RNA提取及PCR相關(guān)技術(shù)2

RNA提取(Qu)及PCR相關(guān)技術(shù)演示文稿第一頁，共五十一頁。RNA提取及PCR相(Xiang)關(guān)技術(shù)第二頁，共五十一頁。RNA提取逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)步驟結(jié)果分(Fen)析PCRqPCR內(nèi)容第三頁，共五十一頁。從RNA提取到基(Ji)因定性/定量流程收集并保存組織、血液、細(xì)胞等臨床樣本提取、純化RNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNAPCR/qPCR進(jìn)行定性/定量分析第四頁，共五十一頁。樣本保存要求最好使用新鮮樣品組織：取樣離體后，立即分成1cm3左右的小塊，

每塊約30-100mg，放入凍存管或錫箔紙包好，

立即放置液氮罐中速凍1小時(shí)(Shi)，-80℃冰箱保存。注意做好標(biāo)記，避免反復(fù)凍融第一部分RNA提取第五頁，共五十一頁。RNA提取樣(Yang)本保存要求細(xì)胞：不建議保存。

培養(yǎng)處理后立即提取RNA， 或收集后，于Trizol液中-80℃保存。血液：不建議長期保存。

或立即分離白細(xì)胞后，于Trizol液中-80℃保存。第六頁，共五十一頁。試劑(Ji)耗材準(zhǔn)備工作目的：去除RNase，防止RNA降解?各種離心管、Tip頭、冷凍保存管等塑料器皿： 浸泡在0.1%的DEPC水中，過夜處理，次日烘干， 高壓滅菌后再次烘干。?錫箔紙、玻璃勻漿管、研缽、手術(shù)剪刀、鑷子、移液管等玻璃、金屬及陶瓷制品：用錫箔紙嚴(yán)密包裹后，150℃高溫烘烤4小時(shí)。第七頁，共五十一頁。前期準(zhǔn)備(Bei)工作?RNase-free水：0.1％DEPC處理去離子水過夜，次日高壓滅菌除去殘留DEPC，分裝1.5mlEppendorf管，4℃保存。?75％乙醇：用RNase-free水配制，分裝為50ml，4℃保存。?氯仿、異丙醇、無水乙醇：新包裝開封后，分裝50ml，4℃保存。注意：DEPC有吸入毒性，需穿工作服，戴手套、口罩操作。第八頁，共五十一頁。樣(Yang)本準(zhǔn)備

組織

大鼠組織樣品量總RNA量（μg）腦10mg8肺10mg10腎臟10mg10心臟10mg20脾臟10mg35肝臟10mg4050－100mg組織對應(yīng)1mlTrizol第九頁，共五十一頁。樣本(Ben)準(zhǔn)備

細(xì)胞?懸浮細(xì)胞：生長對數(shù)期誘導(dǎo)后，5000×g，5min離心去 除培養(yǎng)基，收集約5-10×106個(gè)細(xì)胞。

每5-10×106個(gè)細(xì)胞對應(yīng)1mlTrizol

?貼壁細(xì)胞：生長對數(shù)期誘導(dǎo)后，收集約5-10×106個(gè)細(xì) 胞，倒掉培養(yǎng)基，加入預(yù)熱PBS洗一次，去 除PBS。每10cm2培養(yǎng)面積對應(yīng)1mlTrizol第十頁，共五十一頁。RNA的提(Ti)取注意佩戴口罩、勤更換手套

組織（1）液氮預(yù)冷研缽；（2）液氮研磨，至樣品呈粉末狀（需8-10min）；（3）向研缽內(nèi)加入1mlTrizol繼續(xù)研磨，至呈不黏稠液態(tài)；（4）將混合液轉(zhuǎn)移至玻璃勻漿器中，冰上勻漿3min；（5）將勻漿液轉(zhuǎn)移至1.5mlEppendorf管，室溫孵育5min；裂解第十一頁，共五十一頁。第十二頁，共五十一頁。RNA的(De)提取

