◆光源的使用●高壓惰性氣體燈光的使用●可見光源的使用◆聚光鏡的使用

38聚光鏡中心調(diào)節(jié)⑤光軸中心調(diào)節(jié)螺釘③視場(chǎng)光欄③孔徑光欄②10X物鏡①標(biāo)本④聚光鏡升降旋鈕2023/2/15392023/2/15402023/2/1541◆載物臺(tái)使用

●普通載物臺(tái)

●滑動(dòng)載物臺(tái)

●數(shù)控載物臺(tái)

◆介質(zhì)的使用

◆測(cè)量2023/2/1542●標(biāo)本制作

由于普通光學(xué)顯微鏡的光源光線自鏡體下方向上透射，通過聚光鏡、物鏡，達(dá)到目鏡，因此在醫(yī)學(xué)及生物學(xué)研究中必須將被觀察的樣品切成能透過光線的、厚約6um的薄片，并且要進(jìn)行染色以顯示不同的組織和細(xì)胞等細(xì)微結(jié)構(gòu)。整個(gè)加工過程稱常規(guī)組織制片技術(shù)，包括選取適當(dāng)?shù)慕M織材料經(jīng)甲醛固定，逐級(jí)酒精脫水，石蠟包埋，用切片機(jī)將組織切成薄片裱在玻璃片上，再經(jīng)蘇木素一伊紅染料著色，最后將組織玻片封固在光學(xué)樹脂腔內(nèi)。制好的組織玻片可長(zhǎng)期保存。2023/2/1543

常用的幾種光學(xué)顯微鏡

●暗視野顯微鏡

在普通光學(xué)顯微鏡臺(tái)下配一個(gè)暗視

野聚光器（圖4），來自下面光源的光

線被拋物面聚光器反射，形成了橫過顯

微鏡視野而不進(jìn)人物鏡的強(qiáng)烈光束,因

此視野是暗的。視野中直徑大于0.004

um的微粒將光線散射，其大小和形態(tài)

可清楚看到。甚至可看到普通明視野顯

微鏡中看不見的幾個(gè)毫微米的微粒。因

此在細(xì)菌、細(xì)胞等活體檢查中常常使用。2023/2/1544●實(shí)體顯微鏡

由雙筒目鏡和物鏡構(gòu)成。放大率30～100倍左右，最大可放大200倍。利用側(cè)上方或下方顯微鏡燈照明。其特點(diǎn)為工作距離長(zhǎng)，在目鏡內(nèi)形成一個(gè)直立的放大實(shí)像，可以觀察未經(jīng)加工的物體的立體形狀、顏色及表面微細(xì)結(jié)構(gòu)，并能進(jìn)行顯微解剖操作，也可以觀察生物機(jī)體的組織切片。2023/2/1545◆偏光顯微鏡

從光源發(fā)出的光線通過空氣和普通玻璃時(shí)，在與光線垂直的平面內(nèi)的各個(gè)方向以同一振幅進(jìn)行振動(dòng)并迅速向前方傳遞，這是光的波動(dòng)性原理?？諝馀c普通玻璃為各向同性體，又稱單折射體。如果該光源的光通過一種各向異性體（又稱雙折射體）時(shí)，會(huì)將一束光線分為各只有一個(gè)振動(dòng)平面，而且振動(dòng)方向互相垂直的兩束光線。這兩束光線的振動(dòng)方向、速度、折光率和波長(zhǎng)都不相同。這樣只有一個(gè)振動(dòng)平面的光線稱偏振光。2023/2/1546

偏光顯微鏡即利用這一現(xiàn)象而設(shè)計(jì)。偏光顯微鏡內(nèi)，在物鏡與目鏡間插入一個(gè)檢偏鏡片，光源

與聚光器間鑲有起偏鏡片，圓形載物臺(tái)可

以作360°旋轉(zhuǎn)（圖5）。起偏與檢偏鏡片

處于正交檢偏位時(shí)，視野完全變黑。將被

檢物體放在顯微鏡載物臺(tái)上，若被檢物為

單折射體，則旋轉(zhuǎn)鏡臺(tái)，視野始終黑暗，

若旋轉(zhuǎn)鏡臺(tái)一周，視野內(nèi)被檢物四明四暗，

則說明被檢物是雙折射體。許多結(jié)晶物質(zhì)

（如痛風(fēng)結(jié)節(jié)中的尿酸鹽結(jié)晶、尿結(jié)石、

膽結(jié)石等）,人體組織內(nèi)的彈力纖維、膠

原纖維、染色體和淀粉樣原纖維等都是雙

折射體，可借偏振光顯微鏡技術(shù)檢驗(yàn)，進(jìn)

