宋存江微生物發(fā)酵工程微生物發(fā)酵過程

宋存江微生物發(fā)酵工程微生物發(fā)酵過程第1頁/共37頁

第四章

微生物發(fā)酵過程

(MicrobialFermentation-Process)

一.微生物發(fā)酵的類型

二.種子擴大培養(yǎng)

三.發(fā)酵培養(yǎng)基

四.發(fā)酵過程中間分析

五.發(fā)酵終點的判斷

六.主要技術經濟指標第2頁/共37頁微生物發(fā)酵的不同類型微生物發(fā)酵

需氧或不需要好氧發(fā)酵兼性發(fā)酵厭氧發(fā)酵

培養(yǎng)基呈液態(tài)或固態(tài)液態(tài)發(fā)酵固態(tài)發(fā)酵發(fā)酵在培養(yǎng)基表面或深層進行表面發(fā)酵深層發(fā)酵

間歇發(fā)酵或連續(xù)進行分批發(fā)酵補料分批發(fā)酵連續(xù)發(fā)酵

菌種狀態(tài)游離發(fā)酵固定化發(fā)酵

單一或混合菌種單一純種發(fā)酵雙菌發(fā)酵混合發(fā)酵一.微生物發(fā)酵的類型如：黑曲霉發(fā)酵生產檸檬酸；棒狀桿菌的Glu發(fā)酵；地衣芽胞桿菌發(fā)酵生產聚谷氨酸等如：乳酸桿菌的乳酸發(fā)酵；梭狀芽孢桿菌的丙酮丁醉發(fā)酵等空氣×

√×√如，酵母厭氧產酒精；好氧積累菌體；

另外，細胞固定化，生物法處理廢水，細菌采礦等等;固定化細胞√×NextpageNextpage第3頁/共37頁

發(fā)酵形式

優(yōu)點缺點固體投資少，設備簡單，操作容易可因陋就簡，

廣房面積大勞動強度

發(fā)酵因地制宜，利用農副產品以及下腳料作為

大不易機械化操作。

原料進行生產。

液體液體環(huán)境適合菌體生長和物質傳遞，發(fā)酵在均

投資大，設備要求嚴格，

發(fā)酵質條件下進行，便于控制，液體輸送方便，易

動力消耗比較大

于機械化操作，產品易精制?設備占地少，容

量大，可自動控制，適合大規(guī)模生產。固體發(fā)酵和液體發(fā)酵的區(qū)別

第4頁/共37頁

表面發(fā)酵和深層發(fā)酵

表面培養(yǎng)法深層培養(yǎng)法放置曲盤需要更多的廠房利用密閉的發(fā)酵罐需要更多的勞動力相反利用抵押空氣鼓風機需要高壓空氣動力消耗少空壓機、攪拌耗能需要簡單控制需要精密控制很少有污染問題污染往往成為嚴重問題產品回收包括水溶、抽提、相同過濾、離心、蒸發(fā)、沉淀相同第5頁/共37頁微生物發(fā)酵

分批發(fā)酵(BatchFermentation)

補料分批發(fā)酵(Fed-batchFermentation)

連續(xù)發(fā)酵(ContinuousFermentation)

固態(tài)發(fā)酵(SolidStateFermentation)

高密度發(fā)酵(HighCellDensityFermentation)基因工程菌的發(fā)酵(Recombinantstrainfermentation)第6頁/共37頁

發(fā)酵罐進行的間歇操作稱為分批發(fā)酵。在好氧發(fā)酵過程中，需要不斷通入無菌空氣并加入酸堿以調節(jié)發(fā)酵液的pH值，除此以外，與外界沒有其它的物料交換。分批發(fā)酵是一種操作簡單并且廣泛使用的發(fā)酵方式。分批發(fā)酵中菌體生長規(guī)律及生長參數的數學模型將在第七章已有詳述。工藝變量隨時間而變化是該發(fā)酵方式的主要特征。搖瓶培養(yǎng)也屬分批發(fā)酵.分批發(fā)酵的主要設備是種子培養(yǎng)罐、主發(fā)酵罐、無菌供氣系統(tǒng)和產物分離純化系統(tǒng)。分批發(fā)酵的基本過程如圖1.分批發(fā)酵(BatchFermentation)第7頁/共37頁2.補料分批發(fā)酵(Fed-batchFermentation)

