五章節(jié)目基因克隆

五章節(jié)目基因克隆第1頁/共90頁第五章目的基因的克隆第2頁/共90頁目的基因的克隆D利用PCR分離目的基因的方法CcDNA文庫法A鳥槍法E化學(xué)合成法B基因文庫法第3頁/共90頁基因工程或DNA重組技術(shù)三大用途的前提條件是從生物體基因組中分離克隆目的基因，目的基因獲得之后，或確定其表達(dá)調(diào)控機(jī)制和生物學(xué)功能，或建立高效表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的基因工程菌（細(xì)胞），或?qū)⒛康幕蛟隗w外進(jìn)行必要的結(jié)構(gòu)功能修飾，然后輸回細(xì)胞內(nèi)改良生物體的遺傳性狀，包括人體基因治療。一般來說，目的基因的克隆戰(zhàn)略分為兩大類：一類是構(gòu)建感興趣的生物個(gè)體的基因文庫，即將某生物體的全基因組分段克隆，然后建立合適的篩選模型從基因組文庫中挑出含有目的基因的重組克隆；另一類是利用PCR擴(kuò)增技術(shù)甚至化學(xué)合成法體外直接合成目的基因，然后將之克隆表達(dá)。第4頁/共90頁A鳥槍法鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略鳥槍法操作的改進(jìn)鳥槍法克隆目的基因的局限性第5頁/共90頁鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略隨機(jī)克隆供體細(xì)胞的全基因組DNA片段，然后通過快速有效的篩選程序從眾多克隆中分離出含有目的基因的目的重組子，進(jìn)而獲得目的基因。鳥槍法適用于原核細(xì)菌目的基因的克隆分離

第6頁/共90頁鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略染色體DNA的切斷

超聲波處理：片段長(zhǎng)度均一，大小可控，平頭末端

全酶切：片段長(zhǎng)度不均一，粘性末端便于連接，但有可能使目的基因斷開，大小不可控部分酶切：片段長(zhǎng)度可控，含有粘性末端，目的基因完整與載體連接

如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇多拷貝克隆載體；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測(cè)法篩選，則選擇表達(dá)型載體如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇大腸桿菌作為轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞

受體細(xì)胞；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測(cè)法篩選，則選擇能使目的基因表達(dá)的受體細(xì)胞篩選含有目的基因的目的重組子

菌落原位雜交法、基因產(chǎn)物功能檢測(cè)法（篩選模型的建立）

第7頁/共90頁鳥槍法操作的改進(jìn)使用這一改進(jìn)方法的前提條件是：目的基因的酶切圖譜已知。如果已知目的基因兩端的酶切口，可用該酶處理染色體DNA，然后與載體拼接，這樣可以保證目的基因的完整性，從而提高重組子中目的重組子的出現(xiàn)頻率使用特征性限制性內(nèi)切酶切開染色體DNA

第8頁/共90頁鳥槍法操作的改進(jìn)例如，已知某目的基因位于1.8kb的SalI片段中，將染色體DNA用SalI切開，瓊脂糖凝膠電泳分離，用刀片切下相當(dāng)于1.6-2.0

kb大小區(qū)域內(nèi)的凝膠塊，從此凝膠塊中回收DNA片段，然后與載體進(jìn)行拼接在連接前將DNA片段進(jìn)行分級(jí)分離

2.0kb1.6kb1.8kb第9頁/共90頁鳥槍法操作的改進(jìn)凍融法濾紙法吸附法低融點(diǎn)凝膠法溶解法凝膠DNA片段回收技術(shù)

第10頁/共90頁鳥槍法克隆目的基因的局限性工作量較大，需要了解目的基因的背景知識(shí)不能獲得的最小長(zhǎng)度的目的基因不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結(jié)構(gòu)第11頁/共90頁B基因文庫的構(gòu)建基因文庫的基本概念基因文庫的構(gòu)建程序基因組文庫重組克隆的排序第12頁/共90頁基因文庫的基本概念基因庫與基因文庫基因庫（genepool）特定生物體全基因組的集合（天然存在）

基因文庫（genelibraryorgenebank）從特定生物個(gè)體中分離的全部基因，這些基因以克隆的形式基因組文庫（含有全部基因）存在（人工構(gòu)建）。根據(jù)構(gòu)建方法的不同，基因文庫分為：cDNA文庫（含有全部蛋白質(zhì)編碼的結(jié)構(gòu)基因）

