酶制劑的生產(chǎn)

酶制劑的生產(chǎn)第一頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日主要內(nèi)容2.1國(guó)內(nèi)外酶制劑工業(yè)生產(chǎn)及應(yīng)用現(xiàn)狀2.2酶的發(fā)酵技術(shù)2.3酶的分離純化2.4酶的劑型與保存第二頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日2.1國(guó)內(nèi)外酶制劑工業(yè)生產(chǎn)及應(yīng)用現(xiàn)狀第三頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日．新技術(shù)在生產(chǎn)中的應(yīng)用三種方法：組織提取：木瓜蛋白酶、凝乳蛋白酶微生物發(fā)酵：最大量的來(lái)源化學(xué)及生物合成：生物重組高新技術(shù)的應(yīng)用：酶的修飾、固定化、基因重組、膜分離技術(shù)、冷凍干燥第四頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日2.1.2.集中壟斷，市場(chǎng)全球化：規(guī)模企業(yè)由20世紀(jì)80年代初的80多家減少至20多家，占市場(chǎng)90%丹麥諾維信novozymes→1978年進(jìn)入中國(guó)（天津）；美國(guó)杰能科公司（Genencor）→98年進(jìn)入中國(guó)，與無(wú)錫合資，控股80%（無(wú)錫，2005年杰能科國(guó)際公司被丹尼斯克公司收購(gòu)）；第五頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日2.1.3.品種、規(guī)模不斷擴(kuò)大目前30多家600多個(gè)品種，應(yīng)用于18個(gè)工業(yè)領(lǐng)域。我國(guó)2000年酶制劑產(chǎn)量為30萬(wàn)噸，100家，市場(chǎng)份額僅占5%，以未經(jīng)除菌去渣的粗制品粉狀酶為主。國(guó)際以液體、顆粒為主。國(guó)內(nèi)糖化酶、ａ-淀粉酶、蛋白酶三大類占了97%我國(guó)有7家上市公司介入酶制劑開(kāi)發(fā)生產(chǎn)。第六頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日2.1.4.應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大：美國(guó)酶制劑年產(chǎn)值6.25億美元，食品工業(yè)占62%，拓展飼料工業(yè)、洗滌劑工業(yè)、化學(xué)工業(yè)。第七頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日2.2酶的發(fā)酵技術(shù)第八頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日2.2酶的發(fā)酵技術(shù)利用微生物產(chǎn)酶的優(yōu)點(diǎn)是：(1)微生物種類多、酶種豐富，且菌株易誘變，菌種多樣。(2)微生物生長(zhǎng)繁殖快，易提取酶，特別是胞外酶。(3)微生物培養(yǎng)基來(lái)源廣泛、價(jià)格便宜。(4)可以采用微電腦等新技術(shù)，控制酶發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程，生產(chǎn)可連續(xù)化、自動(dòng)化，經(jīng)濟(jì)效益高。(5)可以利用以基因工程為主的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，選育菌種、增加酶產(chǎn)率和開(kāi)發(fā)新酶種。因此，下面將主要介紹微生物發(fā)酵法產(chǎn)酶的一般原理和工藝。第九頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日2.2.1產(chǎn)酶微生物菌種是發(fā)酵生產(chǎn)酶的重要條件。菌種不僅與產(chǎn)酶種類、產(chǎn)量密切相關(guān)，而且與發(fā)酵條件、工藝等關(guān)系密切。已經(jīng)在自然界中發(fā)現(xiàn)的酶有數(shù)千種，目前投入工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)的酶約有50～60種。它們的生產(chǎn)菌種十分廣泛，包括細(xì)菌、放線菌、酵母菌、霉菌。第十頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日第二章酶的發(fā)酵生產(chǎn)酶源酶可由動(dòng)物（如胰蛋白酶、胃蛋白酶）、植物（如木瓜蛋白酶）和微生物（細(xì)菌、霉菌、酵母）產(chǎn)生，其中工業(yè)酶制劑大多數(shù)由微生物發(fā)酵法生產(chǎn)。由于微生物世代時(shí)間短，繁殖快、容易培養(yǎng)和管理，可大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，所以工業(yè)酶制劑大多由微生物發(fā)酵產(chǎn)生。第十一頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日產(chǎn)酶微生物的獲得（1）從有關(guān)菌種保藏機(jī)構(gòu)購(gòu)買(mǎi)如中國(guó)科學(xué)院微生物研究所CGMCC，日本大阪發(fā)酵研究所IFOATCC(AmericanTypeCultureCollection)DSMZ(GermanCollectionofMicroorganismsandCellCultures)JCM(JapanCollectionofMicroorganisms)VKM(All-RussianCollectionofMicroorganisms)第十二頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日產(chǎn)酶微生物的獲得CBS(CentraalbureauvoorSchimmelcultures荷蘭真菌中心收藏所)UKNCC(UnitedKingdomNationalCultureCollection)NCIMB(NationalCollectionsofIndustrial,foodandMarineBacteria)第十三頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日（2）從自然界中分離篩選從與產(chǎn)生目的酶菌種可能相適應(yīng)的生態(tài)環(huán)境中，采樣分離篩選。1克土壤中含有1×108個(gè)微生物，自然界蘊(yùn)藏著巨大的微生物資源。同時(shí)重視微生物資源、基因文庫(kù)、基因表達(dá)載體等方面的建設(shè)，以及極端環(huán)境微生物，不可分離微生物，絕對(duì)厭氧微生物等新的種質(zhì)資源的研究開(kāi)發(fā)。第十四頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日從極端環(huán)境微生物和不可培養(yǎng)微生物篩選

