分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)教案

河南科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)教案課稱分物指師

李市場河南科技大學(xué)

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實(shí)驗(yàn)一

大腸桿菌受態(tài)細(xì)胞的備及轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)名稱

實(shí)一大腸菌受細(xì)的備轉(zhuǎn)

實(shí)驗(yàn)學(xué)時

4每次實(shí)驗(yàn)組數(shù)

6

每組人數(shù)5

實(shí)驗(yàn)類型

綜合性實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅和ㄟ^本實(shí)驗(yàn)，掌握大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化的方法和技術(shù)。器：控

溫?fù)u床(37℃)，高速冷凍離心機(jī)，水浴鍋，冰箱（℃,‐70℃）超凈工作臺，培養(yǎng)箱(37℃)，752分光光度計，滅菌鍋等。：細(xì)菌處于容易吸收外源狀態(tài)叫感受態(tài)。轉(zhuǎn)化是指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)人細(xì)菌的過程。其原理是細(xì)菌處于℃，CaCl2低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形。轉(zhuǎn)化混合物中的形成抗的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42℃短時間熱擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收復(fù)合物。將細(xì)菌放置在非選擇性培養(yǎng)基中保溫一段時間促使在轉(zhuǎn)化過中獲得的新的表（如r等）得到表達(dá)，然后將此細(xì)菌培養(yǎng)物涂在含有氨芐青霉素的選擇培養(yǎng)基上。：將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體細(xì)菌誘導(dǎo)受體細(xì)菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源。將已經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。告：要實(shí)。：①無菌操作②溫操作

實(shí)驗(yàn)?zāi)繉?shí)驗(yàn)原

通過本實(shí)驗(yàn)，掌握大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化的方法和技術(shù)。將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體細(xì)菌誘導(dǎo)受體細(xì)菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源DNA。轉(zhuǎn)化(Transformation)是將外DNA分子引入受體細(xì)胞使之獲得新的遺傳性狀的一種手它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代為了提高轉(zhuǎn)化效率實(shí)驗(yàn)中要考慮以下幾個重要因素：1.細(xì)胞生長狀態(tài)和密度:細(xì)胞生長密度以剛進(jìn)入對數(shù)生長期時為好通過監(jiān)測培養(yǎng)液的來控制α菌株的為時細(xì)胞密度在個/ml左右(不同的菌株情況有所不同),時比較合適。密度過高或不足均會影響轉(zhuǎn)化效率。2.質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度:cccDNA即可使50μl的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。一般情況下,DNA液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5％。3.試劑的質(zhì)量所用的試劑,如等均需是最高純度的或AR.),用超純水配制,好分裝保存于干燥的冷暗處。4.防止雜菌和雜DNA的污染。本實(shí)驗(yàn)以E.coliDH5a菌株為受體細(xì)胞并用CaCl2處理使其處于感受態(tài),然后與pUC19質(zhì)粒共保溫,實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。由于質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因)，可通Amp性來篩選轉(zhuǎn)化子。如受體細(xì)胞沒有轉(zhuǎn)，則在含Amp培養(yǎng)基上不能生長。能在Amp培養(yǎng)基上生長的受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)化子）肯定已導(dǎo)入了。轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增后，可將轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒提取出，進(jìn)行電泳、酶切等進(jìn)一步鑒定。一.儀器

控溫?fù)u床(37)水浴鍋

高速冷凍離心機(jī)冰（℃,‐℃）

二.試劑

超凈工作臺752分光光度計胰蛋白胨

培養(yǎng)箱(℃)滅菌鍋無菌水,酵母粉Amp三.其他用品移液器，離心管平皿量筒瓊脂酒精燈酒精棉球

槍頭三角瓶200ml試劑瓶燒杯甘油三角玻棒火柴［溶液配制］0.1mol/L溶液配置滅菌LB液體培養(yǎng)基氨芐青霉素（無菌水配制50_60mg/mL溶液，抽慮滅菌置－20冰箱中保存。四.材料

E.coli.DH5質(zhì)粒五:實(shí)驗(yàn)步驟：(CaCl2)（20人一班，分三組）第一天從大腸桿菌DH5板上挑取一個單菌落接于mLLB液培養(yǎng)基的試管中,℃振蕩培過夜。第二天：1.取mL菌液轉(zhuǎn)接到一個含有mLLB液體培養(yǎng)基錐形瓶中，℃