行定性和定量分析。2023/2/1547◆位相差顯微鏡

又稱相差顯微鏡或相襯顯微鏡。普通光學(xué)顯微鏡之所以看不見未染色的組織、細(xì)胞和細(xì)菌、病毒等活機(jī)體的圖像，是因?yàn)橥ㄟ^樣品的光線變化差別（反差）很小。標(biāo)本染色后改變了振幅（亮度）和波長(zhǎng)（顏色），影響了反差而獲得圖像。但是染色會(huì)引起樣品變形，也可使有生命的機(jī)體死亡。要觀察不染色的新鮮組織、細(xì)胞或其他微小活體必須使用位相顯微鏡。位相顯微鏡的原理是兩個(gè)光波因位相差而互相干涉，出現(xiàn)光波強(qiáng)弱和反差的改變而成可見影像。2023/2/1548

位相顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)與普通光學(xué)顯微鏡

相同。不同之處在于：①物鏡鏡頭上面，在

物鏡第二焦平面裝有一塊圓盤狀的位相板

（圖b）。②聚光器下面，在聚光器第一焦平

面裝有環(huán)形光闌(圖c)，光闌上刻有狹窄的縫

隙可通立環(huán)形強(qiáng)大。如圖6d所示，環(huán)形光

闌A點(diǎn)發(fā)出的光線經(jīng)過聚光器后成為平行光線。

光線通過載物臺(tái)上的樣品時(shí)，因樣品內(nèi)各個(gè)質(zhì)

點(diǎn)（如b點(diǎn)）的折射率不同而受到干涉，發(fā)生

衍射，即分為未偏向波（實(shí)線）和偏向波

（虛線）。

2023/2/1549未偏向波通過物鏡聚焦于位相板A’點(diǎn)上成像，然后通過位相板，均勻地分布在標(biāo)本像平面上成為背景。偏向波通過物鏡后從位相板A’點(diǎn)周圍通過位相板同樣聚焦在像平面的B’上。換句話說，未偏向波和偏向波是分別通過位相板的不同部位。在位相板上不同的區(qū)域涂有不同的涂層，可以分別改變未偏向波或偏向波的速度和亮度，由此兩種光波出現(xiàn)了位相差，差了半個(gè)波長(zhǎng)或一個(gè)波長(zhǎng)，它們?cè)谙衿矫娴暮喜ň统霈F(xiàn)明暗對(duì)比，樣品內(nèi)的各個(gè)細(xì)節(jié)也就能看得見。2023/2/1550

位相顯微鏡是利用樣品中質(zhì)點(diǎn)折射率的不同或質(zhì)點(diǎn)厚度的不等，產(chǎn)生光線的相位差，使新鮮標(biāo)本不必染色就可以看到，而且能夠觀察到活細(xì)胞內(nèi)線粒體及染色體等精細(xì)結(jié)構(gòu)，還可以用于霉菌、細(xì)菌、病毒等更微小活體的研究，進(jìn)行標(biāo)本形態(tài)、數(shù)量、活動(dòng)及分裂、繁殖等生物學(xué)行為觀察。2023/2/1551◆倒置式顯微鏡

普通顯微鏡的物鏡鏡頭方向向下接近標(biāo)本。倒置式顯微鏡的物鏡鏡頭則處于垂直向上的位置，因此目鏡和鏡筒的縱軸與物鏡的縱軸呈45度角。載物臺(tái)面積較大，在物鏡上方，物鏡、聚光鏡和光源的位置均顛倒過來，故稱為“倒置顯微鏡”。倒置顯微鏡通常都配置有4×、lO×、20×、40×、60×及100×長(zhǎng)工作距離的平場(chǎng)消色差物鏡。目鏡常為廣視場(chǎng)高眼點(diǎn)補(bǔ)償10×目鏡。聚光器為長(zhǎng)工作距離消色差聚光器。由于被檢物體多為無色透明的活體物質(zhì)，因此還附有相差、微分干涉、熒光、簡(jiǎn)易偏光部件及恒溫控制箱等附件。2023/2/1552倒置顯微鏡的常見功能

倒置顯微鏡主要用于明視野、相位差、微分干涉差及熒光顯微鏡等功能。使用時(shí)只要加上所需配件并進(jìn)行必要的調(diào)試即可具有以上顯微鏡所具備的各種功能，它實(shí)際上是一種多功能的顯微鏡。

2023/2/1553倒置顯微鏡的主要裝置

(一)相位差裝置：相差物鏡、相差聚光器、伯氏透鏡

(二)微分干涉差裝置：物鏡、DIC聚光器、起偏鏡、檢偏鏡及諾爾曼斯基棱鏡

(三)熒光顯微鏡裝置：紫外光源、“點(diǎn)”光源調(diào)中裝置、熒光物鏡、激發(fā)濾色鏡、熒光遮擋板2023/2/1554普通照明光源的調(diào)試

