生化反應(yīng)工程酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

生化反應(yīng)工程酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)第一頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)在生物反應(yīng)工程中的地位①生物反應(yīng)動(dòng)力學(xué)②生物反應(yīng)器③生物反應(yīng)過(guò)程的放大與縮小酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)微生物反應(yīng)動(dòng)力學(xué)廢水生物處理反應(yīng)動(dòng)力學(xué)第二頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日2.1

酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的生物學(xué)基礎(chǔ)第三頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日酶的基本概念什么是酶？

酶是生物體為其自身代謝活動(dòng)而產(chǎn)生的生物催化劑?！敖?jīng)典”酶學(xué)理論：酶→蛋白質(zhì)。部分RNA也具有生物催化能力，通常稱之為“核酶”。1982年，美國(guó)T.Cech等人發(fā)現(xiàn)四膜蟲(chóng)的RNA有催化活性，具有自身切接能力。核酶的數(shù)量少，多作用于核酸。第四頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日2.1.1.1酶的分類根據(jù)國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)的規(guī)定，按照酶進(jìn)行催化反應(yīng)的類型，可將酶分為6類：1.氧化還原酶（oxidoreductases）：羰基還原酶；2.轉(zhuǎn)移酶（transferases）：氨基轉(zhuǎn)移酶；3.水解酶（hydrolases）：腈水解酶；4.裂合酶（lyases）：丙酮酸脫羧酶；5.異構(gòu)酶（isomerases）：葡萄糖異構(gòu)酶；6.轉(zhuǎn)接（或合成）酶（ligases)：T4DNA轉(zhuǎn)接酶。蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶？第五頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日2.1.1.2酶的功能酶的催化共性：a、降低反應(yīng)的活化能；b、酶可改變反應(yīng)速率；c、不改變反應(yīng)的平衡常數(shù)。H2O2的分解75.31KJ/mol8.37KJ/mol第六頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日2.1.1.2酶的功能酶的生物催化特性：a、有很強(qiáng)的專一性：底物專一性、反應(yīng)專一性、立體專一性等；b、有較高的催化效率：

比非催化反應(yīng)高108-1020倍；c、酶的調(diào)節(jié)功能：抑制劑和激活劑調(diào)節(jié)、反饋抑制調(diào)節(jié)、

共價(jià)修飾調(diào)節(jié)和變構(gòu)調(diào)節(jié)等酶的催化效率可用酶活表示。酶活的定義：國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)規(guī)定，在一定條件下，1min能催化1umol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需要的酶量為一個(gè)國(guó)際酶活單位（IU)。第七頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日2.1.1.3酶的穩(wěn)定性引起酶失活的原因：a、酶活性中心特定氨基酸（或其它）殘基

被化學(xué)修飾；b、外部環(huán)境的影響；c、酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)變化；d、多肽鏈的斷裂。第八頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日2.1.1.3酶的穩(wěn)定性穩(wěn)定化方法穩(wěn)定的原因低溫（冷凍保存）難以被化學(xué)物質(zhì)或蛋白酶等破壞添加鹽類加入高濃度硫酸銨后，酶高級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性增強(qiáng)添加底物保護(hù)酶的活性中心添加有機(jī)溶劑如加丙酮，但機(jī)制不清楚化學(xué)修飾穩(wěn)定酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)，保護(hù)酶的活性中心加入強(qiáng)變性劑只要保留一級(jí)結(jié)構(gòu)，仍可再生加入蛋白質(zhì)保護(hù)在稀薄狀態(tài)下易發(fā)生變性失活的酶類結(jié)晶化有利于高級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定固定化防止或減少蛋白酶的作用保持酶穩(wěn)定的方法第九頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日2.2均相酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)什么是均相反應(yīng)？指酶與反應(yīng)物系處于同一相（液相）的酶催化反應(yīng)。葡萄糖脫氫酶葡萄糖葡萄糖酸水相第十頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)鎖鑰模型（LockandKeyModel）酶與底物的作用機(jī)理解釋了酶的專一性；局限性：無(wú)法解釋可逆反應(yīng)。第十一頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日酶與底物的作用機(jī)理誘導(dǎo)契合模型（Induced-FitModel）像手與手套的關(guān)系。當(dāng)?shù)孜锝咏傅幕钚灾行牟⑴c之結(jié)合時(shí)，酶的構(gòu)象能發(fā)生改變，更適合于底物的結(jié)合。第十二頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日影響酶促反應(yīng)的因素濃度因素（酶濃度，底物濃度，產(chǎn)物濃度等）外部因素（溫度，pH，壓力，溶液的介電常數(shù)，離子強(qiáng)度等）內(nèi)部因素（酶的結(jié)構(gòu)等）第十三頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日反應(yīng)速率及其測(cè)定若用單位時(shí)間內(nèi)生成物濃度的增加來(lái)表示，則：反應(yīng)速率：?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)反應(yīng)物或生成物濃度的改變。設(shè)瞬時(shí)dt內(nèi)反應(yīng)物濃度的很小的改變?yōu)閐S，則：第十四頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分類----反應(yīng)級(jí)數(shù)①零級(jí)反應(yīng)