22振蕩培養(yǎng)2－3h此時OD≤0.4-0.5細(xì)胞數(shù)務(wù)必≤10／mL。此為實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵)3.將菌液轉(zhuǎn)移到mL離心管中，冰上放置10min。4.離心10min4000r/min）回收細(xì)胞。4℃5.倒出培養(yǎng)液，將管倒置便培養(yǎng)液流盡。6.用冰冷的mol/LCaClmL浮沉淀，立即放在冰上min。27.0－4℃r/min,離心min，回收細(xì)胞。8.用冰冷的0.1mol/LCaCl2mL浮細(xì)胞必放在冰上29.分裝細(xì)胞，每μL一份。此細(xì)胞為感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化：10.取200μL新鮮制備的感受態(tài)細(xì)胞加入DNA（50ng混勻冰上放置30。同時作兩個對照管受體菌對照：μL受態(tài)細(xì)胞＋μL無菌水質(zhì)粒對照：μLmol/LCaCl溶液＋μL質(zhì)粒溶液11將管放到℃循環(huán)水浴1212.冰浴min。13.每管加800μLLB液體培養(yǎng)基，℃培養(yǎng)（慢搖14.將適當(dāng)體積（μL）已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞，涂在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)皿中。15.倒置平皿℃培養(yǎng)12－16h出現(xiàn)菌落。16.計算轉(zhuǎn)化效率關(guān)于大桿菌感受態(tài)胞的制及轉(zhuǎn)化講解

1、感受細(xì)胞的概念重組分子體外構(gòu)建完成后，必須導(dǎo)入特定的宿主（受體）細(xì)胞，使之無性繁殖并高效表達(dá)外源基因或直接改變其遺傳性狀個導(dǎo)入過程及操作統(tǒng)稱為重組DNA分子的轉(zhuǎn)化。在原核生物中，轉(zhuǎn)化是一個較普遍的現(xiàn)象，在細(xì)胞間轉(zhuǎn)化是否發(fā)生，一方面取決于供體菌與受體菌兩者在進(jìn)化過程中的親緣關(guān)系一方面還與受體菌是否處于一種感受狀態(tài)有著很大的關(guān)系。所謂的感受態(tài)，即指受體（或者宿主）最易接受外源片段并實(shí)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)它是由受體菌的遺傳性狀所決定的同時也受菌齡外界環(huán)境因子的影響可以使感受態(tài)水平提高一萬倍而也可大大促進(jìn)轉(zhuǎn)化的作用細(xì)胞的感受態(tài)一般出現(xiàn)在對數(shù)生長期新鮮幼嫩的細(xì)胞是制備感受態(tài)細(xì)胞和進(jìn)行成功轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時不用時加入占總體積的無菌甘油或-℃保存（有效期6月2、轉(zhuǎn)化概念及原理在基因克隆技術(shù)中轉(zhuǎn)化特指將質(zhì)粒DNA或以其為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入細(xì)菌體內(nèi)，使之獲得新的遺傳特性的一種方法。它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一。受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（如：電擊法，CaCl等化學(xué)試劑法）處理后，2使細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許外源DNA分子通過的感受態(tài)細(xì)胞。進(jìn)入細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制、表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。大腸桿菌的轉(zhuǎn)化常用化學(xué)法（CaCl法法最先是由于1972發(fā)2現(xiàn)的。其原理是細(xì)菌處于0，CaCl的低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形，轉(zhuǎn)化2混合物中的DNA形成抗的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42℃短時間熱沖擊處理促使細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物在豐富培養(yǎng)基上生長數(shù)小時后，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增值被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中重組子中基因得到表達(dá)在選擇性培養(yǎng)基平板上，可選出所需的轉(zhuǎn)化子。

671077671077處理的感受態(tài)細(xì)胞其轉(zhuǎn)化率一般能達(dá)到5×10~2×轉(zhuǎn)化子/質(zhì)粒，可以滿足一般的基因克隆試驗(yàn)。如在Ca2+的基礎(chǔ)上，聯(lián)合其它二價金屬離子（如100~1000倍。