新酶種嗜熱微生物（Thermophiles60-85℃，超嗜熱菌生長(zhǎng)溫度85℃以上,105℃）。嗜冷微生物（Psychrophiles-10～0℃

）嗜鹽微生物(Halophiles,含鹽32%或5.2%)嗜酸微生物(Acidophiles,pH2.5)嗜堿微生物(Alkalophiles,pH11)嗜壓微生物(Barophiles，1.01×105KPa,4×107KPa)第十五頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日不可培養(yǎng)微生物用PCR技術(shù)從土樣中直接擴(kuò)增DNA，能夠從不可培養(yǎng)的微生物中分離到DNA，并用作克隆來(lái)源，可獲得更多種類的酶。第十六頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日鏈霉菌（Streptomyces）鏈霉菌是一種放線菌。菌落呈放射狀，有分枝菌絲體，菌絲直徑μm，G+。菌絲有氣生菌絲和基內(nèi)菌絲之分，基內(nèi)菌絲不斷裂，氣生菌絲形成孢子鏈?？僧a(chǎn)生葡萄糖異構(gòu)酶，纖維素酶，堿性蛋白酶，中性蛋白酶，幾丁質(zhì)酶，青霉素?；傅?。第十七頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日放線菌的形態(tài)放線菌的菌落第十八頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日霉菌黑曲霉（Aspergillusniger）米曲霉（Aspergillusoryzae）青霉（Penicillium）木霉（Trichoderma）根霉（Rhizopus）毛霉（Mucor）紅曲霉（Monascus）第十九頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日根霉的形態(tài)各種曲霉的菌落第二十頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日細(xì)菌大腸桿菌（Escherichiacoli）芽孢桿菌（Bacillus）枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis

）蛋白酶地衣芽孢桿菌（BacillusLicheniformis）高溫α-淀粉酶第二十一頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日桿菌紅弧菌桿菌紅弧菌第二十二頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日酵母菌啤酒酵母（Saccharomycescerevisiae）可產(chǎn)丙酮酸脫羧酶，醇脫氫酶等。第二十三頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日酵母的形態(tài)紅酵母的菌落第二十四頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日產(chǎn)酶微生物的分離篩選方法（1）

平板分離（選擇性分離篩選平板）（2）

搖瓶逐個(gè)檢測(cè)方法培養(yǎng)基細(xì)菌：營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基（pH7.0，30-37℃）霉菌：可用察氏、土豆（PDA）、麥汁瓊脂培養(yǎng)基（pH5.5，25~20℃，為了防止霉菌菌落蔓延連成一片，可加入0.1%去氧膽酸鈉、0.1%山梨糖等限制菌落擴(kuò)散）放線菌：高氏培養(yǎng)基、甘油精氨酸培養(yǎng)基等，pH6.8~7.0第二十五頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日