本光源主要用于明視野、相差及微分干涉差功能的照明。調(diào)節(jié)步驟如下：

1)換上長(zhǎng)工作距離(LWD)型聚光器，將聚光器轉(zhuǎn)盤轉(zhuǎn)到“0”擋(空擋)。

2)將視場(chǎng)光圈和孔徑光闌開大。

3)選用20×相差物鏡，對(duì)標(biāo)本聚焦。

4)將目鏡下方的觀察轉(zhuǎn)盤轉(zhuǎn)到“B”位置(伯氏透鏡)；轉(zhuǎn)動(dòng)伯氏透鏡調(diào)焦桿，使

相板在焦點(diǎn)處成像。2023/2/15555)從燈箱前的濾色鏡槽中移去散射(毛)玻璃；松開燈箱固定螺絲并前、后移動(dòng)燈箱，使燈絲直接在相板處成像。

6)松開燈座套筒固緊螺絲，調(diào)整燈箱的橫向和縱向螺旋，使燈絲像位于視野的中心位置。

7)將燈箱的固緊螺絲擰緊，放入散射玻璃(磨砂面朝向使用者)。至此，光源中心調(diào)整完畢。

通常光源中心的調(diào)整只在顯微鏡移動(dòng)、安裝或更換燈泡時(shí)才進(jìn)行。一般情況下無需調(diào)動(dòng)。2023/2/1556明視野及相差顯微鏡的調(diào)節(jié)步驟

(一)明視野顯微鏡的調(diào)節(jié)

明視野顯微鏡的照明光源較為簡(jiǎn)單，不管使用的是相差聚光器還是微分干涉差聚光器，它們都設(shè)計(jì)有兼顧明視野顯微鏡用的“0”擋或“A”擋位。該擋位設(shè)有可變光闌(孔徑光闌)，可在明視野顯微鏡的觀察或顯微攝影調(diào)節(jié)光闌時(shí)使用。使用時(shí)只要將有可變光闌擋位(“O”或“A”擋)的聚光器和觀察轉(zhuǎn)盤(目鏡的下方)轉(zhuǎn)到“O”位，按柯勒照明法調(diào)好顯微鏡即可。2023/2/1557

(二)相差顯微鏡的調(diào)節(jié)

1)換上相差聚光器(LWD)及相差物鏡(Ph)；將聚光器轉(zhuǎn)盤放到“o”擋(或選“A”擋，但需將光闌開至最大)；將觀察盤轉(zhuǎn)到“o”處。

2)調(diào)出柯勒照明。

3)將聚光器轉(zhuǎn)盤放到“PhL”擋；轉(zhuǎn)入4×物鏡并對(duì)標(biāo)本聚焦。

4)將觀察盤轉(zhuǎn)到“B”處；轉(zhuǎn)動(dòng)調(diào)焦桿，使相板直接在物鏡的焦點(diǎn)處成像。

5)如相板與環(huán)狀光不重合，可先將環(huán)狀光調(diào)中螺絲松開并調(diào)節(jié)左、右螺旋“桿”使相板將環(huán)狀光完全遮擋住

6)轉(zhuǎn)出伯氏透鏡，選擇相應(yīng)倍數(shù)的物鏡及聚光器檔進(jìn)行觀察、攝影

2023/2/1558◆微分干涉差顯微鏡（DIC）

又稱干擾或干涉顯微鏡，能看到和測(cè)定微小的位相變化，與位相顯微鏡相似，使無色透明的標(biāo)本具有陰暗和顏色的變化，從而增強(qiáng)反差。在普通光學(xué)顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)上安裝偏光和干涉部件，以及360°旋轉(zhuǎn)載物臺(tái)。它又利用偏振光的干涉原理。如圖所示，在光源上方安置有起偏鏡片和光束分解棱鏡。從起偏鏡片出來的直線偏振光通過光束分光棱鏡后，分成互相垂直振動(dòng)的兩條直線偏振光。兩條光線經(jīng)聚光器折射后射向樣品。因樣品內(nèi)各個(gè)質(zhì)點(diǎn)的折射率不同，部分光波的位相改變及因干涉而發(fā)生橫向偏移。兩條光線通過物鏡后經(jīng)第二組光束分解棱鏡相合并，由檢偏鏡發(fā)生干涉。終末像的每一個(gè)點(diǎn)是由物體上同一點(diǎn)的兩個(gè)互相重疊的不同圖象構(gòu)成的一種混合像，從而使肉眼得以辨識(shí)。2023/2/15592023/2/1560