反應(yīng)速率與底物的濃度無(wú)關(guān)，稱為零級(jí)反應(yīng)。（[S]-底物濃度，rmax-最大反應(yīng)速率）第十五頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分類----反應(yīng)級(jí)數(shù)②一級(jí)反應(yīng)

反應(yīng)速率與底物濃度的一次方成正比，稱為一級(jí)反應(yīng)。即酶催化A→B的過(guò)程。（[S]-底物濃度，k1-一級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)）第十六頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分類----反應(yīng)級(jí)數(shù)③二級(jí)反應(yīng)反應(yīng)速率與兩個(gè)反應(yīng)物的濃度成正比，稱為二級(jí)反應(yīng)。該反應(yīng)可以是兩個(gè)相同的反應(yīng)物反應(yīng)生成產(chǎn)物（2S→P）；也可以是兩個(gè)不同的反應(yīng)物反應(yīng)生成產(chǎn)物（A＋B→P）。（[S]-底物濃度；[A]、[B]-底物A、B的濃度；k2-二級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)）第十七頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日單底物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)最簡(jiǎn)單的酶促反應(yīng)：?jiǎn)蔚孜锊豢赡婷复俜磻?yīng)。＋k1k-1ESES＋Ek2P反應(yīng)機(jī)制：反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程如何求取？1.Michaelis-Menten快速平衡學(xué)說(shuō)2.Briggs-Haldane穩(wěn)態(tài)學(xué)說(shuō)第十八頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程的推導(dǎo)快速平衡法的幾點(diǎn)假設(shè)條件：底物濃度[S]遠(yuǎn)大于酶的濃度[E]，因此[ES]的形成不會(huì)降低底物濃度[S]，底物濃度以初始濃度計(jì)算。不考慮P+E→ES這個(gè)可逆反應(yīng)的存在。[ES]在反應(yīng)開(kāi)始后與E及S迅速達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡?？焖倨胶鈱W(xué)說(shuō)＋k1k-1ESES＋Ek2P第十九頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日＋k1k-1ESES＋Ek2快速平衡學(xué)說(shuō)由假設(shè)2可得到產(chǎn)物的合成速率為：(2)(1)P由假設(shè)3可得到：第二十頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日反應(yīng)體系中酶量守恒：(3)由前面的公式(2)得：代入公式(3),變換后得：(4)(5)代入公式(1),變換后得：式中：rp,max=k2[E0]:最大反應(yīng)速率如果酶的量發(fā)生改變，最大反應(yīng)速率相應(yīng)改變。KS=k-1/k1:解離常數(shù)，飽和常數(shù)