酵母：用麥汁瓊脂培養(yǎng)基（pH4.5~5.5）為了提高菌種分離效率，分離培養(yǎng)基中可添加一定數(shù)量的藥劑以抑制干擾微生物的生長(zhǎng)。如為了抑制霉菌的生長(zhǎng)，可加入30~50U/ml

制霉菌素、克念霉素、殺霉素等多烯類抗生素，不妨礙細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。為了抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，可添加青霉素（30U/ml）、四環(huán)素、猛加拉紅（0.001%），不干擾霉菌的生長(zhǎng)。為了抑制酵母的生長(zhǎng)，可添加放線菌酮（50mg/ml），不影響細(xì)菌的生長(zhǎng)。選擇性培養(yǎng)基第二十六頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日選擇性培養(yǎng)基用酸性或堿性培養(yǎng)基，可分離耐酸、耐堿微生物；用添加了高濃度食鹽培養(yǎng)基，可分離耐鹽微生物；用添加了高濃度鹽或蔗糖的培養(yǎng)基，可分離耐高滲透壓的微生物；在高溫下培養(yǎng)，可篩選耐熱、耐高溫微生物，分離芽孢桿菌，可先將樣品于80℃加熱10-15min，可殺死不產(chǎn)芽孢微生物后，再進(jìn)行分離。第二十七頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日