微分干涉差顯微鏡同樣可以觀察到在普通亮視野中看不見的無色透明物體，可以觀察細(xì)胞、細(xì)菌等活體，而且影像呈立體感，較位相顯微鏡的影像更細(xì)致、更逼真?？捎盟鼘?duì)活細(xì)胞的各個(gè)部位作更精細(xì)的研究。如果用白光照明，不同位相表現(xiàn)為各種顏色，轉(zhuǎn)動(dòng)載物臺(tái)，顏色會(huì)發(fā)生變化。單色光照明產(chǎn)生明暗反差，各種成分呈現(xiàn)不同的對(duì)比度。微分干涉差顯微鏡又可以作為一種高度精密的超微量光學(xué)天平來使用，用以估測(cè)的干物體的精確質(zhì)量可以小到1X10－14克。當(dāng)細(xì)胞中所含固體物質(zhì)的濃度增加百分之一時(shí)，其折射率相應(yīng)增加0.0018。細(xì)胞各種成分的折射率可以根據(jù)它與相關(guān)區(qū)域（懸浮液區(qū)）間位相的不同而估計(jì)，從而可進(jìn)一步算出一個(gè)細(xì)胞中某些成分的干燥重量。2023/2/1561微分干涉差顯微鏡的調(diào)節(jié)步驟

1)換上干涉差(DIC)物鏡、干涉差中間鏡筒和干涉差)聚光器。

2)采用柯勒(Kohler)照明。

3)將孔徑光闌開至最大，推出紅色補(bǔ)償板。

4)將聚光器轉(zhuǎn)至“o”擋，把起偏鏡、檢偏鏡推入光路。

5)將40×DIC物鏡轉(zhuǎn)入光路并把標(biāo)本移出視野，將目鏡觀測(cè)旋轉(zhuǎn)器轉(zhuǎn)到“B”位置，用伯氏透鏡對(duì)物鏡孔徑邊緣聚焦。2023/2/15626)松開聚光器的固緊螺絲，輕輕地左、右轉(zhuǎn)動(dòng)聚光器，調(diào)出“十字型”干涉條紋并使其處于最暗的位置。

7)將目鏡觀測(cè)旋轉(zhuǎn)器轉(zhuǎn)回至“O”位，轉(zhuǎn)入相應(yīng)檔干涉差聚光器。

8)觀察及顯微攝影。2023/2/1563●熒光顯微鏡

◆熒光顯微鏡的基本原理

熒光

一般光源是由發(fā)光體質(zhì)點(diǎn)的熱運(yùn)動(dòng)引起的輻射，但熒光是一種冷光源，沒有溫度輻射。熒光可分為光化熒光(由光源激發(fā)而產(chǎn)生的熒光)、生物熒光(生物體發(fā)出的熒光)、化學(xué)熒光(如磷在氧化時(shí)發(fā)出的熒光)和放射熒光(由放射性物質(zhì)激發(fā)而產(chǎn)生的熒光)等多種。

2023/2/1564熒光現(xiàn)象

用光譜中各色區(qū)域的光分別照射熒光物體時(shí)可以發(fā)現(xiàn)，引起熒光最有效的光是近紫外線區(qū)域的紫外光，其波長(zhǎng)約為320—400nm。這種現(xiàn)象的實(shí)質(zhì)是分子吸收了短波光的能量(波長(zhǎng)越短，光能越強(qiáng))，又以發(fā)光的形式以波長(zhǎng)較長(zhǎng)的熒光射出而成為可見光，這就是“熒光現(xiàn)象”。2023/2/1565

熒光現(xiàn)象可分為一次熒光現(xiàn)象和二次熒光現(xiàn)象兩種。一次熒光現(xiàn)象也叫“自發(fā)熒光”或“固有熒光”，它的特點(diǎn)是經(jīng)紫外線照射后可直接發(fā)出熒光。

二次熒光現(xiàn)象又稱“繼發(fā)熒光”，其特點(diǎn)是經(jīng)紫外線照射后不能發(fā)出熒光或只能部分發(fā)生微弱的熒光。被觀察的物體需用熒光染料處理后，經(jīng)紫外線照射才能發(fā)生熒光。2023/2/1566◆熒光顯微鏡的類型

透射式

激發(fā)光來自被檢物的下方。使用暗場(chǎng)聚光器，使激發(fā)光不能進(jìn)入物鏡，但激發(fā)后的熒光能進(jìn)入鏡頭。它在低倍鏡下明亮，高倍鏡下則暗淡。

透射式熒光不適用于觀察非透明被檢物。

2023/2/1567落射式

新型的熒光顯微鏡多為落射式。光源來自被檢物的上方，故對(duì)透明與非透明被檢物都適用。由于物鏡起到了聚光器的作用，它不僅便于操作，而且從低倍到高倍，可以實(shí)現(xiàn)整個(gè)視場(chǎng)的均勻照明。它的缺點(diǎn)是低倍鏡視野較暗，而高倍鏡則視野較亮。

2023/2/1568◆熒光顯微鏡的裝置

主要配件(僅以落射式為例)有：紫外線光源、激發(fā)濾色鏡組、調(diào)中工具及熒光物鏡。

紫外線光源

是專為熒光顯微鏡設(shè)計(jì)的特有光源，它能發(fā)射出波長(zhǎng)為320一400nm的紫外線。在一些多用途、倒置或萬能顯微鏡上多配有熒光顯微鏡裝置，使用時(shí)應(yīng)打開本光源進(jìn)行預(yù)熱，然后才可進(jìn)行正式的調(diào)試及使用。2023/2/1569激發(fā)濾色鏡