低KS值意味著酶與底物結(jié)合力越強(qiáng)。

(6)第二十一頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日穩(wěn)態(tài)學(xué)說(shuō)穩(wěn)態(tài)學(xué)說(shuō)的幾點(diǎn)假設(shè)條件：底物濃度[S]遠(yuǎn)大于酶的濃度[E]，因此[ES]的形成不會(huì)降低底物濃度[S]，底物濃度以初始濃度計(jì)算。在反應(yīng)的初始階段，產(chǎn)物濃度很低，P+E→ES這個(gè)可逆反應(yīng)的速率極小，可以忽略不計(jì)。[ES]的生成速率與其解離速率相等，其濃度不隨時(shí)間而變化。＋k1k-1ESES＋Ek2P第二十二頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日Experimentaldatademonstratedtheconcentrationprofiles.當(dāng)反應(yīng)系統(tǒng)中[ES]的生成速率與分解速率相等時(shí)，[ES]濃度保持不變的狀態(tài)稱為穩(wěn)態(tài)。第二十三頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日由于[S]>>[E0]，所以[S]>>[ES],[S]-[ES]≈[S]根據(jù)穩(wěn)態(tài)假說(shuō)，(7)(3)(8)第二十四頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日(Km米氏常數(shù))(9)(10)式中：第二十五頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日對(duì)米氏方程的討論：當(dāng)[S]<<Km時(shí)，，屬一級(jí)反應(yīng)。當(dāng)[S]>>Km時(shí)，，屬零級(jí)反應(yīng)。當(dāng)[S]＝Km時(shí)，。第二十六頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日米氏常數(shù)Km的意義Km值代表反應(yīng)速率達(dá)到rpmax/2時(shí)的底物濃度。Km是酶的一個(gè)特性常數(shù)，Km的大小只與酶的性質(zhì)有關(guān)，而與酶濃度無(wú)關(guān)。但底物種類、反應(yīng)溫度、pH和離子強(qiáng)度等因素會(huì)影響Km值。因此可以用Km值來(lái)鑒別酶。vrmax/2Km[S]第二十七頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日快速平衡穩(wěn)態(tài)假設(shè)①不考慮逆反應(yīng)的存在。即：②ES在反應(yīng)開(kāi)始后與E及S迅速達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。②ES的生成速率與其解離速率相等，其濃度不隨而變化。③底物濃度遠(yuǎn)高于酶的濃度。[S]>>[E]酶量守恒

產(chǎn)物生成速率動(dòng)力學(xué)方程

與第二十八頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日動(dòng)力學(xué)參數(shù)的求解對(duì)rmax和Km的確定的方法有：Lineweaver-Burk法；Hanes-Woolf法；Eadie-Hofstee法；

積分法等。第二十九頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日Linewever-Burk雙倒數(shù)法將米氏方程式兩側(cè)取雙倒數(shù)，得到下列方程式：以作圖,得到一直線缺點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)點(diǎn)過(guò)分集中在直線的左下方，影響Km和Vmax的準(zhǔn)確測(cè)定。第三十頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日例：在pH5.1、15℃下所測(cè)定的用葡萄糖淀粉酶水解麥芽糖的反應(yīng)初速度V0如表所示。求這一酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)rmax和Km

。表1-1葡萄糖淀粉酶水解麥芽糖的反應(yīng)初速度與底物濃度[S]（mmol/L）V0（mmol/L·min）5.550.1638.330.21111.110.24113.890.27616.660.30122.220.33927.770.347第三十一頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日

解：采用Lineweaver-Burk法，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)回歸，有則

第三十二頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日2.2.2.2操作參數(shù)對(duì)酶促反應(yīng)的影響①pH改變可破壞酶的空間構(gòu)象，引起酶活的喪失。②pH的改變影響酶活性中心催化基團(tuán)的解離，從而使得底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物的過(guò)程受到影響。③pH的改變影響活性中心結(jié)合基團(tuán)的解離狀態(tài)，使得底物不能與其結(jié)合或者結(jié)合后不能生成產(chǎn)物。pH對(duì)酶反應(yīng)速度的影響第三十三頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日2.2.2.2操作參數(shù)對(duì)酶促反應(yīng)的影響

溫度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響A、在一定范圍內(nèi)，當(dāng)溫度升高時(shí)，與一般的化學(xué)反應(yīng)一樣，反應(yīng)速度加快。

B、當(dāng)溫度過(guò)高，會(huì)導(dǎo)致酶的變性，從而失去活性。第三十四頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)速率的影響失活與抑制