為了提高工作效率，可設(shè)計(jì)一些肉眼可檢測(cè)的方法，如水解透明圈、變色圈等方法，鑒別出產(chǎn)酶菌落。

第二十八頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日

酶培養(yǎng)基中的底物檢測(cè)方法

α-淀粉酶0.1%~0.5%可溶性淀粉平板澆注稀碘液，可在蘭色背景顯示出明亮的水解圈蛋白酶干酪素透明圈果膠酶果膠平板澆注1%溴化十六烷基三甲銨，未水解的果膠沉淀而形成白色背景產(chǎn)生果膠酶的菌落周圍出現(xiàn)透明的水解圈乳糖酶向長(zhǎng)菌落的平板培養(yǎng)基上噴灑鄰硝基苯β-D-半乳糖（ONPG），由于乳糖酶可分解ONPG而游離出黃色鄰硝基苯，檢出產(chǎn)酶菌。普魯蘭酶0.3%普魯蘭糖培養(yǎng)后澆注乙醇，產(chǎn)酶菌株可產(chǎn)生水解圈纖維素酶0.5%磷酸膨化纖維產(chǎn)酶菌落周圍形成水解圈第二十九頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日免疫學(xué)檢測(cè)方法酶聯(lián)免疫熒光測(cè)定技術(shù)，96孔第三十頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日2.2.2酶的發(fā)酵技術(shù)2.2.2.1培養(yǎng)基培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分是微生物發(fā)酵產(chǎn)酶的原料，主要是碳源、氮源，其次是無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子和產(chǎn)酶促進(jìn)劑等。第三十一頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日（1）碳源碳素是構(gòu)成菌體成分的主要元素，也是細(xì)胞貯藏物質(zhì)和生產(chǎn)各種代謝產(chǎn)物的骨架，還是菌體生命活動(dòng)的能量的主要來(lái)源。當(dāng)前酶制劑生產(chǎn)上使用的菌種大都只利用有機(jī)碳的異養(yǎng)型微生物。有機(jī)碳的主要來(lái)源有：一是農(nóng)副產(chǎn)品中如甘薯、麩皮、玉米、米糠等淀粉質(zhì)原料；二是野生的如土茯苓、橡子、石蒜等淀粉質(zhì)原料。此外，以石油產(chǎn)品中12～16碳的成分來(lái)作碳源，如以某些嗜石油微生物生產(chǎn)蛋白酶、脂酶，均已獲得成功。第三十二頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日不同的細(xì)胞對(duì)各種碳源的利用差異很大，所以在配制培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)根據(jù)不同細(xì)胞的不同要求而選擇合適的碳源。另外，選擇碳源除考慮營(yíng)養(yǎng)要求外，還要考慮酶生物合成的誘導(dǎo)作用和是否存在分解代謝物阻遏作用。盡量選用具有誘導(dǎo)作用的碳源，盡量不用或少用有分解代謝物阻遏作用的碳源。例如，α－淀粉酶的發(fā)酵生產(chǎn)中，應(yīng)該選用有誘導(dǎo)作用的淀粉作為碳源，而不用對(duì)該酶有分解代謝物阻遏作用的果糖作為碳源。第三十三頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日（2）氮源氮是生物體內(nèi)各種含氮物質(zhì)，如氨基酸、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等的組成成分。酶制劑生產(chǎn)中的氮源主要有有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源兩種，常用的有機(jī)氮源有：豆餅、花生餅、菜籽餅、魚(yú)粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、多肽、氨基酸等；無(wú)機(jī)氮源有：(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3、(NH4)3P04、尿素等。第三十四頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日不同的細(xì)胞對(duì)各種氮源的要求各不相同，應(yīng)根據(jù)要求進(jìn)行選擇和配制。一般來(lái)說(shuō)，動(dòng)物細(xì)胞要求有機(jī)氮，植物細(xì)胞主要要求無(wú)機(jī)氮。多數(shù)情況下將有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源配合使用才能取得較好的效果。例如黑曲霉酸性蛋白酶生產(chǎn)，只用銨鹽或硝酸鹽為氮源時(shí)，酶產(chǎn)量?jī)H為有胨時(shí)的30%。只用有機(jī)氮源而不用無(wú)機(jī)氮源時(shí)產(chǎn)量也低，故一般除使用高濃度有機(jī)氮源外尚需添加1%~3%的無(wú)機(jī)氮源。第三十五頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日（3）碳氮比在微生物酶生產(chǎn)培養(yǎng)基中碳源與氮源的比例是隨生產(chǎn)的酶類、生產(chǎn)菌株的性質(zhì)和培養(yǎng)階段的不同而改變的。一般蛋白酶(包括酸性、中性和堿性蛋白酶)生產(chǎn)采用碳氮比低的培養(yǎng)基比較有利，例如黑曲霉3.350酸性蛋白酶生產(chǎn)采用由豆餅粉3.75%、玉米粉0.625%、魚(yú)粉0.625%。NH4Cl1%、CaCl20.5%、Na2HP040.2%、豆餅石灰水解液10%組成的培養(yǎng)基；第三十六頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日淀粉酶(包括α－淀粉酶、糖化酶、β－淀粉酶等)生產(chǎn)的碳氮比一般比蛋白酶生產(chǎn)略高，例如枯草桿菌TUD127α－淀粉酶生產(chǎn)采用由豆餅粉4%、玉米粉8%、Na2HP040.8%、(NH4)2SO40.4%、CaCl20.2%組成的培養(yǎng)基。而在淀粉酶生產(chǎn)中糖化酶生產(chǎn)培養(yǎng)基的碳氮比是最高的。以上是蛋白酶和淀粉酶生產(chǎn)培養(yǎng)基碳氮比的一般規(guī)律，但是由于菌種很多而其性質(zhì)各異。很難說(shuō)都是符合上述規(guī)律的。第三十七頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日（4）無(wú)機(jī)鹽微生物酶生產(chǎn)和其他微生物產(chǎn)品生產(chǎn)一樣，培養(yǎng)基中需要有磷酸鹽及硫、鉀、鈉、鈣、鎂等元素存在。