、DMSO還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌，則可使轉(zhuǎn)化率提高化學(xué)法簡單、快速、穩(wěn)定、重復(fù)性好，菌株適用范圍廣，感受態(tài)細(xì)菌可以在-70℃保存，因此被廣泛用于外源基因的轉(zhuǎn)化。除化學(xué)法轉(zhuǎn)化細(xì)菌外，還有電擊轉(zhuǎn)化法，電擊法不需要預(yù)先誘導(dǎo)細(xì)菌的感受態(tài)，依靠短暫的電擊，促使進(jìn)細(xì)菌，轉(zhuǎn)化率最高能達(dá)到

9

~10

轉(zhuǎn)化子/ug環(huán)DNA。因操作簡便，愈來愈為人們所接受。3、感受細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化中的影響因素⑴、細(xì)胞的生長狀態(tài)和密度最好從-℃或-℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。不要用已經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接，及貯存4℃的培養(yǎng)菌液。細(xì)胞生長密度每毫升培養(yǎng)液中的細(xì)胞數(shù)在510個左右為佳即應(yīng)用對數(shù)期或?qū)?shù)生長前期的細(xì)菌，可通過測定培養(yǎng)液的OD控制。菌株OD為5，細(xì)胞密度5600×10個/ml左右注意OD值與細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系隨菌株的不同而不同600密度過高或不足均會使轉(zhuǎn)化率下降。此外，受體細(xì)胞一般應(yīng)是限制-修飾系統(tǒng)缺陷的突變株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株。并且受體細(xì)胞還應(yīng)與所轉(zhuǎn)化的載體性質(zhì)相匹配。⑵、質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)的，轉(zhuǎn)化率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源DNA的量過多或體積過大時，則會使轉(zhuǎn)化率下降般地DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5%cccDNA即可使50ul的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。對于以質(zhì)粒為載體的重組分子而言，分子量大的轉(zhuǎn)化效率低，實(shí)驗(yàn)證明，大于30kb的重組質(zhì)粒將很難進(jìn)行轉(zhuǎn)化。此外重組DNA分子的構(gòu)型與轉(zhuǎn)化效率也密切相關(guān)狀重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率較分子量相同的線性重組質(zhì)粒高，因此重組DNA大都構(gòu)成環(huán)狀雙螺旋分子。

⑶、試劑的質(zhì)量所用的CaCl等試劑均需是最高純度的，并用最純凈的水配制，最好分裝保存于4。⑷、防止雜菌和雜DNA的污染整個操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，所用器皿，如離心管，移液槍頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理。所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、酶或雜所污染否則均會影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA轉(zhuǎn)入。⑸、整個操作均需在冰上進(jìn)行，不能離開冰浴，否則細(xì)胞轉(zhuǎn)化率將會降低。

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實(shí)驗(yàn)二質(zhì)粒的提取其酶切

實(shí)驗(yàn)學(xué)時

4每次實(shí)驗(yàn)組數(shù)

6

每組人數(shù)5

實(shí)驗(yàn)類型

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅和ㄟ^本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)和掌握堿裂解法提取質(zhì)粒。器：微量移液器，微量離心管，常用玻璃器皿，恒溫培養(yǎng)箱，恒溫?fù)u床，臺式離心機(jī)，高壓滅菌鍋：堿裂解法提取質(zhì)粒是根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線性染色體在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分離它們。在pH值介于12.0～這個狹窄的范圍內(nèi)，線性的雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性管在這樣的條件下共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA的氫鍵會被斷裂兩條互補(bǔ)鏈彼此相互纏繞會緊密地結(jié)合在一起加入pH4.8的乙酸鉀高鹽緩沖液恢復(fù)pH至中性時，共價閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA的兩條互補(bǔ)鏈仍保持在一起，因此復(fù)性迅速而準(zhǔn)確，而線性的染色體的兩條互補(bǔ)鏈彼此已完全分開復(fù)性就不會那木迅速而準(zhǔn)確它們纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA，蛋白質(zhì)－復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。：用堿裂解法提取質(zhì)粒告：實(shí)個。：1、時格2。