第13頁/共90頁基因組DNA文庫(genomiclibrary)

：指將某生物體的全部基因組DNA用限制性內(nèi)切酶或機(jī)械力量切割成一定長(zhǎng)度范圍的DNA片段，與合適的載體體外重組并轉(zhuǎn)化相應(yīng)的宿主細(xì)胞獲得的所有陽性生物群落cDNA文庫(cDNAlibrary)

：指將某生物基因組轉(zhuǎn)錄的部分或全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的各種cDNA片段分別與克隆載體重組，貯存于受體生物群體中，這樣的生物群體稱為cDNA文庫第14頁/共90頁根據(jù)構(gòu)建文庫所用的載體不同可將基因文庫分為質(zhì)粒文庫噬菌體文庫黏粒文庫人工染色體文庫M13phagevector、λphagevector、P1phagevectoret.CosmidvectorYAC、BAC、PAC、TAC第15頁/共90頁基因文庫的基本概念基因文庫構(gòu)建的基本戰(zhàn)略用鳥槍法構(gòu)建基因組文庫，材料來自染色體DNA用cDNA法構(gòu)建cDNA文庫，材料來自mRNA在高度分化的生物體中，不同組織和細(xì)胞在不同時(shí)段的mRNA種類不同（即基因的表達(dá)譜不同），因此同種生物體的cDNA文庫一般還有組織細(xì)胞的界定，如肝組織cDNA文庫或胚胎組織cDNA文庫等。很顯然，cDNA文庫的信息量遠(yuǎn)小于基因組文庫第16頁/共90頁基因文庫的基本概念基因文庫的完備性基因文庫的完備性是指：在構(gòu)建的基因文庫中任一基因存在的概率，它與基因文庫最低所含克隆數(shù)N之間的關(guān)系可用下式表示：N=ln(1–P)/ln(1–f)其中：P=任一基因被克隆（或存在于基因文庫中）的概率f=克隆片段的平均大小/生物基因組的大小

例如，人的單倍體DNA總長(zhǎng)為2.9x109bp，基因文庫中克隆片段的平均大小為15kb，則構(gòu)建一個(gè)完備性為0.9的基因文庫至少需要45萬個(gè)克隆；而當(dāng)完備性提高到0.9999時(shí)，基因文庫至少需要180萬個(gè)克隆第17頁/共90頁基因文庫的基本概念基因文庫的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)除了盡可能高的完備性外，一個(gè)理想的基因文庫應(yīng)具備下列條件：重組克隆的總數(shù)不宜過大以減輕篩選工作的壓力載體的裝載量最好大于基因的長(zhǎng)度避免基因被分隔克隆克隆與克隆之間必須存在足夠長(zhǎng)度的重疊區(qū)域以利克隆排序克隆片段易于從載體分子上完整卸下重組克隆能穩(wěn)定保存、擴(kuò)增、篩選第18頁/共90頁基因文庫的構(gòu)建程序基因組DNA的制備為了最大限度地保證基因在克隆過程中的完整性，

用于基因組文庫構(gòu)建的DNA在分離純化操作中應(yīng)盡量避免過度的斷裂。制備的DNA分子量越大，經(jīng)切割處理后樣品中含有不規(guī)則末端的DNA片段的比率就越低，重組率和完備性也就越高AAAA用常規(guī)方法制備的染色體DNA的長(zhǎng)度一般在100kb左右如果先將細(xì)胞固定在低融點(diǎn)凝膠中，然后置入含有SDS、蛋白酶K、RNase的緩沖液中浸泡，可獲得1000kb大小的DNA片段第19頁/共90頁基因文庫的構(gòu)建程序基因組DNA的切割用于基因組文庫構(gòu)建的DNA片段的切割一般采用超聲波處理和限制性內(nèi)切酶部分酶切兩種方法，其目的是：第一，保證DNA片段之間存在部分重疊區(qū)第二，保證DNA片段大小均一超聲波處理后的DNA片段呈平頭末端，需加裝人工接頭部分酶切法一般選用四對(duì)堿基識(shí)別序列的限制性內(nèi)切酶，如：Sau3AI或MboI等，這樣DNA酶解片段的大小可控