在酶生產(chǎn)中常以磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀等磷酸鹽作為磷源，以硫酸鎂為硫源和鎂源。鈣離子對(duì)淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等多種酶的活性有十分重要的穩(wěn)定作用，例如在無(wú)Ca2+存在時(shí)灰色鏈霉菌中性蛋白酶只在pH7~7.5很小范圍內(nèi)穩(wěn)定，當(dāng)有Ca2+存在時(shí)穩(wěn)定pH范圍可以擴(kuò)大到5～7。第三十八頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日（4）無(wú)機(jī)鹽鈉離子有控制細(xì)胞滲透壓使酶產(chǎn)量增加的作用，酶生產(chǎn)的培養(yǎng)基中有時(shí)以磷酸氫二鈉及硝酸鈉等形式加入，例如米曲霉α－淀粉酶生產(chǎn)，添加適量的硝酸鈉以促進(jìn)酶生產(chǎn)。在天然培養(yǎng)基中，一般微量元素不必另外加入，但也有一些例外。如玉米粉、豆粉為碳源時(shí)，添加100ppmCo2+和Zn2+，放線菌166蛋白酶活力可增加70%～80%。第三十九頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日（5）生長(zhǎng)因子微生物還需一些微量的像維生素一類的物質(zhì)，才能正常生長(zhǎng)發(fā)育，這類物質(zhì)統(tǒng)稱生長(zhǎng)因子(或生長(zhǎng)素)。其中包括某些氨基酸、維生素、嘌呤或嘧啶等。酶制劑生產(chǎn)中所需的生長(zhǎng)因子，大多是由天然原料提供，如玉米漿、麥芽汁、豆芽汁、酵母膏、麩皮、米糠等。玉米漿中一般含有生長(zhǎng)素32~128mg/mL。第四十頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日（6）產(chǎn)酶促進(jìn)劑產(chǎn)酶促進(jìn)劑是指在培養(yǎng)基中添加某種少量物質(zhì)，能顯著提高酶的產(chǎn)率，這類物質(zhì)稱為產(chǎn)酶促進(jìn)劑。產(chǎn)酶促進(jìn)劑大體上分為兩種：一是誘導(dǎo)物，二是表面活性劑。表面活性劑，如吐溫－80的濃度為0.1%時(shí)能增加許多酶的產(chǎn)量。表面活性劑能增加細(xì)胞的通透性，處在氣－液界面改善了氧的傳遞速度，還可以保護(hù)酶的活性。第四十一頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日（6）產(chǎn)酶促進(jìn)劑生產(chǎn)上常采用非離子型表面活性劑，如聚乙二醇、聚乙烯醇衍生物、植酸類、焦糖、羧甲基纖維素、苯乙醇等。離子型的表面活性劑對(duì)微生物有害。用于食品、醫(yī)藥的酶的生產(chǎn)中所用的表面活性劑還須對(duì)人、畜無(wú)害。此外各種產(chǎn)酶促進(jìn)劑的效果還受到菌種，種齡、培養(yǎng)基組成的影響。第四十二頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日培養(yǎng)基優(yōu)化單因子試驗(yàn)正交實(shí)驗(yàn)Plackett-Burman試驗(yàn)最陡爬坡試驗(yàn)響應(yīng)面分析試驗(yàn)第四十三頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日發(fā)酵罐結(jié)構(gòu)示意圖第四十四頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日2.2.2.3液體深層發(fā)酵的工藝控制酶的發(fā)酵生產(chǎn)中發(fā)酵效果除了受到菌種產(chǎn)酶性能的影響外，還受到發(fā)酵溫度、pH、溶氧量等條件的影響。(1)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響發(fā)酵溫度的變化主要隨著微生物代謝反應(yīng)、發(fā)酵中通風(fēng)、攪拌速度的變化而變化的。微生物在生長(zhǎng)發(fā)育中，不斷地吸收培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分來(lái)合成菌體的細(xì)胞物質(zhì)和酶時(shí)的生化反應(yīng)都是吸熱反應(yīng)；培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被大量分解時(shí)的生化反應(yīng)都是放熱反應(yīng)。第四十五頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日2.2.2.3液體深層發(fā)酵的工藝控制發(fā)酵初期合成反應(yīng)吸收的熱量大于分解反應(yīng)放出的熱量，發(fā)酵液需要升溫。當(dāng)菌體繁殖旺盛時(shí)，情況則相反，發(fā)酵液溫度就自行上升，加上通風(fēng)攪拌所帶來(lái)的熱量，這時(shí)，發(fā)酵液必須降溫，以保持微生物生長(zhǎng)繁殖和產(chǎn)酶所需的適宜溫度。第四十六頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日微生物生長(zhǎng)繁殖和產(chǎn)酶的最適溫度隨著菌種和酶的性質(zhì)不同而異，生長(zhǎng)繁殖和產(chǎn)酶的最適溫度往往不一致。一般細(xì)菌為37℃，霉菌和放線菌為28～30℃，一些嗜熱微生物需在40~50℃下生長(zhǎng)繁殖，如紅曲霉生長(zhǎng)溫度35~37℃，而生產(chǎn)糖化酶的最適溫度為37～40℃。在酶生產(chǎn)中，為了有利于菌體生長(zhǎng)和酶的合成，也有進(jìn)行變溫生產(chǎn)的。第四十七頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日例如以枯草桿菌ASl.398進(jìn)行中性蛋白酶生產(chǎn)時(shí)，培養(yǎng)溫度必須從31℃逐漸升溫至40℃，然后再降溫到31℃進(jìn)行培養(yǎng)，蛋白酶產(chǎn)量比不升溫者高66%。據(jù)報(bào)道，酶生產(chǎn)的溫度對(duì)酶活力的穩(wěn)定性有影響，例如用嗜熱芽孢桿菌進(jìn)行α－淀粉酶生產(chǎn)時(shí)，在55℃培養(yǎng)所產(chǎn)生的酶的穩(wěn)定性比35℃好。第四十八頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日(2)pH對(duì)產(chǎn)酶的影響種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的pH直接影響酶的產(chǎn)量和質(zhì)量。