專題PCR引物設(shè)計(jì)-備戰(zhàn)高考生物重難點(diǎn)專題精講課件

PCR引物設(shè)計(jì)PCR引物設(shè)計(jì)PCR的核心考點(diǎn):

引物設(shè)計(jì);1.PCR引物設(shè)計(jì)：方向引物序列和目的基因的關(guān)系？引物的5′端與模板鏈3′端互補(bǔ)配對(duì)（記得寫方向）針對(duì)訓(xùn)練針對(duì)訓(xùn)練在核酸分子雜交技術(shù)中,常常使用已知序列的單鏈核酸片段作為探針。為了獲得B鏈作探針(如圖),可應(yīng)用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增,應(yīng)選擇的引物種類是()A.引物1與引物2 B.引物3與引物4C.引物2與引物3 D.引物1與引物4C針對(duì)訓(xùn)練：擴(kuò)增載體序列拓展思考如果進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，引物應(yīng)該如何設(shè)計(jì)？1.PCR引物設(shè)計(jì)：位置【答案】乙丙目的基因反向連接引物序列限制酶識(shí)別序列1.PCR引物設(shè)計(jì)：限制酶修飾拓展思考為什么限制酶識(shí)別序列一定要添加在引物的5’？PCR擴(kuò)增的時(shí)候，至少要幾個(gè)循環(huán)才能出現(xiàn)目的基因等長度的擴(kuò)增片段？如果要給目的基因添加啟動(dòng)子，應(yīng)該如何設(shè)計(jì)引物？三輪PCR出真理用PCR技術(shù)將DNA分子中的A1片段進(jìn)行擴(kuò)增，設(shè)計(jì)了引物Ⅰ、Ⅱ，其連接部位如下圖所示，X為某限制酶識(shí)別序列。擴(kuò)增得到的絕大部分DNA片段是圖A-D中的（）

D

針對(duì)訓(xùn)練PCR過程中,如果用的是長模板，一般要經(jīng)過幾輪循環(huán),才能得到完整的目的基因?針對(duì)訓(xùn)練綠-269-3T1.PCR引物設(shè)計(jì)：保護(hù)堿基思考-1：要正常表達(dá)出融合蛋白，還需要如何處理？答案：需要把中間的終止密碼子對(duì)應(yīng)的DNA序列刪除掉。思考2:為什么目的基因能和載體上的EGFP基因能連接在一起？答案：因?yàn)槎咄ㄟ^有限制酶切割后產(chǎn)生了相同的黏性末端。思考3:經(jīng)過DNA連接酶連接后，這段限制酶識(shí)別序列位于就位于目的基因和EGFP基因之間。如果限制酶識(shí)別序列是SmaⅠ：CCC↓GGG。這段序列堿基個(gè)數(shù)是3的倍數(shù)，所以不會(huì)導(dǎo)致后續(xù)的EGFP基因轉(zhuǎn)錄的時(shí)候發(fā)生移碼突變；如果限制酶識(shí)別序列是Sau3AⅠ：↓GATC。。這段序列堿基個(gè)數(shù)不是3的倍數(shù)，就會(huì)導(dǎo)致后續(xù)的EGFP基因轉(zhuǎn)錄的時(shí)候發(fā)生移碼突變；思考4:如果Sau3AI，那后續(xù)EGFP基因的編碼序列是移碼突變的，會(huì)亂碼。如何解決這個(gè)問題?答案：需要在限制酶識(shí)別序列一端加上兩個(gè)堿基？拓展思考：兩個(gè)融合基因之間的限制酶序列兩個(gè)基因之間酶切位點(diǎn)：SmaⅠ：CCC↓GGGSau3AⅠ：↓GATC拓展思考：兩個(gè)融合基因之間的限制酶序列①SmaⅠ：CCC↓GGG，酶切位點(diǎn)不引起移碼突變。；②Sau3AⅠ：↓GATC，酶切位點(diǎn)引起移碼突變。需要在酶切位點(diǎn)后添加2個(gè)堿基；思考5:如果中間的限制酶識(shí)別序列是5個(gè)堿基長度呢？答案：需要在限制酶識(shí)別序列一端加上一個(gè)堿基。思考6:如何加上這兩個(gè)堿基呢？答案：需要在設(shè)計(jì)引物的時(shí)候在引物的限制酶識(shí)別序列一端添加這兩個(gè)保護(hù)堿基。PCR擴(kuò)增得到的P基因經(jīng)酶切連接插入載體后，與編碼FLAG的序列形成一個(gè)融合基因，如圖甲所示，其中“ATGTGCA”為P基因編碼鏈起始序列。將該重組載體導(dǎo)入細(xì)胞后，融合基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA序列正確，翻譯出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正確，但P基因?qū)?yīng)的氨基酸序列與P不同。據(jù)圖甲分析，出現(xiàn)該問題的原因是______。修改擴(kuò)增P基因時(shí)使用的帶有EcoRⅠ識(shí)別序列的引物來解決該問題，具體修改方案是______。1.PCR引物設(shè)計(jì)：保護(hù)堿基（3）融合蛋白表達(dá)成功后，將FLAG-P、FLAG-P△、藥物A和UBC按照?qǐng)D乙中的組合方式分成5組。各組樣品混勻后分別流經(jīng)含F(xiàn)LAG抗體的介質(zhì)，分離出與介質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)并用UBC抗體檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③組結(jié)果的差異推測(cè)，藥物A的作用是______；由②④組或③⑤組的差異推測(cè)，P△中缺失的特定序列的作用是______。（4）根據(jù)以上結(jié)果推測(cè)，藥物A治療該病的機(jī)理是______。答案（3）①促進(jìn)UBC與FLAG-P的結(jié)合

②P△中缺失的特定序列是與UBC結(jié)合的關(guān)鍵序列（4）藥物A促進(jìn)UBC與FLAG-P的結(jié)合，從而促進(jìn)蛋白P被蛋白酶識(shí)別并降解，達(dá)到治療的目1.PCR引物設(shè)計(jì)：保護(hù)堿基和kozak序列1.PCR引物設(shè)計(jì)：融合基因某種熒光蛋白（GFP）在紫外光或藍(lán)光激發(fā)下會(huì)發(fā)出綠色熒光，這一特性可用于檢測(cè)細(xì)胞中目的基因的表達(dá)。某科研團(tuán)隊(duì)將某種病毒的外殼蛋白（L1）基因連接在GFP基因的5′末端，獲得了L1-GFP融合基因（簡稱為甲），并將其插入質(zhì)粒P0，構(gòu)建了真核表達(dá)載體P1，其部分結(jié)構(gòu)和酶切位點(diǎn)的示意圖如下，圖中E1~E4四種限制酶產(chǎn)生的黏性末端各不相同。（1）據(jù)圖推斷，該團(tuán)隊(duì)在將甲插入質(zhì)粒P0時(shí)，使用了兩種限制酶，這兩