連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進(jìn)行分級(jí)分離，以杜絕不相干的DNA片段隨機(jī)連為一體！第20頁/共90頁基因文庫的構(gòu)建程序載體和受體的選擇出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫構(gòu)建的載體通常選裝載量較大的l-DNA或考斯質(zhì)粒；對(duì)于大型基因組（如動(dòng)植物和人類）需使用YAC或BAC載體l-DNA由于絕大多數(shù)真核生物的mRNA小于10kb，因此用于cDNA文庫構(gòu)建的載體通常選質(zhì)粒上述幾種載體的最大裝載量如下：質(zhì)粒考斯質(zhì)粒15kb25kb45kbBAC300kbYAC400kb用于基因文庫構(gòu)建的受體則根據(jù)載體使用大腸桿菌或酵母菌第21頁/共90頁基因文庫的構(gòu)建程序從基因文庫中篩選目的基因大型基因組文庫一般由數(shù)十萬甚至上百萬個(gè)重組克隆組成。除了一些具有特殊功能的蛋白質(zhì)編碼基因（如抗藥性基因、結(jié)合蛋白編碼基因等）可以采用特殊的正選擇篩選程序（如抗藥性篩選法、酵母雙雜交技術(shù)等）直接篩選外，一般的基因組文庫篩選均需多輪操作步驟第22頁/共90頁酵母雙雜交體系（YeastTwo-hybridsystem）真核生物的轉(zhuǎn)錄因子大多是由兩個(gè)結(jié)構(gòu)上分開、功能上獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成的。如GAL4的N端1-147aa是DNA結(jié)合域（BD），其C端768-881aa是轉(zhuǎn)錄激活域（AD）。一般情況下，AD能與GAL4效應(yīng)基因啟動(dòng)子上游的特定DNA區(qū)段（UAS）相結(jié)合，而此時(shí)，AD則推動(dòng)了轉(zhuǎn)錄起始。第23頁/共90頁d.從大腸桿菌中分別提取這兩種重組質(zhì)粒DNA，共轉(zhuǎn)化感受態(tài)釀酒酵母菌株。e.將共轉(zhuǎn)化的酵母菌株涂布于缺少Leu，Trp和His的培養(yǎng)基上，篩選表達(dá)相互作用的雜種蛋白的陽性菌落。

主要實(shí)驗(yàn)過程a.選擇缺失GAL4編碼基因的酵母寄主菌株-SFY526或HF7c；

b.構(gòu)建帶有GAL1UAS-啟動(dòng)子-lacZ（His3）的轉(zhuǎn)化載體;

c.把已知的靶蛋白質(zhì)編碼基因克隆到pGBT9的多克隆位點(diǎn)上，把所有cDNA都克隆到pGAD424載體上，構(gòu)成cDNA表達(dá)文庫。第24頁/共90頁第25頁/共90頁第26頁/共90頁第27頁/共90頁基因文庫的構(gòu)建程序從基因文庫中篩選目的基因密集鋪板（1-10萬）雜交挖取鋪板鋪板目的重組克隆第28頁/共90頁基因文庫的構(gòu)建程序基因文庫構(gòu)建的技術(shù)性問題在基因組文庫的構(gòu)建過程中，最應(yīng)引起重視的問題是：嚴(yán)禁外源DNA片段之間的連接?。。榱吮苊馍鲜銮闆r的發(fā)生，可采取下列措施的組合：

將待連接的DNA片段根據(jù)載體的裝載量分級(jí)分離用堿性磷酸單酯酶除去DNA片段的末端磷酸基團(tuán)