在發(fā)酵過(guò)程中，微生物不斷分解和同化營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)排出代謝產(chǎn)物。由于這些產(chǎn)物都與pH有直接關(guān)系，因此發(fā)酵液pH在不斷發(fā)生變化。生產(chǎn)上根據(jù)pH的變化情況常作為生產(chǎn)控制的根據(jù)。一般來(lái)說(shuō)，培養(yǎng)基成分中碳/氮(C/N)比高，發(fā)酵液傾向于酸性，pH低；C/N低，發(fā)酵液傾向于堿性，pH高。第四十九頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日(2)pH對(duì)產(chǎn)酶的影響pH的這些變化情況，常常引起細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)酶環(huán)境的變化，對(duì)產(chǎn)酶帶來(lái)不利的影響。因此生產(chǎn)中常采用一些控制pH的方法，通常有：添加緩沖液維持一定的pH；調(diào)節(jié)通風(fēng)量維持發(fā)酵液的氧化還原電位于一定范圍；調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH，保持一定的C/N比；當(dāng)發(fā)酵液pH過(guò)高時(shí)用糖或淀粉來(lái)調(diào)節(jié)，pH過(guò)低時(shí)，通過(guò)氮調(diào)節(jié)。第五十頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日(3)通風(fēng)量對(duì)產(chǎn)酶的影響其實(shí)通風(fēng)量的多少應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)基中的溶解氧而定。一般來(lái)說(shuō)，在發(fā)酵初期，雖然幼細(xì)胞呼吸強(qiáng)度大，耗氧多，但由于菌體少，相對(duì)通風(fēng)量可以少些；菌體生長(zhǎng)繁殖旺盛期時(shí)，耗氧多，要求通風(fēng)量大些；產(chǎn)酶旺盛時(shí)的通風(fēng)量因菌種和酶種而異，一般需要強(qiáng)烈通風(fēng)；但也有例外，通風(fēng)量過(guò)多反而抑制酶的生成。因此，菌種、酶種、培養(yǎng)時(shí)期、培養(yǎng)基和設(shè)備性能都能影響通風(fēng)量，從而影響酶的產(chǎn)量。目前用于酶制劑生產(chǎn)的微生物都為好氣性微生物，生產(chǎn)上普遍采用自動(dòng)測(cè)定和記錄溶解氧的儀表。第五十一頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日調(diào)節(jié)溶解氧的方法調(diào)節(jié)通風(fēng)量，通風(fēng)量是指單位時(shí)間內(nèi)流經(jīng)培養(yǎng)液的空氣量，一般常用培養(yǎng)液體積與每分鐘通入的空氣體積之比來(lái)表示（vvm），如1m3培養(yǎng)液，每分鐘通入的空氣量為0.6m3,則通氣量為1：0.6。調(diào)節(jié)氣液接觸時(shí)間，氣液兩相接觸時(shí)間延長(zhǎng)，氧氣有更多的時(shí)間溶解在培養(yǎng)基中，通過(guò)增加液層高度（發(fā)酵高徑比加大），降低氣流速度，罐中增設(shè)檔板等方法。第五十二頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日調(diào)節(jié)氣液接觸面積，溶氧是通過(guò)氣液界面進(jìn)行的，提高氣液兩相接觸面積，有利提高溶解氧。減少氣泡體積，發(fā)酵罐底部安裝空氣分配管，裝設(shè)攪拌裝置或增加擋板，可使氣泡進(jìn)一步打碎，延長(zhǎng)氣液接觸時(shí)間。提高氧的分壓。增加罐壓，或提高空氣中氧的含量，都能提高氧的分壓，從而提高溶氧速率。改變培養(yǎng)液的性質(zhì)，培養(yǎng)液粘度大，導(dǎo)致Kla降低，同時(shí)易產(chǎn)生泡沫，可以加入無(wú)菌水降低發(fā)酵液粘度。一般控制溶氧速率等于或稍高于耗氧速率即可。一般控制溶氧飽和度DO在20%左右。全自動(dòng)發(fā)酵罐，可通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速或通風(fēng)量來(lái)控制溶氧。第五十三頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日(4)攪拌的影響對(duì)于好氣性微生物的深層發(fā)酵，除了需要通氣外，還需要攪拌。攪拌有利于熱交換、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與菌體均勻接觸，降低細(xì)胞周圍的代謝產(chǎn)物，從而有利于新陳代謝。同時(shí)可打破空氣氣泡，使發(fā)酵液形成湍流，增加湍流速度，從而提高溶氧量，增加空氣利用。但攪拌速度主要因菌體大小而異，由于攪拌產(chǎn)生剪切力，易使細(xì)胞受損。同時(shí)攪拌也帶來(lái)一定機(jī)械熱，易使發(fā)酵液溫度發(fā)生變化。攪拌速度還與發(fā)酵液黏度有關(guān)。第五十四頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日(5)泡沫的影響發(fā)酵中往往產(chǎn)生較多的泡沫。泡沫的存在阻礙了二氧化碳的排除，影響溶氧量，同時(shí)泡沫過(guò)多影響補(bǔ)料，也易使發(fā)酵液溢出罐外造成跑料。因此，生產(chǎn)上必須采用消泡措施。一般除了機(jī)械消泡外，還可利用消泡劑。消泡劑主要是一些天然的礦物油類、醇類、脂肪酸類、胺類、酰胺類、醚類、硫酸酯類、金屬皂類、聚硅氧烷和聚硅酮，其中以聚甲基硅氧烷最好。我國(guó)常用聚氧丙烯甘油醚或泡敵(聚環(huán)氧丙環(huán)氧乙烷甘油醚)。理想的消泡劑，其表面相互作用力應(yīng)低，而且應(yīng)難溶于水，還不能影響氧的傳遞速率和微生物的正常代謝。第五十五頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日泡沫控制方法調(diào)整培養(yǎng)基成分，如不加或緩加易起泡的原料，或改變pH、溫度、通風(fēng)、罐壓和攪拌，或采用分次投料來(lái)控制。采用機(jī)械消泡裝置，用消泡漿打碎泡沫，或把泡沫引出罐外，通過(guò)噴嘴的加速作用或利用離心力來(lái)消除泡沫。添加消泡劑，外界加入消泡劑使泡沫破碎的方法，主要是具有降低表面張力的表面活性劑。第五十六頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日發(fā)酵方式