以某種方式定時向培養(yǎng)系統(tǒng)補加一定營養(yǎng)物質的發(fā)酵方式稱為補料分批發(fā)酵。它是介于分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵之間的發(fā)酵形式。定時補料的同時并不向外排放發(fā)酵液，所以使發(fā)酵系統(tǒng)不再封閉，且培養(yǎng)液體積隨時間和物料流速而變化。由于營養(yǎng)底物緩慢補入，既滿足微生物生長和產物合成的持續(xù)需要，又避免了由于底物基質過量所引起的各種調控反應。

定時補充物料，可使培養(yǎng)液中的底物濃度較長時間地保持在一定的范圍內，既保證了微生物生長，又不會產生不利影響，從而達到提高容量產率、產物濃度和得率的目的。補料技術可以采用少量多次、少次多量、流加或微機控制流加；整個發(fā)酵過程中不斷地調節(jié)補料率，維持各項物質的供需平衡。根據補入物料的組成可將補料分批發(fā)酵分為完全補料發(fā)酵和半分批補料發(fā)酵。完全補料發(fā)酵是補入成分完全的培養(yǎng)基。半分批補料發(fā)酵是僅補入一種或幾種限制性營養(yǎng)成分。第8頁/共37頁3.連續(xù)發(fā)酵(ContinuousFermentation)

連續(xù)發(fā)酵是指以一定的速度向培養(yǎng)系統(tǒng)內添加新鮮的培養(yǎng)基，同時以相同的速度流出培養(yǎng)液，從而使培養(yǎng)系統(tǒng)內培養(yǎng)液的體積維持恒定，使微生物細胞處于近似恒定狀態(tài)下生長的微生物發(fā)酵方式。下圖為典型的實驗室連續(xù)發(fā)酵系統(tǒng)。

連續(xù)發(fā)酵的最大特點是微生物細胞的生長速度、產物的代謝均處于恒定狀態(tài)，可達到穩(wěn)定、高速培養(yǎng)微生物細胞或產生大量代謝產物的目的。第9頁/共37頁4.固態(tài)發(fā)酵(SolidStateFermentation)

固態(tài)發(fā)酵是指微生物在沒有游離水或幾乎沒有游離水的較濕的固態(tài)培養(yǎng)基上的發(fā)酵過程。固態(tài)的濕培養(yǎng)基一般根據成分不同控制含水量在40-80％左右，無游離水流出。農村的堆肥、青飼料發(fā)酵和釀酒制曲，就是典型的固態(tài)發(fā)酵。特別是我國工藝歷史悠久、國際著名的白酒生產都有自己獨特的固態(tài)發(fā)酵工藝過程。由于固態(tài)發(fā)酵方式節(jié)能、環(huán)保，近來又得到了人們的青睞。如：以產朊假絲酵母（Candidautilis）、面包酵母（Saccharomycescerevisiae）和啤酒酵母（Saccharomycescarlsbergensis）為復合發(fā)酵菌種，以麩皮、大豆餅和少量脫毒棉籽餅為原料，經固態(tài)發(fā)酵法生產飼料蛋白添加劑得到快速發(fā)展。伴隨著發(fā)酵工程機械化、自動化、化工技術和設備的改進，在傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵的基礎上發(fā)展到現在的固態(tài)發(fā)酵。第10頁/共37頁

現代固態(tài)發(fā)酵和傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵的比較性質現代固態(tài)發(fā)酵傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵反應器在密閉的固態(tài)發(fā)酵反應器中進行在極為簡單的發(fā)酵容器中進行或敞口式固態(tài)發(fā)酵菌種采用單一純種菌株或混合菌株發(fā)酵基本是自然富集發(fā)酵或強化菌種發(fā)酵范圍擴大了固態(tài)發(fā)酵的運用范圍限于傳統(tǒng)食品的生產能耗操作能耗高，設備投資較大操作能耗低，設備投資小，勞動強度大原料需要無菌處理發(fā)酵原料可直接利用價格低廉的糧食和纖維素原料，分離適宜于分離純化高附加值產品產品處理一般較簡單，可直接烘干第11頁/共37頁