用TdT酶在DNA片段的末端上增補(bǔ)同聚尾末端第29頁/共90頁基因組文庫重組克隆的排序大型基因文庫（包括人的基因文庫）的構(gòu)建在技術(shù)上并不十分困難，如果一個(gè)YAC基因文庫的插入片段總和為整個(gè)基因組的十倍以上時(shí)，一般就能從基因文庫中調(diào)出任何一段DNA序列。然而基因文庫的克隆都是隨機(jī)序列，必須將所有的克隆排列成一個(gè)像天然染色體DNA上所表現(xiàn)出的信息順序。這項(xiàng)工作的工作量可能遠(yuǎn)大于基因組文庫的構(gòu)建，屬于基因文庫的后期制作第30頁/共90頁基因組文庫重組克隆的排序?qū)我坏腨AC克隆插入DNA片段用限制性內(nèi)切酶分布均勻地水解成若干片段，末端標(biāo)記同位素然后再用Sau3AI或MboI將末端標(biāo)記的DNA片段降解成碎片，聚丙烯酰胺凝膠電泳，每10個(gè)YAC克隆走在同一塊板上，形成10個(gè)克隆的特征性DNA指紋圖譜電腦分析指紋圖譜，如發(fā)現(xiàn)任何兩個(gè)克隆DNA的指紋圖譜有部分相同的，則其兩個(gè)YAC片段就有互相重疊的可能性，于是這兩個(gè)YAC克隆的DNA片段克隆在染色體上是排列一起的

酶切片段末端標(biāo)記法第31頁/共90頁酶切片段末端標(biāo)記法HHHHSSSSSSSSSSSSSSSSSSS單一克隆指紋圖譜十克隆指紋圖譜載體DNA克隆DNA第32頁/共90頁基因組文庫重組克隆的排序?qū)⑷舾蒠AC克隆固定在薄膜上，并復(fù)制二十份薄膜；合成20種不同序列的短探針，其序列是隨機(jī)的用20種探針隨機(jī)定位雜交（一對(duì)一）20份YAC克隆薄膜如果某兩個(gè)克隆同時(shí)對(duì)同一種探針呈現(xiàn)雜交陽性反應(yīng)，則這兩個(gè)克隆有可能是相互重疊的。若將雜交陽性結(jié)果記為“1”，而陰性結(jié)果記為“0”，可清晰地列成一張表，最終排出上述YAC克隆的排列順序隨機(jī)探針聯(lián)合雜交法第33頁/共90頁0102030405060708091011121314151617181920A

B

CD

E

FG0102030405060708091011121314151617181920DABCEFG111111111111111111111111111111第34頁/共90頁0104120613140214071911150508160310092018DABCEFG111111111111111111111111111111FCADGEB第35頁/共90頁基因組文庫重組克隆的排序從基因文庫中任取一個(gè)克隆作為染色體走讀的起點(diǎn)，將之兩端序列分別亞克隆，亞克隆片段在0.5-2.0kb范圍內(nèi)分別以上述亞克隆DNA片段為探針，雜交同一基因文庫，雜交陽性克隆中的插入DNA片段必定與起點(diǎn)克隆所含的DNA片段連鎖在一起然后再以陽性克隆片段的兩端序列為探針，進(jìn)行第二步走讀，直至線型染色體DNA的端點(diǎn)

染色體走讀法（chromosomewalking）第36頁/共90頁染色體走讀法（chromosomewalking）走讀的起點(diǎn)克隆片段亞克隆旁測(cè)序列探針標(biāo)記第一輪雜交陽性克隆陽性克隆第二輪雜交第二輪雜交第37頁/共90頁染色體走讀法（chromosomewalking）走讀的起點(diǎn)克隆片段第38頁/共90頁cDNA文庫的DNA片段是互補(bǔ)DNA(complementaryDNA,cDNA)

cDNA是由生物的某一特定器官或特定發(fā)育時(shí)期細(xì)胞內(nèi)的mRNA經(jīng)體外反轉(zhuǎn)錄后形成的雙鏈cDNAcDNA文庫代表生物的某一特定器官或特定發(fā)育時(shí)期細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平上的基因的群體，并不能包括該生物的全部基因，且這些基因在表達(dá)豐度上存在很大差異。CcDNA法第39頁/共90頁細(xì)胞總RNA的提取和mRNA分離第一鏈cDNA合成第二鏈cDNA合成雙鏈cDNA克隆進(jìn)質(zhì)?；蚴删w載體并導(dǎo)入宿主中繁殖cDNA文庫的構(gòu)建共分四步第40頁/共90頁StepⅠ細(xì)胞總RNA的提取和mRNA分離cDNA文庫構(gòu)建是以mRNA為起始材料的，mRNA在總RNA中所占比例很小，因此從總RNA中富集mRNA是構(gòu)建cDNA文庫和其它應(yīng)用所必需進(jìn)行的步驟。通過降低rRNA和tRNA含量，可大大提高篩選到目標(biāo)基因的可能性。目前純化mRNA的方法都是在固體支持物表面共價(jià)結(jié)合固定一段由脫氧胸腺嘧啶核苷組成的寡聚核苷酸[oligo（dT）]鏈，由它與mRNA的Poly（A）尾巴雜交，從而吸附固定住mRNA，進(jìn)而將mRNA從其它組分中分離出來的。第41頁/共90頁指導(dǎo)合成高分子量蛋白質(zhì)的能力，指導(dǎo)合成目的多肽的能力，mRNA的大小，總mRNA制劑指導(dǎo)合成cDNA第一鏈長(zhǎng)分子的能力mRNA的完整性