固體發(fā)酵：固體發(fā)酵反應(yīng)器有轉(zhuǎn)鼓（桶）式、轉(zhuǎn)（盤(pán)）軸式、淺盤(pán)式。一般來(lái)說(shuō)固體發(fā)酵產(chǎn)酶活力是液體發(fā)酵酶活力的幾十到幾百倍。

液體發(fā)酵：機(jī)械攪拌發(fā)酵罐，氣升環(huán)流發(fā)酵罐。可實(shí)現(xiàn)在線控制pH、溶氧、攪拌轉(zhuǎn)速、溫度等工藝參數(shù)。第五十七頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日液體發(fā)酵的幾種方式分批（間歇）發(fā)酵（Batchculture）：所有的基質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)一開(kāi)始就加入，培養(yǎng)容易。連續(xù)發(fā)酵（Continuousculture）：底物不斷加入，產(chǎn)物不斷移走，可在最高酶合成速率和最適菌體濃度下進(jìn)行，具有生產(chǎn)率高的特點(diǎn)，但酶濃度比流加發(fā)酵低，在操作過(guò)程中容易發(fā)生染菌及菌種退化問(wèn)題。流加發(fā)酵（Fed-batchculture，F(xiàn)BC）：營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)連續(xù)或半連續(xù)加入，流出物非連續(xù)移走或不移走。第五十八頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日流加發(fā)酵的優(yōu)點(diǎn)可避免高濃度底物對(duì)菌體生長(zhǎng)的抑制，以及底物分解成大量產(chǎn)物后所產(chǎn)生的分解代謝阻遏抑制產(chǎn)酶，可使殘留的底物濃度維持在低濃度水平?？杀苊馀囵B(yǎng)基中某些成分在高濃度時(shí)對(duì)細(xì)胞的毒害作用?？色@得很大的菌體量（生物量），較好的生產(chǎn)率及產(chǎn)量，可提高單位體積發(fā)酵液的酶產(chǎn)量?？梢允拱l(fā)酵過(guò)程最佳化，使菌種保持在最大生產(chǎn)力的狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)酶的高產(chǎn)，并可大大降低下游過(guò)程中酶的分離或提取的成本。第五十九頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日流加控制策略pH溶氧尾氣分析底物濃度比生長(zhǎng)速率第六十頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日