固態(tài)發(fā)酵生物活性物質生理活性物質微生物底物伴孢晶體（細菌內毒素）蘇云金芽胞桿菌（Bacillusthuringiensis)椰子果渣赤霉素藤倉赤菌(Gibberellafujikuroi)，串珠鐮孢(Fusariummoniliforme)麩皮，玉米穗，木薯粉，甘蔗渣等赭曲毒素赭曲霉(A.ochraceus)，鮮綠曲霉(P.viridicatum)大麥，大米，玉米土霉素龜裂鏈霉菌(Streptomyces,rimosus)玉米穗麥角類生物堿串珠鐮孢(Fusariummoniliforme)甘蔗渣頭孢霉素頂頭孢霉(Cephalosporiumacremonium)大麥粒頭丙菌素帶小棒鏈霉菌(Streptomycesclavuligerus)向日葵種子枯草菌溶血素枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)豆渣環(huán)孢素絲狀真菌(Tolypocladiuminflatum)麩皮抗真菌素枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)黏土及稻草復合培養(yǎng)基綠僵菌素金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)大米糠第12頁/共37頁

固態(tài)發(fā)酵和液體發(fā)酵是微生物發(fā)酵的兩大技術領域，各具特征，并存在著明顯的區(qū)別。固態(tài)發(fā)酵投資少，設備簡單，操作容易可因陋就簡，因地制宜地利用農副產品以及下腳料作為原料進行生產。液體發(fā)酵適合菌體生長和物質傳遞，發(fā)酵在均質條件下進行，便于控制，液體輸送方便易于機械化操作，產品易精制?同時，液體發(fā)酵設備占地少，容量大，可自動化控制，適合大規(guī)模生產，具有很大的優(yōu)勢。但是，如能解決好固態(tài)發(fā)酵的設備問題，固態(tài)發(fā)酵也將會發(fā)揮出更大的作用。第13頁/共37頁

5.高密度發(fā)酵(HighCellDensityFermentation)

微生物代謝產物的合成完全是靠菌體作為生產者來實現的。菌體量越多產物的產量也越大。因此，通過發(fā)酵工程實現高密度微生物細胞培養(yǎng)則是發(fā)酵的最終要求。采用一定的工藝技術實現了高密度發(fā)酵，它不僅使發(fā)酵液的菌體濃度比分批發(fā)酵提高了10倍以上，而且使菌體的生產能力也處于最佳狀態(tài)，并能消除有害代謝物對菌體正常發(fā)酵的影響。高密度發(fā)酵較分批發(fā)酵有顯著的技術優(yōu)勢。表15-4列舉了幾種微生物的高密度發(fā)酵結果。

菌種基礎培養(yǎng)基發(fā)酵罐補料方法細胞干重(g/L)培養(yǎng)時間(h)

大腸桿菌葡萄糖礦物攪拌罐葡萄糖（甘油）140-15030-40

鹽或甘油礦物鹽非限制指數補料枯草桿菌含葡萄糖的完全攪拌罐補料分批培養(yǎng)18530培養(yǎng)基補加葡萄糖調節(jié)pH畢氏酵母葡萄糖，礦物鹽攪拌罐補料分批培養(yǎng)，10050-120補加甲醇

高細胞密度發(fā)酵成功的實例第14頁/共37頁

高密度發(fā)酵生物反應器有常用的攪拌罐和帶有外置式或內置式細胞持留裝置的反應器，如透析膜反應器、氣升式反應器、氣旋式反應器等。日本人鈴木等用攪拌陶瓷膜反應器系統(tǒng)實現乳酸桿菌高密度培養(yǎng)，其陶瓷過濾器可從發(fā)酵液中去除抑制生長的代謝副產物。日本人內野等采用內外兩個圓筒的膜透析反應器，能連續(xù)去除抑制性代謝產物，始終保持菌體生長繁殖。補料技術常用于高密度發(fā)酵，對提高菌體密度效果明顯。有人采用三階段式流加葡萄糖，高密度培養(yǎng)大腸桿菌重組菌株（YK537/pDH-B2m），菌體密度達到53OD600，骨形成蛋白（BMP-2A）產量達到2.78g/L。但有些菌體高密度發(fā)酵菌體濃度較理論濃度尚有距離，仍需深入研究。第15頁/共37頁6.基因工程菌的發(fā)酵(Recombinantstrainfermentation)