實(shí)二質(zhì)DNA的提取及酶實(shí)驗(yàn)?zāi)?/p>

通過本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)和掌握堿裂解法提取質(zhì)粒。實(shí)驗(yàn)原

堿裂解法提取質(zhì)粒是根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒

與線性染色體在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分離它們pH值介于12.0這個狹窄的范圍內(nèi)，線性的雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性，盡管在這樣的條件下，共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA的氫鍵會被斷裂兩條互補(bǔ)鏈彼此相互纏繞會緊密地結(jié)合在一起。當(dāng)加入的乙酸鉀高鹽緩沖液恢復(fù)pH至中性時價閉合環(huán)狀的質(zhì)粒的兩條互補(bǔ)鏈仍保持在一起，因此復(fù)性迅速而準(zhǔn)確，而線性的染色體DNA的兩條互補(bǔ)鏈彼此已完全分開性就不會那木迅速而準(zhǔn)確們纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體與不穩(wěn)定的大分子RNA蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。實(shí)驗(yàn)儀：量移液器，微量離心管，常用玻璃器皿，臺式高速離心機(jī)，分光光度計，恒溫培養(yǎng)箱，恒溫?fù)u床，臺式離心機(jī)，高壓滅菌鍋。試劑及液：(1)用堿法提取質(zhì)粒DNA溶液（緩沖液葡萄糖，10mmol/LEDTApH8.o用前加溶菌酶4rngmL。溶液2變性液0．2rnoI/I，1％SDS溶液3乙酸鉀溶液ml5L11.5ml,冰醋酸，H。（2）緩沖液EcoR酶解緩沖液（l0）TBE沖（I×取108g,硼酸55g,／L,EDTApH8.o40ml，用H2o定容到l000壓滅菌作為l0貯液稀釋倍后作為工作液使用。TE緩沖液10／L，IL，其中含有RNase20μg／。（3）上樣液及其他試劑

上樣液（6溴酚藍(lán)質(zhì)量濃度40％蔗糖水溶液。溴化乙啶染色液（／m水中溶解0.2g溴化乙啶，混勻后4℃避光保存。異丙醇，70乙醇等。實(shí)驗(yàn)步（一）提取粒1.將2ml含相應(yīng)抗生素的液體培養(yǎng)基加入試管中入上述的含質(zhì)粒的大腸桿菌單菌落，℃振蕩培養(yǎng)過夜。2.取培養(yǎng)物倒入微量離心管中，4000r/min心2min。3.棄上清，吸盡殘液，使細(xì)胞沉淀盡可能干燥。4.加入100ul溶液Ⅰ，充分混勻，室溫放10min。200ul溶液Ⅱ（新鮮配制蓋緊管蓋，輕輕顛倒數(shù)次混勻，將離心管放冰上。5.加入150ul溶液Ⅲ（冰上預(yù)冷緊管口，顛倒數(shù)次使混勻。冰上放置15min。6.12000r/min,離心min，將上清轉(zhuǎn)至另一離心管中。7.加入等體積酚：氯仿（1：1蛋白復(fù)混勻，12000，離心5min，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。8.加入2倍體積無水乙醇，混勻后，室溫放置～10min。12000r/min離心5min。倒去上清液，把離心管倒扣在吸水紙上，吸干液體。9.用1ml70%乙醇洗滌質(zhì)粒沉淀，振蕩并離心，倒去上清液，真空抽干或空氣中干燥。10.加50ul緩沖液，其中含有ug/ml的胰RNA酶，使DNA完全溶解，－20℃保存。（二）酶切

取DNA溶液加酶切緩沖液Eco

RI酶1ul無菌水補(bǔ)至總體積ul37℃保溫3h,加終止液，準(zhǔn)備下個實(shí)驗(yàn)電泳，分析質(zhì)粒的限制性酶切圖譜。質(zhì)粒提取的關(guān)鍵問題即質(zhì)粒提取中三種溶液的作用：堿法質(zhì)粒抽提用到三種溶液：溶液I，50mM葡萄糖/25mMTris-Cl/10mMEDTA，pH8.0；溶液II，0.2NNaOH/1%SDS；溶液III3M醋酸鉀/2M醋酸。讓我們先來看溶液I的作用任何生物化學(xué)反應(yīng)首先要控制好溶液的pH，因此用適當(dāng)濃度的和適當(dāng)pH的Tris-Cl溶液，是再自然不過的了那么50mM葡萄糖是干什么的呢？說起來不可思議加了葡萄糖后最大的好處只是懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部因此如果溶液I中缺了葡萄糖其實(shí)對質(zhì)粒的抽提本身而言幾乎沒有任何影響所以說溶液中葡萄糖是可缺的。那么EDTA呢？大家知道EDTACa2+