【失活】(inactivation)：由于酶蛋白分子變性而引起的酶活力喪失的現(xiàn)象稱為失活。

【抑制】(inhibition)：由于酶的必需基團(tuán)化學(xué)性質(zhì)的改變，但酶未變性，而引起酶活力的降低或喪失，稱為抑制作用。第三十五頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日競(jìng)爭(zhēng)性抑制非競(jìng)爭(zhēng)性抑制反競(jìng)爭(zhēng)性抑制可逆抑制【可逆抑制】(reversibleinhibition)：抑制劑與酶以非共價(jià)鍵結(jié)合而引起酶活力降低或喪失，能用物理方法除去抑制劑而使酶復(fù)性，這種抑制作用是可逆的，稱為可逆抑制?！静豢赡嬉种啤浚喝绻种苿┡c酶的基團(tuán)成共價(jià)結(jié)合，則此時(shí)不能用物理方法去掉抑制劑。此類抑制可使酶永久性地失活。例如：重金屬離子對(duì)酶的抑制作用。不可逆抑制抑制可逆抑制和不可逆抑制第三十六頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日競(jìng)爭(zhēng)性抑制(competitiveinhibitions)ESIEIXPE+S+I[ES]E+P[EI]K3K1K-1K2K-3當(dāng)反應(yīng)物系中存在與底物的結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)，這一物質(zhì)也可能與酶的活性部位結(jié)合，形成非活性的復(fù)合物，阻礙了酶與底物的結(jié)合，從而影響酶促反應(yīng)，這種抑制作用稱為競(jìng)爭(zhēng)性抑制。第三十七頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日1、抑制劑是底物的類似物；2、提高底物濃度可消除競(jìng)爭(zhēng)性抑制。競(jìng)爭(zhēng)性抑制(competitiveinhibitions)第三十八頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日非競(jìng)爭(zhēng)性抑制(Non-competitiveInhibitions)E+S+I[ES]+IE+P[EI]+S[ESI]K1Km’KIKIK-1K2當(dāng)反應(yīng)物系中存在與酶的活性部位以外相結(jié)合，且這一結(jié)合與底物的結(jié)合無(wú)競(jìng)爭(zhēng)性關(guān)系的抑制作用稱為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。ESEISIXP第三十九頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日與競(jìng)爭(zhēng)性抑制相比較，當(dāng)有非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑時(shí)，無(wú)論如何提高底物的濃度也不會(huì)消除其抑制作用。非競(jìng)爭(zhēng)性抑制(Non-competitiveInhibitions)第四十頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日反競(jìng)爭(zhēng)性抑制(UncompetitiveInhibitions)SEI+ESESIXP這種抑制劑僅能與ES復(fù)合物結(jié)合，而與游離酶不能直接結(jié)合。E+S[ES]+IE+P[ESI]K1KIK-1K2第四十一頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日各種抑制的比較競(jìng)爭(zhēng)性抑制非競(jìng)爭(zhēng)性抑制反競(jìng)爭(zhēng)性抑制Vmax不變減小減小Km增大不變減小第四十二頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日EE底物抑制(SubstrateInhibitions)S+SXPSESS底物抑制：對(duì)于某些酶促反應(yīng)，當(dāng)?shù)孜餄舛容^高時(shí)，反應(yīng)速率呈下降趨勢(shì)，稱為底物抑制。E+S[ES]+SE+P[ESS]K1KSIK-1k2應(yīng)用穩(wěn)態(tài)理論，可得到底物抑制的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程為第四十三頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日產(chǎn)物抑制(productinhibitions)EESEPPSPE+S+P[ES]E+P[EP]Km’KPk2產(chǎn)物抑制：酶促反應(yīng)中，有時(shí)隨產(chǎn)物濃度提高，產(chǎn)物與酶形成復(fù)合物，阻礙了底物與酶的結(jié)合，從而降低了酶促反應(yīng)的速度。第四十四頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日多底物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)前面討論的都是指單底物的酶催化反應(yīng)，而實(shí)際酶催化反應(yīng)更復(fù)雜，可用下列通式表示：A+B+C+…=P+Q+R+…這里僅討論雙底物的酶促反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)過(guò)程中形成的中間復(fù)合物的不同，可分為：順序反應(yīng)機(jī)制;乒乓反應(yīng)機(jī)制。第四十五頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日順序反應(yīng)機(jī)制順序反應(yīng)是指所有底物與酶結(jié)合之后再釋放產(chǎn)物。有序順序反應(yīng)隨機(jī)順序反應(yīng)順序反應(yīng)有序順序反應(yīng)隨機(jī)順序反應(yīng)第四十六頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日乒乓反應(yīng)機(jī)制乒乓反應(yīng)是酶先與一種底物結(jié)合后即釋放一種產(chǎn)物，酶發(fā)生了必要的變構(gòu)，然后再結(jié)合另一種底物，再釋放一種產(chǎn)物，釋放產(chǎn)物之后酶一般恢復(fù)為最初狀態(tài)。QAPB第四十七頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日各種抑制的比較Km抑制抑制競(jìng)爭(zhēng)性反競(jìng)爭(zhēng)性非競(jìng)爭(zhēng)性Vmax抑制變大不變不變變小變小變小第四十八頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日2.3