為觀察不同性質(zhì)的物體所設(shè)計(jì)的濾色鏡或?yàn)V色鏡組，通?？煞譃樽贤饧ぐl(fā)(U激發(fā))、紫色激發(fā)(V激發(fā))、藍(lán)色激發(fā)(B激發(fā))和綠色激發(fā)(G激發(fā))等四種。

2023/2/1570調(diào)中工具

是專為熒光顯微鏡光源調(diào)中設(shè)計(jì)的備件，使用時(shí)應(yīng)將其裝在物鏡轉(zhuǎn)換器上，“窗口”朝向調(diào)試者，根據(jù)“光點(diǎn)”(圖5—23b)的具體位置進(jìn)行調(diào)整。

2023/2/1571熒光物鏡

顯微鏡上配置的物鏡都力求滿足各種“特殊用途”(相差物鏡除外)鏡檢的需要。但一般來講，專用物鏡總是比通用物鏡的觀察效果好，所以，只要可能的話還是使用專用的熒光物鏡。2023/2/1572◆熒光顯微鏡的調(diào)整方法

1)選擇相應(yīng)的激發(fā)濾色鏡組(如選B激發(fā)鏡組，把激發(fā)鏡組向右推至“B”擋)；將熒光專用物鏡和光源調(diào)中視窗工具安裝在鏡頭轉(zhuǎn)換器上。

2)用明視野顯微鏡法找到標(biāo)本。

3)打開“高壓”電源開關(guān)，穩(wěn)定10分鐘以上，然后再進(jìn)行后續(xù)操作。

4)拉出熒光光路上的擋板并將該光路上的“光闌”開大。2023/2/15735)上下調(diào)節(jié)光源聚焦調(diào)節(jié)桿，使“光點(diǎn)”在調(diào)中視窗中聚焦；再根據(jù)光點(diǎn)的具體位置調(diào)節(jié)燈箱處的“x”或“y’軸，使光點(diǎn)位于視窗的正中央。

6)適當(dāng)縮小光闌，如光闌偏位時(shí)可調(diào)節(jié)光闌處的兩個(gè)調(diào)中旋鈕，使光闌的邊緣在視野的邊緣相切。

7)轉(zhuǎn)入相應(yīng)倍數(shù)的物鏡鏡頭，觀察。

8)進(jìn)行顯微攝影時(shí)，如所拍的標(biāo)本只占畫面的小部分時(shí)，請(qǐng)選用點(diǎn)測(cè)光擋進(jìn)行測(cè)光，然后根據(jù)實(shí)際情況選自動(dòng)擋或手動(dòng)擋進(jìn)行曝光。2023/2/1574◆熒光鏡檢樣品的制作

1)不能采用本身能產(chǎn)生熒光的藥劑。通常使用酒精、甲醛作固定劑效果較好，但該類試劑的固定時(shí)間不宜過長(zhǎng)(甲醛能使組織發(fā)出青綠——青白色熒光；酒精、苯、丙酮等時(shí)間一長(zhǎng)可使熒光物質(zhì)大量溶出；苦味酸本身有固有熒光，不能使用)，用甲醛固定時(shí)以甲醛氣進(jìn)行固定為好。

2)切片標(biāo)本不能太厚，應(yīng)控制在10um左右為好。

3)蛋白粘貼劑不能采用以熒光染料處理過的材料，因?yàn)榈鞍卓杀粺晒馊玖先旧l(fā)生附加熒光。2023/2/15754)因石蠟可產(chǎn)生青色熒光，采用石蠟制片時(shí)，脫蠟必須徹底。切片進(jìn)入水后，應(yīng)充分水洗，再經(jīng)熒光染料處理，用水封固進(jìn)行鏡檢。

5)最好采用螢石玻璃制成的載玻片、蓋玻片。如使用普通玻璃時(shí)，要求色澤潔白，厚度要符合標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)不能有灰塵及有機(jī)物質(zhì)，否則將會(huì)因發(fā)生熒光而干擾正常的鏡檢效果。

6)封片的封固劑可用甘油、甘油膠、糖漿或阿拉伯樹膠。加拿大樹膠因其本身具有青黃色熒光，不宜采用。2023/2/1576◆使用熒光顯微鏡的注意事項(xiàng)

1)長(zhǎng)時(shí)間的激發(fā)光照射標(biāo)本，會(huì)發(fā)生熒光衰減和消失現(xiàn)象，故應(yīng)盡可能縮短照射(觀察)時(shí)間。暫時(shí)不觀察時(shí)，可用擋板遮蓋激發(fā)光源。