高豐度mRNA

：珠蛋白，免疫球蛋白，卵清蛋白，在特定細(xì)胞中占50-90%。

低豐度mRNA

：含量0.5%被稱為低豐度或稀有mRNAmRNA的豐度第42頁/共90頁第43頁/共90頁cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略mDNA5‘ppp’5G

G

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3’5‘ppp’5G

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5’cDNA第一鏈引物退火逆轉(zhuǎn)錄酶dNTPs合成DNA時(shí)需要引物引導(dǎo)，目前常用的引物主要有兩種，即Oligo（dT）和隨機(jī)引物。Oligo（dT）引物一般包含10～20個(gè)脫氧胸腺嘧啶核苷和一段帶有稀有酶切位點(diǎn)的引物共同組成，隨機(jī)引物一般是包含6～10個(gè)堿基的寡核苷酸短片段。

StepⅡFirstcDNAstrandsynthesize第44頁/共90頁煮沸NaOH自身引導(dǎo)法：獲得的雙鏈cDNA5’端會(huì)有幾對(duì)堿基缺失AAAAAAAAAAAAAA5‘ppp’5G

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3’KlenowdNTPsS1StepⅢSecondstrandsynthesizeofcDNA第45頁/共90頁cDNA第二鏈的合成

DNApoldNTPsRNaesH置換合成法：獲得的雙鏈cDNA5’端也會(huì)有幾對(duì)堿基缺失5‘ppp’5G

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3’TTTTTTTTTTTTTTp

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3’3’T4-DNAligase第46頁/共90頁cDNA第二鏈的合成

dCTPTdT引導(dǎo)合成法：獲得的雙鏈cDNA能保留完整的5’端序列5‘ppp’5G

G

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5’5‘

pGGGGGGGAAAAAOH

3’NaOH退火KlenowdNTPs第47頁/共90頁StepⅣdscDNAcloningandtransformation雙鏈平頭的cDNA通常可用下列三種方法克隆入載體中：Ⅰ平頭末端直接與載體連接，但插入的片段無法回收Ⅱ平頭兩端分別接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，這樣重組分子可通過加熱局部變性和S1核酸酶處理回收插入片段Ⅲ加裝人工接頭引入酶切口，以便插入片段回收將重組子轉(zhuǎn)到受體中，擴(kuò)增、檢測(cè)陽性克隆第48頁/共90頁cDNA法分離目的基因的基本程序特異分離程序

提取細(xì)胞總mRNA，瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目標(biāo)mRNA，由此合成雙鏈cDNA，然后進(jìn)行克隆特異分離程序較適用于mRNA豐度極高的目的基因克隆如血紅蛋白基因等

第49頁/共90頁cDNA法分離目的基因的基本程序差異分離程序

利用兩組細(xì)胞mRNA種類的差異，分離克隆差異mRNA所對(duì)應(yīng)的cDNA，因而這種程序較適用于分離克隆新基因例如：正常的大鼠FR3T3成纖維細(xì)胞中，有些新基因是不能自發(fā)表達(dá)的，需在多瘤病毒感染之后方可轉(zhuǎn)錄。任務(wù)是要分離克隆這些新基因，進(jìn)而研究其生物學(xué)功能第50頁/共90頁差異分離程序