發(fā)酵生產(chǎn)酶制劑用無(wú)菌空氣的標(biāo)準(zhǔn)空氣中的微生物一般都依附于塵埃粒子和霧滴上，

空氣中的塵埃粒子和霧滴的大小一般在1~10μm，細(xì)菌中的球菌直徑為0.5~2μm，桿菌的長(zhǎng)度1~5μm，寬度0.5~1μm弧菌的長(zhǎng)度1~5μm，寬度為0.3~1μm

所以，空氣中只要能除去0.3μm以下的微粒，就可認(rèn)為是無(wú)菌空氣。第六十一頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日空氣預(yù)處理流程在沿海潮濕地區(qū)，特別是夏季，空氣中濕含量較大，應(yīng)采取將壓縮空氣先冷卻到露點(diǎn)以下，析出部分水分，然后再升溫使相對(duì)濕度下降60%以下，進(jìn)空氣過(guò)濾器。一般采用二級(jí)冷卻析水加熱空氣的預(yù)處理流程。大氣→粗過(guò)濾→空氣壓縮機(jī)→貯罐→一級(jí)冷卻器→旋風(fēng)分離器→二級(jí)冷卻→絲網(wǎng)除沫器→加熱器→總過(guò)濾器→分過(guò)濾器→發(fā)酵罐第六十二頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日固體發(fā)酵罐

第六十三頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日液體發(fā)酵罐結(jié)構(gòu)示意圖

第六十四頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日液體發(fā)酵罐

第六十五頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日

30升全自動(dòng)發(fā)酵罐第六十六頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日30升全自動(dòng)發(fā)酵罐第六十七頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日工業(yè)發(fā)酵罐第六十八頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日現(xiàn)代發(fā)酵的發(fā)展趨勢(shì)清液發(fā)酵流加發(fā)酵（濃醪發(fā)酵、細(xì)胞高密度培養(yǎng)）連續(xù)滅菌發(fā)酵與產(chǎn)物分離偶合第六十九頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日酶制劑的發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程圖解第七十頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日2.3酶的分離純化酶的分離純化工作，是酶學(xué)研究的基礎(chǔ)。酶的純化過(guò)程，就目前而言，還是一門(mén)實(shí)驗(yàn)科學(xué)。一個(gè)特定酶的提純往往需要通過(guò)許多次小實(shí)驗(yàn)進(jìn)行摸索，沒(méi)有通用的規(guī)律可循。酶的純化過(guò)程與一般的蛋白質(zhì)純化過(guò)程相比，又有其本身獨(dú)有的特點(diǎn)：一是特定的一種酶在細(xì)胞中的含量很少，二是酶可以通過(guò)測(cè)定活力的方法加以跟蹤，前者給純化帶來(lái)了困難，而后者卻能使我們迅速找出純化過(guò)程的關(guān)鍵所在。第七十一頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日基本概念酶活力(Enzymeactivity)：酶活力是指酶催化反應(yīng)的能力，它表示樣品中酶的含量。1961年國(guó)際酶學(xué)會(huì)規(guī)定，lmin催化lμmol分子底物轉(zhuǎn)化的酶量為該酶的一個(gè)活力單位(國(guó)際單位)，溫度為25℃，其它條件(pH、離子強(qiáng)度)采用最適條件。第七十二頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日酶的總活力為樣品的全部酶活力?？偦盍?酶活力×總體積(mL)

或=酶活力×總質(zhì)量(g)第七十三頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日比活力

(Specificactivit