2)在油浸觀察時(shí)，應(yīng)采用“無熒光油”，在使用U和V激發(fā)方式觀察時(shí)更應(yīng)注意。香柏油可產(chǎn)生青色熒光。

3)標(biāo)本所發(fā)的熒光較弱，觀察時(shí)應(yīng)盡可能在較暗的室內(nèi)條件下進(jìn)行。使用帶有遮光罩的目鏡時(shí)可將其撥出使用，以防雜光進(jìn)人干擾。2023/2/15774)熒光顯微照相時(shí)，因曝光時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，可采用感光度較快的膠片。

5)避免直視紫外線光源，將紫外線防護(hù)板(黃色)裝在載物臺(tái)前以防紫外線損傷視網(wǎng)膜。

6)電源應(yīng)裝置穩(wěn)壓器，電壓不穩(wěn)會(huì)降低汞燈的使用壽命并影響鏡檢效果。2023/2/1578汞燈光源點(diǎn)亮后至少點(diǎn)燈15分，關(guān)閉后等待3-5分再開。

7)汞燈光源點(diǎn)亮后至少點(diǎn)燈15分，關(guān)閉后等待3-5分再開2023/2/15792023/2/1580

電子顯微鏡

光學(xué)顯微鏡的分辨本領(lǐng)由于所用光波的波長(zhǎng)而受到限制。小于光波波長(zhǎng)的物體因衍射而不能成像。最高級(jí)的光學(xué)顯微鏡的分辨本領(lǐng)的限度約200nm（2000A）。為了突破這一限度，可采用電子射線來代替光波。電子微粒以高速運(yùn)動(dòng)時(shí)，其行為類似光波的傳播過程。運(yùn)動(dòng)電子的波長(zhǎng)隨其速度而定，在增壓達(dá)50萬伏時(shí)，其波長(zhǎng)為0.001nm（0.01A），即電子射線的波長(zhǎng)約為可見光的十萬分之一，其分辨本領(lǐng)的極限約為4A,其放大倍數(shù)比最高級(jí)的光學(xué)顯微鏡要高很多級(jí)。以電子射線為電子光源的顯微鏡稱為電子顯微鏡?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)和生物學(xué)使用的電鏡分辨率為5～10A，即放大率為10～20萬倍。2023/2/1581

由于標(biāo)本厚薄不同，所使用的電鏡類型也有差異。很薄的標(biāo)本可用透射電鏡觀察；厚一點(diǎn)的標(biāo)本可用掃描式電鏡進(jìn)行觀察。

◆透射式電子顯微鏡（TEM）

最常用的電子顯微鏡。由電子槍、電磁透鏡系統(tǒng)、熒光屏（或照相機(jī)）、鏡筒、鏡座、變壓器，穩(wěn)壓裝置、高壓電纜、真空泵系統(tǒng)、操縱臺(tái)等部分組成。

2023/2/1582◆電子槍

相當(dāng)于光學(xué)顯微鏡中的光源，供應(yīng)和加速?gòu)年帢O熱鎢絲發(fā)射出來的電子束。電鏡所用的電壓一般在20～30萬伏，才足以使電子槍里的電子以高速飛出。電子通過聚光透鏡，達(dá)到標(biāo)本上，因?yàn)闃?biāo)本很薄，高速電子可以透過，并且由于標(biāo)本各部分的厚度或密度不同，通過的電子就有疏密之分。圖像的亮度可以通過電子槍來控制。2023/2/1583◆電磁透鏡系統(tǒng)

相當(dāng)于光鏡中的聚光器、物鏡及目鏡系統(tǒng)。電子束通過各個(gè)電磁透鏡的圓形磁場(chǎng)的中心時(shí)可被會(huì)聚而產(chǎn)生圖像。電鏡的透鏡系統(tǒng)由4組電磁透鏡組成，包括聚光透鏡、物鏡、中間透鏡和投射透鏡（目鏡）?？筛淖兙酃馔哥R的電流使電子束對(duì)標(biāo)本聚焦并提供“照明”，使物鏡靠近標(biāo)本的焦點(diǎn)。通過物鏡、中間鏡和投射鏡的三級(jí)放大，能在一定的距離處得到高倍的放大圖像，最終形成的像投射到熒光屏上。改變電磁線圈中的電流量從而使電磁透鏡調(diào)焦，并產(chǎn)生不同的放大率。為了盡量減少電鏡中電子與空氣分子相碰撞而產(chǎn)生散射的機(jī)會(huì)，鏡筒中的真空度要求很高，因此密封的鏡筒與真空泵相連。由于標(biāo)本需置于真空的鏡筒內(nèi)，因此不能檢查活材料。電鏡使用電子射線為光源，電子束的穿透力不強(qiáng)，所以供電鏡檢查的標(biāo)本必須很?。?0～100nm）才能使用。2023/2/1584◆透射電鏡的標(biāo)本制作

