定稿動物細胞融合與單克隆抗體課件

定稿動物細胞融合與單克隆抗體課件定稿動物細胞融合與單克隆抗體課件定稿動物細胞融合與單克隆抗體課件如果將奶牛的細胞與植物細胞雜交，得到綠色的小奶牛，那豈不是只要曬曬太陽就可以擠出牛奶嗎？動物細胞也能融合嗎？一、動物細胞融合

細胞融合是正常的生命活動兩個細胞正在融合受精作用思考：1、什么叫動物細胞融合？2、促進細胞融合的方法有哪些3、細胞融合技術(shù)最大的優(yōu)點是什么？4、植物體細胞雜交與動物細胞融合有哪些異同？物理法化學(xué)法生物法

電場法(效率高、傷害小、易操作)（離心、振動、電刺激）聚乙二醇（PEG）

滅活的病毒（滅活的仙臺病毒）鏈接:病毒促融細胞滅活的病毒顆粒黏附于細胞表面細胞膜被病毒顆粒穿通細胞膜連接細胞融合，形成雜種細胞滅活病毒誘導(dǎo)細胞融合的原理：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細胞互相凝聚，細胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細胞膜打開，細胞發(fā)生融合。滅活是指用物理或化學(xué)手段使病毒或細菌失去感染能力，但并不破壞這些病原體的抗原結(jié)構(gòu)。主要用于制備單克隆抗體獲得雜種植株主要用途物理、化學(xué)方法（同左）滅活的病毒物理（離心、振動、電刺激）化學(xué)（聚乙二醇）誘導(dǎo)方法使細胞分散后誘導(dǎo)細胞融合去除細胞壁后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合細胞融合的方法細胞膜的流動性細胞膜的流動性、植物細胞全能性細胞融合的原理動物細胞融合植物體細胞雜交比較項目植物體細胞雜交與動物細胞融合的比較2.動物細胞融合的概念動物細胞融合也稱細胞雜交，是指兩個或多個動物細胞結(jié)合形成一個細胞的過程，融合后形成的具有原來兩個或多個細胞遺傳信息的單核細胞稱為雜交細胞。提問？1.抗體是由何種細胞產(chǎn)生的？效應(yīng)B細胞（漿細胞）。2.一個Ｂ淋巴細胞(漿細胞)能分泌多種抗體嗎？每一個Ｂ淋巴細胞只分泌一種特異性抗體。3.一種抗原侵入機體之后，引起機體免疫反應(yīng)產(chǎn)生的抗體只有一種嗎？動物在免疫反應(yīng)過程中，體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體種類可多達百萬種以上。4.簡述獲得抗體的傳統(tǒng)途徑？抗原動物體抗體抗原不純抗體不純二、單克隆抗體刺激漿細胞6.如何獲得化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強的抗體？

體外培養(yǎng)單個Ｂ淋巴細胞，提取分泌的抗體7.體外培養(yǎng)淋巴細胞能無限增殖嗎怎樣解決這個問題？5.這種方法獲得的抗體有什么缺陷？產(chǎn)量低，純度低，特異性差一個B淋巴細胞——只分泌一種特異性抗體小鼠骨髓瘤細胞——能無限增殖雜交瘤細胞既能分泌一種特異性抗體又能無限增殖1975年英國科學(xué)家米爾斯坦和柯勒設(shè)想：

B淋巴細胞的特點：１．B淋巴細胞受抗原刺激后，可以產(chǎn)生抗體。

２．動物體內(nèi)的B淋巴細胞可以產(chǎn)生百萬種以上的抗體，每種抗體對特定的抗原具有特異性免疫作用。

３．每一個B淋巴細胞只能產(chǎn)生一種特異性抗體。單克隆抗體制備過程專一抗體檢驗陽性單克隆抗體

注射抗原B淋巴細胞骨髓瘤細胞細胞融合雜交瘤細胞細胞培養(yǎng)篩選，繼續(xù)培養(yǎng)足夠數(shù)量的、能產(chǎn)生特定抗體的細胞群體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔篩選創(chuàng)始人：米爾斯坦雜交細胞滅活的病毒等手段小鼠骨髓瘤細胞B淋巴細胞經(jīng)免疫的小鼠提取雜交瘤細胞第一次篩選用特定的選擇性培養(yǎng)基第二次篩選能產(chǎn)生特定抗體、培養(yǎng)條件下能無限增殖的雜交瘤細胞體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔提取單克隆抗體整個制備過程為何要經(jīng)過兩次篩選第一次篩選得到雜交瘤細胞（多種），第二次需先在多孔培養(yǎng)板上，在每孔只有一個雜交瘤細胞的情況下開始培養(yǎng)，然后再篩選出能產(chǎn)生特異性抗體的細胞群。由于該細胞群是單個雜交瘤細胞克隆得來的，所以產(chǎn)生的抗體必然是化學(xué)性質(zhì)單一的，特異性強的單克隆抗體。這里的單克隆確有單個細胞克隆的含義，只不過克隆的不是B淋巴細胞，而是雜交瘤細胞。※知識拓展：如何進行雜交瘤細胞的抗體檢測及克隆化培養(yǎng)？