和Mg

2+

等二價金屬離子的螯合劑配在分子生物學(xué)試劑中的主要作用是抑制DNase的活性和抑制微生物生長。在溶液I中加入高達(dá)mM的EDTA，無非就是要把大腸桿菌細(xì)胞中的所有二價金屬離子都螯合掉。如果不加EDTA，其實(shí)也沒什么大不了的，只要不磨洋工只要是在不太長的時間里完成質(zhì)粒抽提就不用怕DNA會迅速被降解因?yàn)樽罱K溶解質(zhì)粒的TE緩沖液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提質(zhì)粒呢？實(shí)話告訴你，只要用等體積的水，或培養(yǎng)基來懸浮菌體就可以了。有一點(diǎn)不能忘的是，菌體一定要懸浮均勻，不能有結(jié)塊。輪到溶液II了。這是用新鮮的0.4N的NaOH和2％的SDS等體積混合后使用的。要新從濃NaOH稀釋制備0.4N的NaOH，無非是為了保證NaOH有吸收空氣中的CO2而減弱了堿性。很多人不知道其實(shí)破細(xì)胞的主要是堿，而不是，所以才叫堿法抽提。事實(shí)上NaOH是最佳的溶解細(xì)胞的試劑不管是大腸桿菌還是哺乳動物細(xì)胞碰到了堿都會幾乎在瞬間就溶解，這是由于細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化所導(dǎo)致。用了不新鮮0.4NNaOH，即便是有SDS也無法有效溶解大腸桿（不妨可以自己試一下自然就難高效率抽提

得到質(zhì)粒如果只用SDS當(dāng)然也能抽提得到少量質(zhì)粒因?yàn)镾DS也是堿性的只是弱了點(diǎn)而已。很多人對NaOH的作用誤以為是為了讓基因組DNA變性，以便沉淀這是由于沒有正確理解一些書上的有關(guān)變性復(fù)性的描述所導(dǎo)致有人不禁要問，既然是NaOH溶解的細(xì)胞，那為什么要加呢？那是為下一步操作做的鋪墊。這一步要記住兩點(diǎn)：第一，時間不能過長，千萬不要這時候去接電話，因?yàn)樵谶@樣的堿性條件下基因組DNA片斷會慢慢斷裂第二必須溫柔混（象對待女孩子一樣），不然基因組DNA也會斷裂?；蚪M的斷裂會帶來麻煩。每個人都知道溶液加入后就會有大量的沉淀但大部分人卻不明白這沉淀的本質(zhì)最容易產(chǎn)生的誤解是當(dāng)SDS碰到酸性后發(fā)生的沉淀如果你這樣懷疑，往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是這么回事了。大量沉淀的出現(xiàn)，顯然與SDS的加入有關(guān)系。如果在溶液中不加SDS怎樣呢，也會有少量的沉淀，但量上要少得多，顯然是鹽析和酸變性沉淀出來的蛋白質(zhì)。既然SDS不是遇酸發(fā)生的沉淀那會不會是遇鹽發(fā)生的沉淀呢？在％的SDS溶液中慢慢加入5N的NaCl，你會發(fā)現(xiàn)SDS在高鹽濃度下是會產(chǎn)生沉淀的。因此高濃度的鹽導(dǎo)致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是而是KCl，你會發(fā)現(xiàn)沉淀的量要多的多。這其實(shí)是十二烷基硫酸鈉（dodecylsulfate遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀（potassiumdodecylsulfate,PDS，而PDS是水不溶的因此發(fā)生了沉淀如此看來溶液III入后的沉淀實(shí)際上是鉀離子置換了SDS中的鈉離子形成了不溶性的PDS高濃度的鹽得沉淀更完全。大家知道SDS專門喜歡和蛋白質(zhì)結(jié)合平均兩個氨基酸上結(jié)合一個分子鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了人高興的是大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉淀了。這個過程不難想象，因?yàn)榛蚪MDNA太長了長的DNA自然容易被給共沉淀了管SDS并不與DNA子結(jié)合。那么2M的醋酸又是為什么而加的呢？是為了中和，因?yàn)殚L時間的堿性條件會打斷DNA所以要中和之基因組一旦發(fā)生斷裂只要是－100kb大小的片斷，就沒有辦法再被PDS共沉淀了。所以堿處理的時間要短，而且