分子生物學技術特別是重組DNA技術的快速發(fā)展，眾多的基因工程產品相繼問世。下表列舉了部分基因工程菌發(fā)酵產生的藥物及其用途。工程菌常以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、某些假單胞菌、酵母菌、哺乳動物細胞等作為外源基因受體，其發(fā)酵培養(yǎng)與普通菌種的好氣培養(yǎng)沒有本質的差異。基因工程菌通常采用二階段發(fā)酵培養(yǎng)工藝，先在一定時間內提高菌體濃度，其后添加誘導物或改變培養(yǎng)溫度而誘導外源基因的產物表達，并以綜合評價決定產物表達的最佳誘導條件。基因工程技術日臻成熟，所構建的工程菌已實現發(fā)酵生產，很多產品已投放市場。如：胰島素、干擾素、生長激素、乙型肝炎疫苗、高產蘇氨酸等。有的基因工程菌其產品產量已高于普通菌種。一種帶有頭孢菌素生物合成限制性擴環(huán)酶外源基因的工程菌，其頭孢菌素C的產量比原有菌種提高了15%。下表列舉了部分基因工程菌發(fā)酵產生的藥物及其用途第16頁/共37頁重組原核微生物生產的部分蛋白藥物

藥物名稱用途α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin)促腎上腺皮質激素(adrenocorticotrophichormone)B細胞生長因子(B-cellgrowthfactor)降鈣素(calcitonin)集落刺激因子(colonystimulatingfactor)絨毛膜促性腺激素(chorionicgonadotropin)內啡肽和腦啡肽(edorphineandenkephalin)上皮生長因子(epidermalgrowthfactor)紅細胞生成素(erythropoietin)凝血因子VIII(factorVIII)凝血因子IX(factorIX)生長激素(growthhormone)生長激素釋放因子(growthhormonereleasingfactor)胰島素(insulin)干擾素(interferon)白細胞介素(interleukin)淋巴細胞毒素(lymphotoxin)巨噬細胞激活因子(macrophageactivatingfactor)神經生長因子(nervegrowthfactor)血小板衍生長因子(plaelet-derivedgrowthfactor)松弛素(relaxin)血清白蛋白(serumalbumin)生長調節(jié)素(somatomedinC)組織型纖溶酶原激活劑(tissueplasminogenactivator)腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor)尿抑胃素(urogastrone)尿激酶(urokinase)治療肺氣腫治療風濕治療免疫系統(tǒng)功能失調治療軟骨病治療血液病治療不排卵癥鎮(zhèn)痛劑促進傷口愈合治療貧血治療血友病治療血友病促進生長促進生長治療糖尿病抗病毒抗腫瘤治療癌癥抗腫瘤抗腫瘤促進神經系統(tǒng)損傷的修復治療動脈粥樣硬化助產劑血漿補充物促進生長溶栓劑抗腫瘤，抗?jié)兯幬锶芩▌┑?7頁/共37頁

1.現代發(fā)酵技術的特點:

(1)發(fā)酵工程與化學工程更緊密的結合;(2)發(fā)展酶，細胞的固定化技術。

(3)遺傳工程技術的應用，使得定向育種真正成為可能

(4)計算機等自控技術的應用，提高了整體水平

2.典型的發(fā)酵生產過程（見下頁圖）:

(1)原料的予處理:

淀粉質原料:

a.酸解:

原料(淀粉+水+HCL)調漿--(加熱)糖化冷卻中和,脫色過慮除菌糖液。

b.酶解:

原料(淀粉+水)調漿(加酶加熱)液化降溫(加酶加熱)糖化糖液?

糖蜜類原料:

a.酵母生產:

濃糖蜜(40Be0)稀釋至17--18Be0酸化(pH3.9)水解(0.1MPa,5min)石灰乳調

pH(4.4--4.8)靜止24h沉淀與上清上清液中加營養(yǎng)鹽滅菌

b.檸檬酸發(fā)酵:濃糖蜜(40Be0)稀釋1倍加熱(50--550C)加濃H2SO4(1%)加熱(大于900C,10min)

澄清沉淀

取上清液稀釋至含糖11%加NH4NO3(0.15%)滅菌二.微生物發(fā)酵的一般過程

第18頁/共37頁原料原始菌種預處理（粉碎，水解，除雜）斜面種子（活化）（一級種子）配料種子擴大培養(yǎng)（搖瓶或茄瓶）（二級種子）

滅菌種子罐（一級發(fā)酵）開放式、密閉式發(fā)酵罐（二級發(fā)酵）半密閉式控制發(fā)酵條件并進行發(fā)醇過程檢查過濾，離心、蒸餾，萃取產品提取沉淀、離交，結晶、千燥質量檢查

成品

一般發(fā)酵工藝的全過程簡圖第19頁/共37頁第20頁/共37頁典型的分批微生物反應工藝流程圖第21頁/共37頁(2)種子擴大培養(yǎng):

a.