固定化酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)第四十九頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日2.3.1固定化酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)2個(gè)W和1個(gè)H?What?什么是固定化酶？

固定化酶：水溶性酶通過(guò)物理和化學(xué)的方法，使之與不溶性載體結(jié)合形成的一種不再溶解的酶。酶的固定化技術(shù)：是將水溶性的酶分子通過(guò)一定的方式，如靜電吸附，共價(jià)鍵等與載體，如角叉菜膠、離子交換樹(shù)脂等材料，制成固相酶的技術(shù)。第五十頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日2.3.1固定化酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)2個(gè)W和1個(gè)H?Why?為什么要固定化？

生物工業(yè)用酶大多為水溶性，酶促反應(yīng)體系為均相體系，均相體系簡(jiǎn)單，但存在一個(gè)缺點(diǎn)，就是酶難以回收利用，同時(shí)，酶和產(chǎn)物混在一起，給產(chǎn)物的提取帶來(lái)困難。解決此問(wèn)題可采用酶的固定化技術(shù)。第五十一頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日2.3.1固定化酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)2個(gè)W和1個(gè)H?HOW?如何進(jìn)行固定化？

載體結(jié)合法

交聯(lián)法

包埋法

第五十二頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日1.載體結(jié)合法制備固定化酶

定義：將酶利用共價(jià)鍵或離子鍵、物理吸附等方法結(jié)合于不溶性載體上的固定化方法。按載體結(jié)合形式分為：

共價(jià)鍵結(jié)合法離子鍵結(jié)合法物理吸附法第五十三頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日載體結(jié)合法——共價(jià)鍵結(jié)合法

酶與不溶于水的載體以共價(jià)鍵形式結(jié)合制備固定化酶的方法。即，通過(guò)化學(xué)共價(jià)鍵，把與酶蛋白活性無(wú)關(guān)的氨基酸功能基團(tuán)連接在不溶于水的載體上。優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：酶與載體結(jié)合較牢固，不易脫落，有利于長(zhǎng)時(shí)間使用。缺點(diǎn)：制備條件復(fù)雜，酶蛋白活性中心易破壞。第五十四頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日酶與具有離子交換基團(tuán)的不溶性載體結(jié)合形成固定化酶。常用載體：纖維素的衍生物，離子交換樹(shù)脂。載體結(jié)合法——離子鍵結(jié)合法優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，處理?xiàng)l件溫和，酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)和活性中心不易破壞，有利于制備高活性酶。缺點(diǎn)：載體與酶的結(jié)合力較弱，在高離子強(qiáng)度下酶易從載體上脫落。優(yōu)缺點(diǎn)：第五十五頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日優(yōu)點(diǎn)：酶蛋白活性中心不易被破壞，完整保持酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)；方法簡(jiǎn)單，成本低。缺點(diǎn)：酶吸附不牢固，易脫落；防止吸附的酶蛋白質(zhì)與載體發(fā)生變性反應(yīng)。載體結(jié)合法——物理吸附法通過(guò)物理吸附或靜電引力將酶吸附在活性炭、氧化鋁、離子交換樹(shù)脂等具有活潑表面的載體上。常用載體：無(wú)機(jī)物：活性炭、白陶土、氧化鋁、多孔玻璃、硅膠、碳酸鈣凝膠。有機(jī)物高分子化合物：淀粉麩質(zhì)、大孔樹(shù)脂、DEAE纖維素、DEAE葡聚糖凝膠。優(yōu)缺點(diǎn)：第五十六頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日定義：將酶包埋在凝膠的微細(xì)格子中或被半透性的聚合膜所包埋，使酶分子不能從凝膠的網(wǎng)絡(luò)中漏出，而小分子的底物和產(chǎn)物可自由通過(guò)凝膠網(wǎng)絡(luò)的固定化方法。包埋方法有兩種：格子型微膠囊型2.包埋法制備固定化酶第五十七頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日原理：