不得激烈振蕩不然最后得到的質(zhì)粒上總會有大量的基因組混入瓊脂糖電泳可以觀察到一條濃濃的總DNA條帶很多人誤認(rèn)為是溶液加入后基因組DNA無法快速復(fù)性就被沉淀了，這是天大的誤會，因?yàn)樽冃缘囊埠脧?fù)性的也好DNA分子在中性溶液中都是溶解的。NaOH本來是為了溶解細(xì)胞而用的，DNA分子的變性其實(shí)是個副產(chǎn)物與它是不是沉淀下來其實(shí)沒有關(guān)系溶液III入并混合均勻后在冰上放置，目的是為了PDS沉淀更充分一點(diǎn)。不要以為PDS沉淀的形成就能將所有的蛋白質(zhì)沉淀了實(shí)還有很多蛋白質(zhì)不能被沉淀因此要用酚/氯仿/異戊醇進(jìn)行抽提然后進(jìn)行酒精沉淀才能得到質(zhì)量穩(wěn)定的質(zhì)粒DNA，不然時間一長就會因?yàn)榛烊氲亩l(fā)生降解。這里用5/24/1的酚/氯仿/異戊醇是有很多道理的，這里做個全面的介紹。酚Phenol）對蛋白質(zhì)的變性作用遠(yuǎn)大于氯仿，按道理應(yīng)該用酚來最大程度將蛋白質(zhì)抽提掉，但是水飽和酚的比重略比水重碰到高濃度的鹽溶（比如4M的異硫氰酸胍，離心后酚相會跑到上層不利于含質(zhì)粒的水相的回收但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始終在下層，方便水相的回收；還有一點(diǎn)，酚與水有很大的互溶性如果單獨(dú)用酚抽提后會有大量的酚溶解到水相中而酚會抑制很多酶反應(yīng)（比如限制性酶切反應(yīng)因此如果單獨(dú)用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次將水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液進(jìn)行抽提，跑到水相中的酚則少得多，微量的酚在乙醇沉淀時就會被除干凈而不必?fù)?dān)心酶切等反應(yīng)不能正常進(jìn)行于異戊醇的添加其作用主要是為了讓離心后上下層的界面更加清晰也方便了水相的回收。回收后的水相含有足夠多的鹽因此只要加入2倍體積的乙醇在室溫放置幾分鐘后離心就可以將質(zhì)粒DNA沉淀出來這時候如果放到－20℃時間一長反而會導(dǎo)致大量鹽的沉淀這點(diǎn)不同于普通的酒精沉淀回收所以不要過分小心了高濃度的鹽會水合大量的水分子因此分子之間就容易形成氫鍵而發(fā)生沉淀。如果感覺發(fā)生了鹽的沉淀，就用70的乙醇多洗幾次，每次在室溫放置一個小時以上并用tip將沉淀打碎就能得到好的樣品得到的質(zhì)粒樣品一般用含RNase（50ug/ml）的TE緩沖液進(jìn)行溶解，不然大量未降解的RNA會干擾電泳結(jié)果的.