固體發(fā)酵:活化斜面三角瓶發(fā)酵原料

b.

好氣性液體發(fā)酵:活化斜面搖瓶液體種子（或茄型瓶種子）種子罐（1，2級)發(fā)酵罐。

c.

厭氣液體發(fā)酵:靜止培養(yǎng)法（以丙酮丁醇發(fā)酵為例）

活化斜面不同水平三角瓶的逐級培養(yǎng)(20mL100mL500mL)--6L卡氏瓶200L卡氏罐5000L發(fā)酵罐

(3)基本操作方式:

a.

分批操作(間歇操作):

b.

半分批操作(流加法),反復半分批操作(反復流加法):

c.

連續(xù)操作:

(4)產品的分離提?。ê筇幚恚?

a.

酵母生產:發(fā)酵液連續(xù)離心板框過慮干燥?

b.

味精生產:發(fā)酵液離子交換濃縮結晶洗滌重結晶干燥篩分?

c.

酶制劑:發(fā)酵液噴霧干燥(粗品)?

d.

酒精與丙酮丁醇:醪液蒸溜(粗,精)?

e.

檸檬酸:發(fā)酵液加熱板框過慮CaCO3中和H2SO4酸解,活性碳脫色離子交換濃縮結晶干燥第22頁/共37頁第23頁/共37頁

三.發(fā)酵生產中的種子質量控制

1.種子培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件:

種子培養(yǎng)基:能保證在生產中獲得大量優(yōu)質孢子或營養(yǎng)細胞，對于種子培養(yǎng)基的要求:

①營養(yǎng)成分完整，豐富，氮源比例高;

②原料較精，總濃度較低;

③主要成分盡可能同發(fā)酵培養(yǎng)基一致；

④pH較穩(wěn)定利于菌體正常生長和發(fā)育。

培養(yǎng)條件:

適當控制pH溫度，通氣和攪拌等條件，盡可能與發(fā)酵罐的起始條件相似。

2.對接種物的一般要求:

①具有旺盛的增殖能力，達到較高的菌體濃度；

②純度高，個體整齊，同步率高，生理活性強，無雜菌?

③性能穩(wěn)定，不易變異，退化

質量判斷:pH,菌體形態(tài)，菌體濃度，產物量，酶活性，培養(yǎng)液外觀

3.影響種子質量的因素:

①原材料質量；②培養(yǎng)條件；③溫度；④濕度；⑤通氣量；

⑥斜面冷藏時間；⑦培養(yǎng)基；⑧pH值等。第24頁/共37頁4.種子質量的控制

①種令，種子罐數，接種量；在種子生理狀態(tài)和培養(yǎng)條件相同時

②菌種穩(wěn)定性檢查；接種量越大發(fā)酵延滯期越短。

③雜菌檢查；④接種技術

5.決定種子擴大級數的因素

①菌種的增殖速度；②最低接種量;

③發(fā)酵規(guī)模；④種子罐與發(fā)酵罐的容積比

6.種子制備的放大原理與技術

種子擴大培養(yǎng)的主要目的：是為了獲得大量的活力強的種子，以便在發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)過程中盡可能地縮短延遲期。延遲期的長短與種子的接種量、接種齡及其生理條件的影響。種子最好采用處于對數生長期的菌種。此時的微生物細胞具有較強的代謝活力。種齡對于能生成芽孢的種子尤為重要。（因為芽孢是在對數生長后期開始形成的，如接種物中含有大量芽孢，則給隨后的發(fā)酵帶來較長的延遲期）。兩個例子如下：