電鏡切片的制作步驟與光鏡切片類似，也是由固定、脫水、包埋、切片和染色等程序組成；首先從欲觀察的標(biāo)本上取材，體積1mm3。通過戊二醛和四氧化鋨雙固定后，逐級(jí)酒精(或丙酮)脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片機(jī)切片。在電鏡中圖像的形成是組織片各個(gè)部分對(duì)電子束的電子產(chǎn)生不同散射的結(jié)果，標(biāo)本中致密的地方(細(xì)節(jié))散射強(qiáng)?？墒褂酶鞣N重金屬鹽染色以增加反差，常用的是醋酸鈾和枸櫞酸鉛復(fù)染。由于電子束穿不透玻璃，染好的薄膜切片放在小銅網(wǎng)格上作電鏡觀察。2023/2/1585

冷凍蝕刻技術(shù)是50年代發(fā)明，后來經(jīng)過改進(jìn)的一種新的電鏡標(biāo)本加工技術(shù)。其主要原理是把液氮內(nèi)快速超低溫(—200℃)冷凍的生物標(biāo)本放在真空冷凍裝置里斷裂，從而將不同部位的細(xì)胞器內(nèi)部結(jié)構(gòu)暴露出來，表現(xiàn)出高低不等的三維結(jié)構(gòu)。在新形成的折斷面上噴鍍一層鉑金碳膜(復(fù)型)。將已鍍膜標(biāo)本在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿性腐蝕溶液里消化，復(fù)型膜即漂浮、經(jīng)打撈、清洗，放在小銅網(wǎng)上進(jìn)行電鏡觀察和照相。冷凍蝕刻技術(shù)在細(xì)胞生物膜結(jié)構(gòu)(如細(xì)胞膜、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等)的研究上發(fā)揮了重大作用。2023/2/1586

◆掃描式電子顯微鏡（SEM)

掃描電鏡的電子槍和電磁透鏡的結(jié)構(gòu)原理類似透射電鏡。電子槍產(chǎn)生的大量電子通過三組電磁透鏡的連續(xù)會(huì)聚形成一條很細(xì)的電子射線（電子探針）。這條電子射線在電鏡筒內(nèi)兩對(duì)偏轉(zhuǎn)線圈的作用下，順序在標(biāo)本表面掃描。由于來自鋸齒波發(fā)生器的電流同時(shí)供應(yīng)電鏡鏡筒內(nèi)的和顯示管的兩組偏轉(zhuǎn)線圈，使得顯示器的電子射線在熒光屏上產(chǎn)生同步掃描。從標(biāo)本上射出的電子經(jīng)探測(cè)器收集，被視頻放大器放大并控制顯示管亮度。因此在熒光屏上掃描的亮度被標(biāo)本表面相應(yīng)點(diǎn)所產(chǎn)生的電子數(shù)量所控制，因而在熒光屏上顯示出標(biāo)本的高倍放大圖像。通過控制兩套偏轉(zhuǎn)線圈的電流便可控制放大率的倍數(shù)。2023/2/1587◆掃描電鏡的標(biāo)本制作

掃描電鏡標(biāo)本制作中，既要脫水又要基本保持其自然狀態(tài)，因此使用標(biāo)本的臨界冷凍干燥技術(shù)：將組織表面清洗干凈，經(jīng)戊二醛和四氧化鋨雙重固定，逐級(jí)丙酮脫水。由于乙酸戊酯與液化CO2置換十分容易，因此首先用梯度乙酸戊酯置換丙酮。然后將標(biāo)本放入密閉耐壓室內(nèi)，導(dǎo)人液態(tài)CO2，使之浸沒標(biāo)本。很快CO2將標(biāo)本內(nèi)乙酸戊酯完全置換出來，將后者排出耐壓室。同時(shí)耐壓室內(nèi)的液態(tài)CO2與迅速蒸發(fā)的氣態(tài)CO2分子之間的互變達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。使溫度逐漸上升，液態(tài)CO2蒸發(fā)加快而密度相應(yīng)降低。達(dá)到CO2的臨界溫度3l.l℃時(shí)，氣、液二相密度相同，二相的差異完全消失，即達(dá)到相對(duì)的平衡，此時(shí)表面張力為零。2023/2/1588使溫度繼續(xù)保持在稍高于臨界溫度的條件下，緩慢排出CO2氣體，當(dāng)CO2排盡時(shí)，標(biāo)本即已干燥。取出干燥好的標(biāo)本，經(jīng)真空噴鍍一層碳含金，或放入粒子鍍膜機(jī)內(nèi)鍍鉑和金，以增加標(biāo)本的導(dǎo)電能力，加強(qiáng)反差和增強(qiáng)標(biāo)本的穩(wěn)定性。然后即可進(jìn)行掃描電鏡觀察。