以丙烯酰胺、硅膠、淀粉瓊脂等材料，在酶存在下聚合成凝膠，酶被包埋在聚合物的細(xì)小多孔的網(wǎng)狀格子中。包埋法——格子型固定化酶第五十八頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日原理：

把酶包在超薄半透性的聚合物膜中，制成球狀含酶微型膠囊。包埋法——微型膠囊法第五十九頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日特點(diǎn)：微囊直徑幾微米～幾百微米。低分子底物可以自由通過(guò)并進(jìn)入微囊內(nèi)。與酶反應(yīng)后的生成物被排除在微囊外，酶本身是高分子物質(zhì)不能通過(guò)微囊而被留在微囊中，外部的蛋白分解酶、抗體等高分子物質(zhì)也無(wú)法進(jìn)入微囊內(nèi)。包埋法——微型膠囊法第六十頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日定義：雙功能試劑或多功能試劑與酶蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基作用，使酶與酶之間交聯(lián)成網(wǎng)，凝集成固定化酶的方法。發(fā)生作用的氨基酸殘基：：酪氨酸的酚基半胱氨酸的巰基

N－末端的a－氨基常用的雙功能或多功能試劑：：

戊二醛聚甲叉雙碘乙酰胺雙重氮聯(lián)苯胺3.交聯(lián)法制備固定化酶第六十一頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日固定化酶的制法及其特性比較

特性制備方法共價(jià)鍵結(jié)合法離子結(jié)合法物理吸附法包埋法制備方法難易易難酶活力高高高低底物特異性易變不變不變不變結(jié)合能力強(qiáng)中弱弱再生不可可能可能不可交聯(lián)法難中易變強(qiáng)不可第六十二頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日酶固定化后的性質(zhì)變化底物專一性的改變穩(wěn)定性增強(qiáng)

熱穩(wěn)定性、保存和使用穩(wěn)定性。最適pH值和最適溫度變化

酶固定化后，酶蛋白質(zhì)的電子狀態(tài)會(huì)發(fā)生改變，載體表面的電位受影響。動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化固定化酶有利于實(shí)現(xiàn)酶促反應(yīng)的連續(xù)化和自動(dòng)控制。第六十三頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日固定化酶反應(yīng)歷程微膠囊包埋法固定化酶為例底物傳遞至載體外表面；底物由外表面向內(nèi)擴(kuò)散；酶促反應(yīng)；產(chǎn)物由內(nèi)向外表面擴(kuò)散；產(chǎn)物傳遞到流體主體。固定化酶的催化反應(yīng)受兩方面影響：物質(zhì)傳遞和酶促反應(yīng)。第六十四頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日影響固定化酶促反應(yīng)的主要因素分子構(gòu)象的改變（常見(jiàn)于吸附法和共價(jià)偶聯(lián)法）位阻效應(yīng)微擾效應(yīng)分配效應(yīng)（可用Kp定量描述）第六十五頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日

分配系數(shù)：載體內(nèi)外底物(或其他物質(zhì))濃度之比。

Kp=Csi/Cso

Kp的測(cè)定：已知底物濃度(CS)，體積(V0)的溶液中，放入不含底物的一定體積的載體，并保持適宜條件，當(dāng)達(dá)到平衡時(shí)，測(cè)定載體外溶液的底物濃度(Cso)。分配系數(shù)(Kp)Csi:微環(huán)境的底物濃度；Cso:界面外的底物濃度。第六十六頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日影響固定化酶促反應(yīng)的主要因素分子構(gòu)象的改變（常見(jiàn)于吸附法和共價(jià)偶聯(lián)法）位阻效應(yīng)微擾效應(yīng)分配效應(yīng)（可用Kp定量描述）擴(kuò)散限制