枯草芽孢桿菌生產桿菌肽發(fā)酵時種子擴大培養(yǎng)的程序

梭狀芽孢桿菌進行丙酮丁醇發(fā)酵時種子擴大培養(yǎng)的程序第25頁/共37頁枯草芽孢桿菌生產桿菌肽發(fā)酵時種子擴大培養(yǎng)的程序

級數培養(yǎng)條件培養(yǎng)時間

1保藏菌種4.0L搖瓶18-24h2一級培養(yǎng)物750L罐6h3二級培養(yǎng)物6000L罐培養(yǎng)形成最大生物量

4三級培養(yǎng)物12000L罐培養(yǎng)形成最大生物量第26頁/共37頁

梭狀芽孢桿菌進行丙酮丁醇發(fā)酵時種子擴大培養(yǎng)的程序

級數培養(yǎng)條件培養(yǎng)基

1保藏菌種接種后培養(yǎng)24h馬鈴薯葡萄糖肉湯

2一級培養(yǎng)物600mL20-24h糖4%，硫酸銨5%，碳酸鈣6%P2O5(以磷酸鹽形式提供)390mL二級含有3000mL液體錐形瓶同二級

4三級培養(yǎng)物25000L罐糖6%其余同二級

5四級300000–500000L罐同四級，發(fā)酵中補充氨水接種量0.5–3%第27頁/共37頁

四.發(fā)酵培養(yǎng)基

1.概念；發(fā)酵培養(yǎng)基是供菌種生長、繁殖和合成產物之用。既要使種子接種后能迅速生長，達到一定的菌濃，又要使長好的菌體迅速合成產物。2.發(fā)酵培養(yǎng)基的特點；

1)要求發(fā)酵培養(yǎng)基的組成應豐富、完全，碳、氮源要注意速效和遲效的互相搭配，少用速效營養(yǎng)，多加遲效營養(yǎng)；

2)還要考慮適當的碳氮比，

3)加緩沖劑穩(wěn)定pH值；

4)要有菌體生長所需的生長因子和產物合成所需要的元素、前體和促進劑等。

5)除有菌體生長所必需的元素和化合物外，還要有產物所需的特定元素、前體和促進劑等。

6)若因生長和生物合成產物需要的總的碳源、氮源、磷源等的濃度太高，或生長和合成兩階段各需的最佳條件要求不同時，則可考慮培養(yǎng)基用分批補料來加以滿足。3.發(fā)酵培養(yǎng)基的組成

1）碳源

主要功能：①為菌體的生長繁殖提供能源和合成菌體所

必需的成分；

②為合成目的產物提供所需的碳素成分第28頁/共37頁2）氮源

有機氮源：豆餅（粕）粉、花生餅粉、魚粉、蠶蛹粉、酵母粉、玉米漿、尿素等無機氮源：銨鹽、硝酸鹽等

3）無機鹽和微量元素

磷酸鹽、

硫酸鎂、鉀鹽、

微量元素

4）生長因子

微生物生長不可缺少的微量有機物質。包括維生素、氨基酸、嘌呤嘧啶及其衍生物并非所有微生物都必需，只是對于某些自己不能合成這些成分的微生物才是必不可少的營養(yǎng)物質。

5）前體（precursor）是在代謝產物合成過程中加入的直接或間接結合至產物分子中的小分子物質。有些前體物質由菌體本身合成。如纈氨酸和半胱氨酸是青霉素的前體。

6）誘導物（inducer）是促進某反應發(fā)生或者促進某基因轉錄的物質。有些半乳糖苷可使大腸桿菌-半乳糖苷酶的產量增加1000倍，用甘露糖代替可阻遏碳源半乳糖，使有的菌株產生的纖維素酶增加1500倍

7）促進劑（promoter）是發(fā)酵過程中加入的能增進產物生成速率或促進產物得率的一些微量化學物質，一般與營養(yǎng)作用無關。促進劑促進產物合成的機理是多方面的，包括影響酶活性，如Mg2+具有激活鏈霉素、新霉素的激酶活性，二甲基亞砜有效刺激芽孢桿菌、曲霉屬、酵母屬等菌體的生長。

4.培養(yǎng)基的設計和最優(yōu)化

將在第五章中介紹響應面法

第29頁/共37頁五.發(fā)酵過程中的中間分析

1.分析項目:

發(fā)酵過程的分析項目包括物理指標、理化指標、化學指標和生物指標。物理指標包括溫度、壓力、體積、流量等。理化指標包括pH、溶氧、溶CO2、氧化還原電位、氣相成分分析等?；瘜W測量項目包括基質濃度、前體濃度和產物濃度的變化等。生物生化項目包括生物量、細胞形態(tài)、酶活性、胞內成分等。常見的發(fā)酵過程變量檢測指標見表。

