堿性磷酸酶比活力測(cè)定

堿性磷酸酶比活力的測(cè)定1.學(xué)習(xí)分光光度法測(cè)定的原理和方法2.掌握堿性磷酸酶比活測(cè)定的方法一、目的要求二、原理（一）、比色分析法光的互補(bǔ)示意圖1.物質(zhì)的顏色和波長(zhǎng)：可見(jiàn)光：波長(zhǎng)（λ）400—760nm紫外光：λ小于400nm紅外光：λ大于760nm2.溶液的顏色和光吸收的關(guān)系：溶液的顏色，是由于不同的有色物質(zhì)有選擇地吸收某種顏色的光而引起的。溶液呈現(xiàn)的顏色是與它主要吸收的光相互補(bǔ)的光的顏色。溶液吸收的光越多，呈現(xiàn)的顏色越深。3.物質(zhì)濃度，液層厚度與光吸收的關(guān)系（Lambert--Beer定律）：當(dāng)一束單色光通過(guò)溶液后，光被溶液吸收的程度（D）與溶液的濃度（C），液層的厚（L）以及入射光的強(qiáng)度（I0）有關(guān)。溶液濃度越大，液層越厚，吸光越多，這就是物質(zhì)（均勻透明固體，液體，氣體）對(duì)光的吸收定律。4.待測(cè)溶液濃度的計(jì)算：（1）標(biāo)準(zhǔn)管法：在同樣條件下，測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)液和待測(cè)液的光密度（D）值，然后計(jì)算：C未知=（D未知/D標(biāo)準(zhǔn)）×C標(biāo)準(zhǔn)（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法：分析大批待測(cè)樣品時(shí)，采用此法較方便。先配制一系列濃度由小到大的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)出它們的光密度（D）值。在一定濃度范圍內(nèi)，溶液濃度（C）與其光密度（D）之間呈直線(xiàn)關(guān)系。以各管D為縱坐標(biāo)，C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。待測(cè)溶液D值測(cè)出后，在曲線(xiàn)上查出C。1%濃度，1cm厚度溶液中測(cè)得：K=E1cm1%或１克分子濃度，１cm厚度溶液中測(cè)得：K=ξC=D/E1cm%,或C=D/ξ常用于紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)，核酸含量，二者分別在280nm和260nm處有最大吸收，其消光系數(shù)可查到，在同樣條件下，測(cè)定待測(cè)溶液的光密度,帶入上式即可求得C。（3）消光系數(shù)法：（二）、酶活力在37C下，以5mmol/LpNPP為底物，在pH10.1的碳酸鹽緩沖液含2mmol/LMg2+的測(cè)活體系中每分鐘催化產(chǎn)生1mol/LpNP的酶量定為1個(gè)酶活力單位。酶的比活力定義為每mg蛋白所具有的酶活力單位數(shù)。酶活性測(cè)定前處理1、2號(hào)樣品稀釋50倍（用洗脫液稀釋?zhuān)?號(hào)樣品稀釋20倍（用洗脫液稀釋?zhuān)?號(hào)樣品不稀釋?zhuān)ㄓ孟疵撘合♂專(zhuān)┑鞍诐舛葴y(cè)定前處理1、2號(hào)樣品稀釋100倍（用洗脫液稀釋?zhuān)?號(hào)樣品稀釋20倍（用洗脫液稀釋?zhuān)?號(hào)樣品對(duì)倍稀釋?zhuān)ㄓ孟疵撘合♂專(zhuān)?2支試管，1-4做兩組平行測(cè)定管，01-04作為空白對(duì)照管號(hào)空白（01-04）1-12-23-34-45mMpNPP(mL)各0.2mL

Na2CO3-NaHCO3(mL)各管加入1.0mL20mmol/LMgCl2(mL)各管加入0.2mL

H2O(mL)各0.50mL混勻，37℃，5分鐘酶液（mL）/各0.1mL37℃，精確反應(yīng)10分鐘0.1mol/LNaOH(mL)各管加入2.0mL酶液（mL）0.1mL

OD405nm蛋白濃度測(cè)定1.測(cè)定100μg/mL牛血清白蛋白溶液的OD值；2.將稀釋后的樣品在280nm下測(cè)定吸光度；3.以洗脫液作空白。蛋白濃度按下式計(jì)算：數(shù)據(jù)處理單位時(shí)間0.1mL酶液催化產(chǎn)物量計(jì)算：克分子消光系數(shù)法即C未知＝OD/(8.8103)

計(jì)算：式中：A為稀釋倍數(shù)，B為由消光系數(shù)法計(jì)算得的pNPmol數(shù)，t為反應(yīng)時(shí)間，C為測(cè)得的蛋白mg數(shù)，V1為測(cè)定酶活力所用的酶量(mL數(shù))V2為測(cè)定酶活力所用的酶量(mL數(shù))酶的比活力（U/mg）＝酶活力(U/mL)/

蛋白濃度(mg/mL)純化倍