細(xì)胞懸浮細(xì)胞：離心收集后，倒除培養(yǎng)液，加入1mlTrizol反復(fù)吹打細(xì)胞，至溶液不黏稠。

貼壁細(xì)胞：倒除培養(yǎng)液，PBS洗滌一次后，直接在培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中加入1mlTrizol反復(fù)吹打細(xì)胞，直至溶液不黏稠。室溫孵育混合液10min后，轉(zhuǎn)移至1.5mlEppendorf管裂解第十三頁，共五十一頁。第十四頁，共五十一頁。Trizol勻漿(Jiang)孵育后－80℃保存加入0.2ml氯仿，劇烈搖動15s;3minatRT,12,000gx15min,4℃分層取水相，0.5mL異丙醇，顛倒混勻，10minatRT4℃，12,000gx10min（片狀沉淀物為RNA）沉淀去上清，1ml75％乙醇洗滌，7,500gx5minat4℃，重復(fù)一次洗滌空氣干燥，加50ulRNase-free水，55℃孵育溶解干燥溶解第十五頁，共五十一頁。RNA提取優(yōu)(You)化步驟（1）對得率較低的樣本，可在異丙醇沉淀一步，選用-20

度過夜孵育，以增加得率。（2）對多糖含量較高的樣本，可在異丙醇沉淀一步，加入

高鹽溶液（0.8M檸檬酸鈉和1.2MNaCl），-20度過

夜共孵育，以去除多糖物質(zhì)的污染。注意：所有試劑均需無酶水配制。第十六頁，共五十一頁。RNA鑒定(Ding)及初定(Ding)量

（1）測量OD值——得率及純度檢測

得率

總RNA濃度（ug/ml）＝OD260×稀釋倍數(shù)×40ug/ml

（通常OD260數(shù)值介于0.15-1.0之間才可靠）

純度

OD260/280檢測RNA純度值在1.8-2.1之間，RNA純度較好；值小于1.8，表明蛋白雜質(zhì)較多；值大于2.2，表明RNA已降解；第十七頁，共五十一頁。RNA鑒(Jian)定及初定量

（2）瓊脂糖凝膠電泳——RNA完整性鑒定

1－3ulRNA溶液上樣，1％膠，100V電泳10min。完整RNA呈現(xiàn)明顯兩條帶28S，18S，且28S帶約為18S帶亮度的兩倍；有時(shí)也可見5S帶第十八頁，共五十一頁。RNA鑒定(Ding)及初定(Ding)量ElectrophoresisgeloftheRNAsample第十九頁，共五十一頁。小結(jié)－RNA的保(Bao)護(hù)1.提取前

1.1新鮮樣品及液氮速凍

1.2提取工作區(qū)RNase的清除

1.3實(shí)驗(yàn)用品RNase的清除

2.提取中

2.1組織破碎過程中的保護(hù)

2.2細(xì)胞裂解過程中的保護(hù)

2.3實(shí)驗(yàn)人員保護(hù)措施

2.4保存過程中3.在后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄過程中仍需保持無酶環(huán)境第二十頁，共五十一頁。第二(Er)部分RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄PCRreversetranscriptionAAAAAAAAAA-3’TTTTTTTTTT-5’mRNA(sense)Antisenseprimers:oligo(dT)orrandomhexamersorGSP1ststrandcDNAAAAAAAAAAA-3’TTTTTTTTTT-5’PCRusingGSP+GSP1GSP1GSPGSP1(sense)GSP(antisense)1ststrandcDNA第二十一頁，共五十一頁。RT-PCR逆(Ni)轉(zhuǎn)錄?選擇方法：

兩步法（適用于多目的基因）

一步法（適用于單一目的基因）第二十二頁，共五十一頁。RNA逆轉(zhuǎn)(Zhuan)錄

?選擇逆轉(zhuǎn)錄引物：

隨機(jī)引物（適用于低豐度RNA）

Oligo(dT)引物（適用于具有PolyA尾的RNA）

特異性引物（適用于一步法）

第二十三頁，共五十一頁。RNA逆轉(zhuǎn)(Zhuan)錄步驟（1）取1-5ugRNA樣本，65℃熱變性10min；（2）配制反應(yīng)體系，共20ul（以AMV為例）