第30頁/共37頁變量測量方法測量原理測定意義及作用溫度鉑電阻、熱敏電阻電阻隨溫度變化維持微生物生長與產物合成壓力隔膜、壓敏電阻直接感受、電阻隨壓力變化維持正壓、增加溶氧體積壓差傳感器荷重傳感器靜壓差與液深度成正比傳感器電阻正比于荷重了解菌體生長狀況泡沫電導或電容探頭與液面及電磁閥成回路反映發(fā)酵和代謝情況氣體流量熱質量流量計氣體帶走熱與流量成正比供氧、排泄廢氣、增加Kla液體流量蠕動泵轉速與流量成正比間接反映發(fā)酵液的狀態(tài)及菌體生長和產物合成情況攪拌轉速頻率計數器光反射計數感應電流與轉速成正比物料混合、提高Kla體積氧傳遞系數Kla間接計算利用原電池型氧電極進行測定反映供氧效率，表征發(fā)酵罐的通氣情況pH玻璃電極電極對氫離子特異反應了解菌體生長和產物合成信息溶氧復膜氧探頭氧在電極轉移產生電流反映氧供應情況溶CO2CO2探頭擴散引起電解液pH變化了解菌的呼吸情況尾氣氧濃度傳感器氧在電極轉移產生電流了解耗氧情況尾氣CO2濃度CO2紅外分析儀CO2吸收紅外光了解菌的呼吸狀況氣相成分質譜離子化后的質/荷比了解菌代謝情況粘度旋轉黏度儀剪應力、剪速和黏度相關性反映發(fā)酵液及產物的特性發(fā)酵過程變量檢測指標（一）

第31頁/共37頁變量測量方法測量原理測定意義及作用生物量濁度法熒光法入射光細胞散射衰減細胞NADH被紫外激發(fā)了解菌生長情況基質和代謝物濃度高效液相色譜（HPLC）溶質在固定相和流動相兩相間進行分配并分離了解生長和產物合成情況DNA、RNA含量光密度測定法DNA和RNA在260nm處有一很高的吸收峰了解菌生長繁殖情況ATP、ADP、AMP高效液相色譜（HPLC）溶質在固定相和流動相兩相間進行分配并分離了解菌能量代謝情況NADH化學測定NADH在340nm波長處有吸收峰了解發(fā)酵液氧化還原狀態(tài)、細胞代謝活性攝氧率間接計算根據進氣和排氣氧的溶解量進行計算了解耗氧速率呼吸商間接計算根據氧含量和二氧化碳含量的變化進行計算了解菌的代謝途徑氧化還原電位傳感器電極與發(fā)酵液之間產生電位差反映菌代謝情況濁度傳感器細胞密度與吸光值之間的關系反映菌生長狀況比生長速率（）間接計算單位重量細胞在單位時間內增加的量了解細胞生長情況呼吸強度間接計算單位重量細胞對氧氣的利用了解比耗氧速率細胞形態(tài)射像顯微鏡顯微射像技術了解菌生長情況發(fā)酵過程變量檢測指標（二）

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2.發(fā)酵終點判斷:

生產率:kg/m3?h;

得率:kg產物/kg基質(轉化率);

發(fā)酵系數:kg產物/罐容積m3?發(fā)酵周期h

3.放罐時間的確立考慮的因素:

1)提高發(fā)酵生產率，降低成本，不影響產品取質量;

2)放罐前的控制;

3)發(fā)醇異常的處理

a）發(fā)酵液轉稀:現象；粘度下降，泡沫上升，消沫效果減弱;

原因:噬菌體侵染或其它未知因素；?

措施：適時補入適當碳源或氮源促使繁殖新菌體，恢復正常

b）發(fā)酵液過濃:原因：氮源過多，菌體過剩，溶解氧下降;

措施:補入10%無菌水，使菌液濃度下降，粘度下降，改善發(fā)酵條件。

c）耗糖緩慢:原因:種子質量，滅菌質量，磷鹽濃度低。

措施:補入適量合適的氮源，磷鹽，提高發(fā)酵溫度，風量；

d）

pH不正常:原因:滅菌質量，原料質量，水質，通氣，補料；措施：酸或堿調整。菌體形態(tài):種子階段：掌握合適種令，確保優(yōu)質種子；

發(fā)酵階段：觀察生長是否正常，以便選擇合適發(fā)酵條件如果發(fā)現不正常，則設法補救，及時發(fā)現雜菌污染，及早控制或處理。第33頁/共37頁六.主要技術經濟指標

1.發(fā)酵率：表示發(fā)酵過程中化學及生化反應的動態(tài)變化，幾種重