多瘤病毒感染的FR3T3細(xì)胞正常的FR3T3細(xì)胞總mRNA總mRNAcDNA雙鏈cDNA單鏈cDNA提取mRNA合成cDNA合成第二鏈克隆提取mRNA共價(jià)交聯(lián)上柱原位雜交病毒誘導(dǎo)表達(dá)的基因cDNA克隆第51頁/共90頁篩選目的基因片段的差別雜交及減法雜交技術(shù)差別雜交（differentialhybridization）差別雜交：又稱為差別篩選（differentialscreening），特別適用于分離特定組織中或發(fā)育階段表達(dá)的基因以及受生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)的基因，也可用于分離經(jīng)特殊處理誘導(dǎo)表達(dá)基因第52頁/共90頁第53頁/共90頁差別雜交的局限性靈敏度低，特別是對(duì)低豐度的mRNA。工作大，耗時(shí)耗錢。需要篩選大量的雜交濾膜，鑒定大量的噬菌斑或克隆片段。重復(fù)性差第54頁/共90頁減法雜交（subtractivehybridization）減法雜交：又叫差減雜交、扣除雜交、減數(shù)雜交或消減雜交，是通過DNA復(fù)性動(dòng)力學(xué)原理富集目的基因序列，并以此構(gòu)建減數(shù)文庫（subtractivelibrary）的方式來進(jìn)行目的基因分離克隆的。減法雜交的對(duì)象GenomicDNAcDNAGenomicDNAsubtractivehybridizationmRNAsubtractivehybridization克隆兩樣品存在特異性的基因克隆兩樣品差異表達(dá)的基因第55頁/共90頁減法雜交的本質(zhì)是除去那些普遍共同存在的或非誘發(fā)產(chǎn)生cDNA序列，從而使欲分離的目的基因的序列得到有效的富集DifferentialcDNAbetweenTandBcell,content2%inTcell,totalpositivecloning:35,whichpurposegene(T-cellreceptor)iscontained第56頁/共90頁減法雜交也可用于分離缺失突變基因第57頁/共90頁減法雜交的缺點(diǎn)假陽性：回收cDNA量少、容易丟一些mRNA以及mRNA降解造成cDNA過短而導(dǎo)致的重復(fù)性易解低改進(jìn)的方法使用磁珠的減數(shù)技術(shù)（magnetassistedsubtractivetechnique，MAST）Oligo(dT)30乳膠和PCR結(jié)合的方法酶降解減數(shù)法(enzymaticdegradingsubtractive,EDS)第58頁/共90頁cDNA法克隆目的基因的局限性并非所有的mRNA分子都具有polyA結(jié)構(gòu)

細(xì)菌或原核生物的mRNA半衰期很短mRNA在細(xì)胞中含量少，對(duì)酶和堿極為敏感，分離純化困難僅限于克隆蛋白質(zhì)編碼基因

第59頁/共90頁DPCR法

PCR（PolymeraseChainReaction）法，又稱為聚合酶鏈反應(yīng)或PCR擴(kuò)增技術(shù)，是一種高效快速的體外DNA聚合程序使用PCR法克隆目的基因的前提條件是：已知待擴(kuò)增目的基因或DNA片段兩側(cè)的序列，根據(jù)該序列化學(xué)合成聚合反應(yīng)必需的雙引物利用PCR定向擴(kuò)增目的基因第60頁/共90頁5‘5‘目的基因5‘變性加熱5‘5‘引物退火5‘5‘底物聚合5‘5‘5‘5‘加熱變性5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘退火引物底物聚合加熱變性引物退火底物聚合123第61頁/共90頁由TaqDNA聚合酶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物中，其3’末端總是會(huì)帶有一個(gè)非模板依賴型的突出堿基，而且這個(gè)堿基幾乎總是A，因?yàn)門aqDNA聚合酶對(duì)dATP具有優(yōu)先聚合活性。由于該突出堿基的存在，克隆時(shí)即可以采取TdT末端加同聚尾的方法與載體拼接，也可以使用專門的T載體克隆