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實(shí)驗(yàn)三瓊脂凝膠泳技術(shù)［實(shí)驗(yàn)的］通過本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的方法和技。實(shí)驗(yàn)名稱每次實(shí)驗(yàn)組數(shù)

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實(shí)三瓊糖膠泳術(shù)每組人數(shù)5

實(shí)驗(yàn)學(xué)時實(shí)驗(yàn)類型

4驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅和ㄟ^本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳檢測的方法和技術(shù)。器：，瓊膠，臺，高鍋，紫投。：分在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)分在高于等電點(diǎn)的溶中帶負(fù)電荷電場中向正極移動。由于糖－磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈幾具有等量的凈電荷，因此他們能以相同的速度向正極方向移動。在一定的電場強(qiáng)度下，DNA分的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即分本身的大小和構(gòu)型。具有不同的相對分子質(zhì)量的片泳動速度不一樣，可進(jìn)行分離分的遷移速度與相對分子質(zhì)量對數(shù)值成反比關(guān)系。膠電泳不僅可以分離不同對分子質(zhì)量的DNA,也可以分離相對分子質(zhì)量相同,構(gòu)型不同的DNA分子。如上次實(shí)驗(yàn)提取的pUC19質(zhì)，有3種型：超螺旋的共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒closed，稱開環(huán)質(zhì)粒即價閉合環(huán)狀質(zhì)粒條斷裂circularDNA,簡稱）線狀質(zhì)粒，共價閉環(huán)狀質(zhì)粒DNA2條發(fā)生斷裂linearDNA，簡稱LDNA3種型的質(zhì)粒分在凝膠電泳中的遷移率不同。因此電泳后呈3條帶，超螺旋質(zhì)粒泳動最快，其次為線狀，環(huán)質(zhì)粒。：術(shù)酶粒DNA.告：星實(shí)。：1、注糖2戴。

［實(shí)驗(yàn)原理］分子在瓊脂糖凝中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷在電場中向正極移動。由于糖－磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此他們能以相同的速度向正極方向移動。在一定的電場強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即分子本身的大小和構(gòu)型。具有不同的相對分子質(zhì)量的DNA片段泳動速度不一樣進(jìn)行分離DNA分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量對數(shù)值成反比關(guān)系.。凝膠電泳不僅可以分不同相對分子質(zhì)量的DNA,也可以分離相對分子質(zhì)量相同,但構(gòu)型不同的DNA分子上次實(shí)驗(yàn)提取的pUC19質(zhì)粒，有種構(gòu)型：超螺旋的共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒closedcircular簡稱CCCDNA)開環(huán)質(zhì)粒DNA即共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒鏈斷裂，（opencircular簡稱線狀質(zhì)粒DNA，即共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA2鏈發(fā)生斷裂DNA，簡稱L3構(gòu)型的質(zhì)粒DNA分子在凝膠電泳中的遷移率不同。因此電泳后呈3帶，超螺旋質(zhì)粒DNA動最快，其次為線狀DNA，開環(huán)質(zhì)粒DNA。[儀器、材料與試劑]一、儀器1.恒溫培養(yǎng)箱2.瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)3.臺式離心機(jī)4.高壓滅菌鍋5.紫外線透射儀二、材料1.三羥甲基氨基甲烷(Tris)2.硼酸3.乙二胺四乙酸(EDTA)4.溴酚藍(lán)5.蔗糖6.瓊脂糖7.溴化乙錠

8.DNA實(shí)驗(yàn)步驟一)制備瓊脂糖凝膠電泳槽及用膠量：稱取瓊脂糖，放入錐形瓶中，加30ml0.5×TBE緩沖液，置微波爐或水浴加熱至完全溶化取出搖勻，則為1%的瓊脂糖凝膠液。冷卻至60,加入適量EB,混勻。（二）膠板的制備1.取有機(jī)玻璃內(nèi)槽，洗凈，晾干，用橡皮膏將有機(jī)玻璃內(nèi)槽的兩端邊緣封好（一定封嚴(yán)，不能留縫隙2.將有機(jī)玻璃內(nèi)槽放置于一水平位置，并放好樣品梳子。梳子調(diào)整齊3.將冷到60℃左右的瓊脂糖凝膠液，緩緩倒入有機(jī)玻璃內(nèi)槽，直至有機(jī)玻璃板上形成一層均勻的膠面（注意不要形成氣泡4.待膠凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，將膠槽放在電泳槽內(nèi)。5.加入電泳緩沖液至電泳槽中。（三加樣,用移液器將已加入上樣緩沖液的DNA樣品加入樣品（錄點(diǎn)樣順序及點(diǎn)樣量（四）電泳1.接通電泳槽與電泳儀的電源注意正負(fù)極片段從負(fù)極向正極移動DNA的遷移速度與電壓成比，最高電壓不超過V/cm。2.當(dāng)溴酚藍(lán)染料移動到距凝膠前沿1~2cm處，停止電泳。（五）染色