10×buffer 2ul Mgcl2(25mM) 4ul dNTPs(10mM) 2ul RNaseinhibitor(1U/ul)0.5ul reversetranscriptase15U reverseprimer0.5ug RNAsample1-5ug RNase-freeWater加至20ul 一、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)第二十四頁，共五十一頁。RNA逆轉(zhuǎn)錄步(Bu)驟（3）反應(yīng)體系42℃孵育60min。如使用隨機(jī)引物，先室溫孵育

10min后，再升溫至42℃。（4）72℃，5min失活酶，置冰進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)或-20℃保存。cDNA第一鏈已合成，可低溫保存或繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)第二十五頁，共五十一頁。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction)以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起(Qi)點(diǎn)，以反應(yīng)底物脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)在DNA聚合酶催化下，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過程。PCR的原理和反應(yīng)過程第二十六頁，共五十一頁。RT-PCR逆轉(zhuǎn)(Zhuan)錄PCRPCR反應(yīng)準(zhǔn)備工作：

?目的基因擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)：NCBI中查詢靶基因的mRNA序列，無特

殊要求可選擇CDS序列作為引物設(shè)計(jì)區(qū)域。第二十七頁，共五十一頁。RT-PCR逆(Ni)轉(zhuǎn)錄PCR?mRNA序列查找（以EGFR為例） 第二十八頁，共五十一頁。RT-PCR逆轉(zhuǎn)(Zhuan)錄PCR…………第二十九頁，共五十一頁?！谌摚参迨豁?。以BLAST驗(yàn)(Yan)證引物第三十一頁，共五十一頁。RT-PCR逆轉(zhuǎn)(Zhuan)錄PCRPCR反應(yīng)準(zhǔn)備工作：?選擇內(nèi)參：1.受不同實(shí)驗(yàn)處理因素時(shí)，表達(dá)恒定；

2.在體內(nèi)各種組織中表達(dá)恒定；

3.除實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)處理因素之外，能夠與目的基因一起受同等程度的非設(shè)計(jì)其它因素影響。

常用內(nèi)參基因名稱：β-actin、GAPDH、16Sr、18Sr

（Human、Rat、Mouse）第三十二頁，共五十一頁。RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄(Lu)步驟二、PCR擴(kuò)增（示例）cDNA第一鏈 2ul10×PCRbuffer(K+)5ul25mMMgCl23ul(1.5mM)10mMdNTPs1ul(各200uM)50μM引物正向/反向各0.5ul(0.1~0.5uM)Taq酶 0.5ul(1~5U)雙蒸水38.5ul總反應(yīng)體積：50ulPCRmix包含：buffer（Mg2+）dNTPsTaq酶第三十三頁，共五十一頁。RT-PCR逆轉(zhuǎn)(Zhuan)錄步驟PCR反應(yīng)條件

95℃ 2min 95℃ 30sec 40-65℃ 10-120sec 22-35cycle 72℃ 60-120sec 72℃ 10min 12℃ ∞

退火溫度：引物的退火溫度一般要比估計(jì)的相應(yīng)熔點(diǎn)溫度Tm低5℃左右。兩條引物的退火溫度相差不應(yīng)超過4-6℃。特異性的改進(jìn)：提高退火溫度（比建議退火溫度提高2-5℃）；減少退火時(shí)間。過長的退火時(shí)間在正常情況下并不能提高產(chǎn)量，只會增加非特異性引物雜交的可能性。第三十四頁，共五十一頁。注意(Yi)事項(xiàng)（1）每次PCR設(shè)立對照組和陰性對照組。（2）科學(xué)做法是將內(nèi)參引物加入目的基因的PCR擴(kuò)增 反應(yīng)體系中，同時(shí)擴(kuò)增作為對照。（3）將反應(yīng)體系中的相同試劑預(yù)先混合，再分裝成各反應(yīng)管。（4）設(shè)定合適的循環(huán)次數(shù)，PCR不能進(jìn)入平臺期。（5）在一定范圍內(nèi)調(diào)整Mg2+濃度、引物濃度、退火溫度，消除非特異性擴(kuò)增。第三十五頁，共五十一頁。結(jié)果(Guo)鑒定

瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果：

2％瓊脂糖凝膠，取4-8ul產(chǎn)物上樣，60V電泳40min，紫外燈下觀察結(jié)果。采用凝膠圖像分析系統(tǒng)，對電泳條帶進(jìn)行密度掃描，測定灰度值。注意：灰度掃描時(shí)，選擇合適的膠空白區(qū)域作為扣除的背景灰度值。第三十六頁，共五十一頁。基(Ji)因表達(dá)的差異分析－相對定量各反應(yīng)體系以內(nèi)參基因?yàn)閰⒄?，?jì)算待測基因產(chǎn)物與其灰度比值，作為待測基因的表達(dá)值。即

待測基因產(chǎn)物電泳帶灰度值 內(nèi)參基因產(chǎn)物電泳帶灰度值

雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法： 待測樣本基因相對表達(dá)量 參照樣本基因相對表達(dá)量＝待測基因相對表達(dá)量第三十七頁，共五十一頁。結(jié)(Jie)果示例

第三十八頁，共五十一頁。結(jié)果示(Shi)例第三十九頁，共五十一頁。熒(Ying)光定量PCR(Real-timePCR,qPCR)PCR+熒光探針/熒光染料①應(yīng)用廣泛：可用于DNA和RNA的PCR產(chǎn)物定量、基因表達(dá)研究、病原體檢測及PCR條件的優(yōu)化等。②可定量原理：經(jīng)激光激發(fā)后熒光量隨PCR循環(huán)而累積，從而達(dá)到定量目的。③無須凝膠電泳：只須反應(yīng)管內(nèi)直接檢測。④減少污染環(huán)節(jié)：全封閉反應(yīng)管。⑤結(jié)果重現(xiàn)性好：定量動態(tài)范圍高達(dá)五個(gè)數(shù)量級。第四十頁，共五十一頁。Log[DNA]循環(huán)數(shù)線性增長期Linear平臺期Plateauy=x(1+e)n指數(shù)增長期Geometric第四十一頁，共五十一頁。Real-timePCR相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖起始拷貝(Bei)數(shù)越高，Ct值越??；起始拷貝數(shù)越低，Ct值越大第四十二頁，共五十一頁。與DNA結(jié)合時(shí)發(fā)(Fa)光游離時(shí)不發(fā)光

一種DNA小溝結(jié)合染料1．SYBRGreenI熒光染料第四十三頁，共五十一頁。

在PCR過程中染料與DNA結(jié)合(He)發(fā)光聚合完成聚合開始SYBRGreenI第四十四頁，共五十一頁。每形成一個(gè)DNA雙鏈，就有一定數(shù)量的染料結(jié)合上去染料一結(jié)合，就產(chǎn)生熒光信號信號強(qiáng)度與DNA分子總數(shù)目(Mu)成正比數(shù)量關(guān)系第四十五頁，共五十一頁。一條探針，兩條引物引物位于探針的兩邊一條探針，兩個(gè)基團(tuán)(Tuan)前邊是報(bào)告基團(tuán)，后邊是淬滅基團(tuán)

3'5'RQ3'3'5'5'3'5'5'２．TaqMan探針/水解探針第四十六頁，共五十一頁。每產(chǎn)生一條DNA鏈，就切斷一條探針每切斷一條探針，就產(chǎn)生一個(gè)單位信號信號強(qiáng)(Qiang)度與結(jié)合探針的DNA分子數(shù)成正比數(shù)量關(guān)系5’TaqMan探針上游引物3’3’5’下游引物RQ3’5’3’5’QR第四十七頁，共五十一頁。Real-timePCR反應(yīng)體(Ti)系cDNA第一鏈