PCR克隆目的基因的基本程序5’5’AATT5’5’PCR擴(kuò)增產(chǎn)物T載體T7lacZMCSoriApr第62頁/共90頁DNA插入誘變結(jié)合PCR分離目的基因當(dāng)一段特定DNA序列插入到植物基因組中目的基因內(nèi)部或其鄰近位點(diǎn)時(shí)，便會(huì)誘發(fā)該基因發(fā)生突變，并最終導(dǎo)致表型的變化，形成突變植株。如果此段DNA序列是已知的，以其作為分子探針可從突變株基因組文庫中篩選到突變基因，再利用此突變基因作為探針在野生型植株基因組文庫中篩選到目的基因。由于插入的DNA序列相當(dāng)于人為地給目的基因加上一段已知的序列標(biāo)簽，DNA插入誘變法又叫DNA標(biāo)簽法（DNAtagging）DNA插入誘變法轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法（transposontagging）T-DNA標(biāo)簽法（T-DNAtagging）第63頁/共90頁轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法（transposontagging）1951年BarbaraMclintock首先在玉米中發(fā)現(xiàn)了控制元件，后來命名為轉(zhuǎn)座元件或轉(zhuǎn)座子(transposon)。轉(zhuǎn)座子是染色體上一段可移動(dòng)的DNA片段，它可從染色體的一個(gè)位置跳到另一個(gè)位置。當(dāng)轉(zhuǎn)座子跳躍而插入到某個(gè)功能基因時(shí)，就會(huì)引起該基因的失活，并誘導(dǎo)產(chǎn)生突變型，而當(dāng)轉(zhuǎn)座子再次轉(zhuǎn)座或切離這一位點(diǎn)時(shí)，失活基因的功能又可得一恢復(fù)。第64頁/共90頁轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子（DNA-DNA方式轉(zhuǎn)座的轉(zhuǎn)座子）逆轉(zhuǎn)座子（retrotransposon）自主轉(zhuǎn)座元件非自主轉(zhuǎn)座元件轉(zhuǎn)座子可以通過DNA復(fù)制或直接切除兩種方式獲得可移片段，重新插入基因組DNA中。自主轉(zhuǎn)座元件本身能夠編碼轉(zhuǎn)座酶而進(jìn)行轉(zhuǎn)座，非自主轉(zhuǎn)座元件則需在自主元件存在時(shí)方可轉(zhuǎn)座，以玉米的Ac/Ds體系為例，Ac(Activator)屬于自主元件，Ds(Dissociation)則是非自主元件，必需在Ac元件存在下才能轉(zhuǎn)座第65頁/共90頁逆轉(zhuǎn)座子又稱為返座元(retroposon)，是近年新發(fā)現(xiàn)的由RNA介導(dǎo)轉(zhuǎn)座的轉(zhuǎn)座元件，在結(jié)構(gòu)和復(fù)制上與反轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus)類似，只是沒有病毒感染必須的env基因，它通過轉(zhuǎn)錄合成mRNA,再逆轉(zhuǎn)錄合成新的元件整合到基因組中完成轉(zhuǎn)座，每轉(zhuǎn)座1次拷貝數(shù)就會(huì)增加1份，因此它是目前所知高等植物中數(shù)量最大的一類可活動(dòng)遺傳成分。目前共發(fā)現(xiàn)了3種類型反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子：Tyl-copia類，Ty3-gypsy類和LINE(longinterspersednuclearClements)類轉(zhuǎn)座子，前兩類是具有長(zhǎng)末端重復(fù)的轉(zhuǎn)座子，LINE類轉(zhuǎn)座子沒有長(zhǎng)末端重復(fù)。高等植物中的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子主要屬于Tyl-copia類，分布十分廣泛，幾乎覆蓋了所有高等植物種類

第66頁/共90頁克隆轉(zhuǎn)座子主要有兩條途徑：根據(jù)序列同源性，在基因組的不同位置分離同一家族的轉(zhuǎn)座子成員利用抗體識(shí)別或cDNA探針從野生型植株中獲得表達(dá)量降低或不穩(wěn)定基因座的序列，再從突變體中分離得到相應(yīng)的轉(zhuǎn)座子名稱來源類型Ac(Activator)玉米Ⅰ類自主型轉(zhuǎn)座子Ds(Dissociation)玉米Ⅰ類非自主型轉(zhuǎn)座子Mu(Mutator)玉米Ⅰ類自主型轉(zhuǎn)座子Spm/En玉米Ⅰ類自主型轉(zhuǎn)座子Tam金魚草Ⅰ類自主型轉(zhuǎn)座子dTphl擬南芥Ⅰ類自主型轉(zhuǎn)座子Tos17水稻反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子第67頁/共90頁Ac-Ds系統(tǒng)：