將電泳后的凝膠浸入溴化乙錠染色液中，染色以觀察在瓊脂糖凝膠中的帶（戴手套操作問題討論1）在細(xì)胞質(zhì)粒DNA是共價閉環(huán)（covalentlycircularDNA，cccDNA以超螺旋形式存在。如果兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處缺刻，分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，這種松弛型的分子叫作開環(huán)（circular，ocDNA兩條鏈在同一處或其附近斷裂，則變成性DNA分子。在電泳時，同一質(zhì)粒的電泳速度因的構(gòu)型不同而異，其次序?yàn)椋篶ccDNA＞直線DNA＞ocDNA，因此在本次實(shí)驗(yàn)中瓊脂糖膠電泳上的自制質(zhì)粒呈現(xiàn)3帶。如果你不小心在溶液II（實(shí)驗(yàn)二）加入后過度振蕩，會有第四條帶，這條帶泳動得較慢，遠(yuǎn)離這三條帶，是20-100kb的大腸桿菌基因組DNA的片斷。非常偶然的是，有時候抽提到的質(zhì)粒會有7－10帶，這是由于特殊的序列導(dǎo)致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈數(shù)不同）所致。2瓊脂糖是一種從海藻中提取出來的線狀高聚物當(dāng)熔化再凝固后就會形成固體基質(zhì)其密度取決于溶液中所含瓊脂糖的量帶負(fù)電荷的核酸就可以在這種基質(zhì)中于電場的作用下向陽極移動核酸在瓊脂糖基質(zhì)中的遷移率取決于下列參數(shù)：①DNA的子大?。虎诃傊堑臐舛?；DNA的構(gòu)象④所加電壓；⑤電場方向；⑥堿基組成與溫度；⑦嵌入的染料；⑧電泳緩沖液的組成等。瓊脂糖濃度對核酸遷移率的影響是：一定大小的DNA片段，在不同濃度的瓊脂糖凝膠中的遷移率不同在一定濃度的瓊脂糖凝膠能夠分辨的核酸片段大小范圍內(nèi)核酸片段的遷移率與其相對分子質(zhì)量大小相反。3）溴化乙的化學(xué)名稱是，－二氨基r－乙基－一苯基錠溴鹽（3，－diamino－5－ethyl－－phenyl－，簡稱或EB或EtBr于溴化乙錠分子插入，在紫外光的照射下，瓊脂糖凝膠電泳中DNA的條帶呈現(xiàn)出桔黃色的熒光檢測EB能插人分子中的堿基對之間，完成與DNA結(jié)合（超螺旋與EB結(jié)合能力小于雙鏈閉環(huán)，而雙鏈閉環(huán)DNA與合能力小于線狀雙鏈DNA所吸收的260nm的紫外光（UV）傳遞給，或者結(jié)合的EB本身在3O0nm和360nm吸

收的射線均在可見光譜的紅橙區(qū)，590nm波長發(fā)射出來EB染色具有以下特點(diǎn)：①操作簡便快速，室溫下染色；②不會使核酸斷裂；③靈敏度高10ng或更少的可檢出；④可以加到樣品中，隨時用紫外吸收追蹤檢查。但應(yīng)該特別注意的是，溴化乙啶是誘變劑，配制和使用時應(yīng)戴乳膠（或一次性塑料手套并且不要將該染色液灑在桌面或地面上凡是沾污溴化乙啶的器皿或物品，必須經(jīng)特殊處理后，再進(jìn)行清洗或棄去。河南科技學(xué)

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實(shí)驗(yàn)四物基因組的取

實(shí)驗(yàn)學(xué)時

4每次實(shí)驗(yàn)組數(shù)

6

每組人數(shù)5

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驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅和ㄟ^本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)從植物組織中提取DNA的方法。器：，式機(jī)，，光，灌。：利用液氮對植物組織進(jìn)行研磨從而破