特點(diǎn)：

掃描電鏡具有分辨率高、景深長(zhǎng)、視野廣、顯示三維立體結(jié)構(gòu)、便于觀察和標(biāo)本制備筒單等許多優(yōu)點(diǎn),在生物學(xué)及醫(yī)學(xué)上比較多的用以觀察和研究生物標(biāo)本的表面形態(tài)和內(nèi)部立體結(jié)構(gòu)?？梢灾苯佑闷鋪碛^察DNA的分子結(jié)構(gòu)。2023/2/1589

掃描探針顯微鏡

掃描探針顯微鏡是掃描隧道顯微鏡、原子力顯微鏡、近場(chǎng)光學(xué)顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡等，近幾年發(fā)展起來的新型顯微鏡的總稱。掃描探針顯微鏡的發(fā)展使得在納米尺度上研究物質(zhì)的特性和相互作用成為可能,它為生物、醫(yī)學(xué)等傳統(tǒng)學(xué)科提供了一個(gè)嶄新的研究工具。

2023/2/1590

激光共聚焦顯微鏡

激光共聚焦顯微鏡是80年代發(fā)展起來的一項(xiàng)劃時(shí)代意義的高科技新產(chǎn)品,它是在熒光顯微鏡成像基礎(chǔ)上加裝了激光掃描裝置,利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖象處理,使用紫外光或可見光激發(fā)熒光探針,從而得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖象,在亞細(xì)胞水平上觀察諸如Ca2+、pH值,膜電位等生理信號(hào)及細(xì)胞形態(tài)的變化，成為形態(tài)學(xué)、分子細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、藥理學(xué)、遺傳學(xué)等領(lǐng)域中新一代強(qiáng)有力的研究工具。2023/2/1591◆基本結(jié)構(gòu)

激光光源、掃描裝置、監(jiān)測(cè)器、高性能的計(jì)算機(jī)及相應(yīng)的應(yīng)用軟件。

2023/2/1592◆基本原理

傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡使用的是場(chǎng)光源,

標(biāo)本上每一點(diǎn)的圖象都會(huì)受到鄰近點(diǎn)的

衍射光或散射光的干擾。而激光共聚焦

顯微鏡采用點(diǎn)光源照射標(biāo)本,在焦平面上

形成了一個(gè)輪廓分明的小的光點(diǎn),該點(diǎn)被

照射后發(fā)出的熒光被物鏡收集,直接送到

探測(cè)器。光源和探測(cè)器前方都各有一個(gè)針

孔,分別稱為照明針孔和探測(cè)針孔,約0.1

～0.2um。二者是共軛的,即：光點(diǎn)通過一

系列的透鏡最終可同時(shí)聚焦于照明針孔

和探測(cè)針孔。2023/2/1593這樣,來自焦平面的光,可以會(huì)聚在探測(cè)針孔范圍之內(nèi),而其它來自焦平面上方或下方的散射光,都被擋在探測(cè)針孔之外而不能成象。以激光逐點(diǎn)掃描樣品,探測(cè)針孔后的光電倍增管將所得到的信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)閿?shù)字信息傳輸至計(jì)算機(jī),最終在屏幕上聚合成清晰的整個(gè)焦平面的共聚焦圖像。

每一幅焦平面圖像實(shí)際上是標(biāo)本的光學(xué)橫斷面,這個(gè)光學(xué)橫斷面總是有一定厚度的,又稱之為光學(xué)薄片。在共聚焦顯微鏡的載物臺(tái)上有一個(gè)微量步進(jìn)馬達(dá),可使載物臺(tái)上下步進(jìn)移動(dòng),（最小步進(jìn)距離為0.1μm）,能使細(xì)胞或組織各個(gè)橫斷面的圖象都能清楚地顯示,實(shí)現(xiàn)了“光學(xué)切片”的目的,這就是“細(xì)胞CT”名稱的由來。2023/2/1594

共聚焦顯微鏡生物學(xué)應(yīng)用

◆定量熒光測(cè)量

◆定量共聚焦圖像分析

◆三維重組分析生物結(jié)構(gòu)

◆動(dòng)態(tài)熒光測(cè)定

◆活細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)參數(shù)（熒光光漂白恢復(fù)FRAP）

◆胞間通訊研究

◆籠鎖—解籠鎖測(cè)定

◆粘附細(xì)胞分選

◆細(xì)胞激光顯微外科及光陷阱技術(shù)2023/2/15951、定量熒光測(cè)量

ACAS可進(jìn)行重復(fù)性極佳的熒光探測(cè)及活細(xì)胞熒光定量分析。利用這一功能既可對(duì)單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞群的溶酶體、線粒體、DNA、RNA和受體分子的含量、成份及分布進(jìn)行定性及定量測(cè)定,還可測(cè)定諸如膜電位和配體結(jié)合等生化反應(yīng)程度。此外,還適用于高靈敏度快速的免疫熒光測(cè)定,這種定量測(cè)定可以準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)抗原表達(dá)、細(xì)胞結(jié)合和殺傷及定量的形態(tài)學(xué)特性,以揭示諸如腫瘤相關(guān)抗原表達(dá)