（可定量描述）第六十七頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日水溶酶本征動(dòng)力學(xué)參數(shù)本征速率和動(dòng)力學(xué)參數(shù)固定化酶構(gòu)象改變、位阻效應(yīng)等分配效應(yīng)固有速率和動(dòng)力學(xué)參數(shù)擴(kuò)散限制表觀速率和動(dòng)力學(xué)參數(shù)本征速率：考慮到固定化后酶分子的結(jié)構(gòu)改變，底物作用及位阻效應(yīng)等諸因素后，固定化酶的反應(yīng)速率稱為本征速率。固有速率：假定底物和產(chǎn)物在酶的微環(huán)境及宏觀環(huán)境之間的傳遞是無(wú)限迅速，也就是在沒(méi)有擴(kuò)散阻力情況下的反應(yīng)速率。不同反應(yīng)速率與參數(shù)及其相互關(guān)系第六十八頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日2.3.2固定化酶促反應(yīng)中的過(guò)程分析2.3.2.1外部擴(kuò)散過(guò)程——以表面固定化酶為例底物由液相主體擴(kuò)散到載體表面的擴(kuò)散速率:式中Vd——底物由液相主體擴(kuò)散到載體表面的擴(kuò)散速率，（mol/L·s）;kL——液膜傳質(zhì)系數(shù)；

a——傳質(zhì)比表面積；

[S]——液相主體的底物濃度,(mol/L)；[S]S——固定化酶表面處底物濃度,(mol/L)。第六十九頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日在載體外表面的酶促反應(yīng)符合M-M方程：式中VS——載體外表面的底物消耗速率，(mol/L·s);

[S]S——載體外表面的底物濃度(mol/L)。第七十頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日

在穩(wěn)定的狀態(tài)下有:

當(dāng)外擴(kuò)散速率很快時(shí)，此時(shí)無(wú)外擴(kuò)散的限制:VS0為在外擴(kuò)散速率很快時(shí)的最大的反應(yīng)速率。第七十一頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日

當(dāng)外擴(kuò)散速率很慢時(shí)，外擴(kuò)散為限制步驟，此時(shí):Vd為在外擴(kuò)散速率很慢時(shí)的最大的傳質(zhì)速率。第七十二頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日

當(dāng)[S]

較低時(shí)，VS0＞Vd為外擴(kuò)散限制，此時(shí)當(dāng)[S]較高時(shí)，VS0＜Vd為反應(yīng)限制，此時(shí)第七十三頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日令：無(wú)因次形式：達(dá)姆科勒準(zhǔn)數(shù)(Da)Da準(zhǔn)數(shù)是C*的函數(shù)，其物理意義是最大反應(yīng)速率與最大傳質(zhì)速率之比。第七十四頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日外擴(kuò)散效率因子(ηout)ηout=有外擴(kuò)散影響時(shí)的實(shí)際反應(yīng)速率無(wú)外擴(kuò)散影響時(shí)的固定化酶外表面的反應(yīng)速率ηout：表示固體催化劑顆粒催化反應(yīng)進(jìn)行的有效程度。ηout===φ(Da)Da準(zhǔn)數(shù)是決定效率因子的唯一參數(shù)，是表征傳質(zhì)過(guò)程對(duì)反應(yīng)速率影響的基本準(zhǔn)數(shù)。第七十五頁(yè)，共八十七頁(yè)，2022年，8月28日當(dāng)Da準(zhǔn)數(shù)愈小，固定化酶表面濃度[S]s愈接近于主體濃度[S]，ηout越接近于1，表明最大傳質(zhì)速率愈大于最大反應(yīng)速率，過(guò)程為反應(yīng)控制；反之，Da準(zhǔn)數(shù)愈大，固定化酶表面濃度[S]s愈小，愈趨近零，ηout越小，表明最大反應(yīng)速率愈大于最大傳質(zhì)速率，過(guò)程為傳質(zhì)控制。討論：第七十六頁(yè)