Ac：4565bp

末端反向重復(fù)序列（11bp）自主元件轉(zhuǎn)座酶基因

Ds：Ac的缺失序列，結(jié)構(gòu)多樣末端反向重復(fù)序列（6~13）非自主元件第68頁/共90頁反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)座酶足跡第69頁/共90頁T-DNA標(biāo)簽法（T-DNAtagging）第70頁/共90頁第71頁/共90頁差示分析法分離目的基因mRNA差別顯示技術(shù)（mRNAdifferentialdisplaybyPCR,DD-PCR）代表性差別分析技術(shù)（representationdifferenceanalysis,RDA）抑制性減法雜交（suppressionsubtractivehybridization,SSH）mRNA差別顯示技術(shù)mRNA差別顯示技術(shù)：或稱為差別顯示反轉(zhuǎn)錄PCR（differentialdisplay

reversetranscriptionPCR,DDRT-PCR

）P.LiangandA.D.Pardeefoundin1922第72頁/共90頁mRNA差別顯示技術(shù)：是通過對(duì)某一特定細(xì)胞類型或發(fā)育階段表達(dá)的mRNA與另一細(xì)胞類型或發(fā)育階段表達(dá)的mRNA進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增，并利用電泳和放射性自顯影技術(shù)來對(duì)不同細(xì)胞類型或發(fā)育階段進(jìn)行對(duì)比顯示差異，進(jìn)而尋找不同細(xì)胞類型或發(fā)育階段代表性的基因基因克隆方法mRNA差別顯示技術(shù)的基本原理絕大多數(shù)真核生物mRNA（除極少數(shù)特例，如組蛋白基因）都有polyA尾巴，在polyA尾巴前（5′上游）的兩個(gè)堿基，除第二為的情況之外，只有12種可能第73頁/共90頁將這12種序列的互補(bǔ)序列作為下游引物，反轉(zhuǎn)錄mRNA，合成第一鏈cDNA。這種引物通常叫錨定引物通式5′T11MN或5′T12MNM：A、G、CN：A、T、G、C第74頁/共90頁這12個(gè)錨定引物中的每一條引物都可擴(kuò)增出某一特定細(xì)胞的總cDNA的1/12，由此可將整個(gè)mRNA在cDNA水平上，分成大致相等的但序列不同的12份亞群體。這些群體中，代表某一特定細(xì)胞類型或發(fā)育階段的mRNA種的含量是相當(dāng)?shù)偷摹Ｒ蛛x在某一特定細(xì)胞類型或發(fā)育階段表達(dá)的mRNA、而在另一細(xì)胞類型或發(fā)育階段不表達(dá)或表達(dá)量不同的基因，就要進(jìn)行PCR擴(kuò)增引物上游引物：3′端的12種錨定引物下游引物：5′端20種10mer隨機(jī)引物(arbitraryprimer,AP)引物對(duì)組合240對(duì)第75頁/共90頁在PCR反應(yīng)加入35S可32P標(biāo)記的dNTP，經(jīng)電泳和放射性自顯影后，可每一對(duì)引物可擴(kuò)增出60－160條分子量在100－500bp的cDNA條帶。在同一膠上比較兩個(gè)不同樣品在同一引物條件下擴(kuò)增出的cDNA帶就可顯示出差異表達(dá)的條帶mRNA差別顯示技術(shù)的基本操作過程第76頁/共90頁第77頁/共90頁第78頁/共90頁第79頁/共90頁E化學(xué)合成法化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略化學(xué)合成的單元操作DNA化學(xué)合成的用途第80頁/共90頁化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略全基因合成化學(xué)合成目的基因的前提條件是基因的DNA序列已知，有三種戰(zhàn)略：小片段粘接法：

混合退火根據(jù)目的基因全序列，分別合成12-15堿基長(zhǎng)的單鏈DNA小片段T4-DNA連接酶連接克隆入合適的載體

第81頁/共90頁化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略全基因合成補(bǔ)釘延長(zhǎng)法：

混合退火根據(jù)目的基因兩條互補(bǔ)鏈全序列，分別合成12-15堿基長(zhǎng)的單鏈DNA小片段以及20-30堿基長(zhǎng)的單鏈DNA中片段T4-DNA連接酶連