融合后的細胞經(jīng)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)后，能存活的細胞就是雜交瘤細胞。但這些雜交瘤細胞并非都是能分泌所需抗體的細胞，通常用“有限稀釋法”來選擇。將雜交瘤細胞稀釋，用多孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，使每孔細胞不超過一個，通過培養(yǎng)讓其增殖。然后檢測各孔上清液中細胞分泌的抗體（常用酶聯(lián)免疫吸附試驗法），那些上清液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽性孔。陽性孔中的細胞還不能保證是來自單個細胞，挑選陽性孔的細胞繼續(xù)進行有限稀釋，一般需進行3～4次，直至確信每個孔中增殖的細胞為單克隆細胞。該過程即為雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)。植物體細胞雜交和動物細胞融合的比較比較項目植物體細胞雜交動物細胞融合細胞融合原理細胞膜的流動性細胞膜的流動性細胞融合的方法去除細胞壁后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合使細胞分散后誘導(dǎo)細胞融合誘導(dǎo)方法物理（離心、振蕩、電刺激）化學(xué)（聚乙二醇）物理、化學(xué)方法（同左）滅活的病毒用途獲得雜種植株制備單克隆抗體思考：1、本過程利用了哪些原理？免疫原理，細胞融合原理和動物細胞培養(yǎng)原理2、為什么選用小鼠骨髓瘤細胞與B細胞融合？這樣融合成的雜交瘤細胞，繼承了雙親細胞的遺傳物質(zhì)，不僅具有B細胞分泌抗體的能力，而且還有無限增殖的本領(lǐng)，因而可以獲得大量單克隆抗體特異性強、純度高、靈敏度高，產(chǎn)量大、容易標準化生產(chǎn)。單克隆抗體的優(yōu)點單克隆抗體的應(yīng)用１、可用于作為診斷試劑：有準確，高效，簡易、快速的優(yōu)點２、可用于疾病治療３、可用于運載藥物（作為運載對應(yīng)疾病的藥物的“生物導(dǎo)彈”。）“生物導(dǎo)彈”＝單克隆抗體＋藥物知識結(jié)構(gòu)兩個過程動物細胞培養(yǎng)過程單克隆抗體制備過程三個“一”一個誘導(dǎo)細胞融合的新方法－－滅活的病毒一個新細胞－－雜交瘤細胞一個優(yōu)勢－－單克隆抗體特異性強、靈敏度高的優(yōu)勢三.思考與探究1.植物體細胞雜交技術(shù)與動物細胞融合技術(shù)有什么不同？2.制備單克隆抗體時，為什么要選用B淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合形成雜交瘤細胞？提示：植物體細胞雜交技術(shù)與動物細胞融合技術(shù)基本相同，不同的是植物體細胞融合前需去掉細胞壁，然后再融合；動物細胞融合是兩個體細胞直接融合。

提示：哺乳動物感染抗原后，其體內(nèi)會形成相應(yīng)的B淋巴細胞，B淋巴細胞能分泌相應(yīng)的抗體凝聚或殺死這些抗原。動物在免疫反應(yīng)的過程中，每一種B淋巴細胞能分泌一種特異性抗體，要想獲得大量的特異性抗體，必須使能分泌該單一抗體的B淋巴細胞大量增殖。B淋巴細胞具有產(chǎn)生單一抗體的能力，但不能在體外增殖；骨髓瘤細胞是一種癌細胞，它能在體外培養(yǎng)條件下無限增殖，但不能產(chǎn)生抗體。因此，把一種B淋巴細胞與骨髓瘤細胞進行細胞融合，產(chǎn)生雜交瘤細胞，它會兼有兩個親本細胞的特性──在體外培養(yǎng)條件下能不斷增殖，同時能產(chǎn)生出某種特異性的抗體。

教學(xué)參考1.已成功的動物細胞融合實例還有哪些？生物種類細胞來源成功年代酵母菌—雞原生質(zhì)體—血紅細胞1975年人—胡蘿卜腹水癌細胞—原生質(zhì)體1976年人—小鼠纖維肉瘤細胞—畸胎瘤細胞1978年要知道更多的實例，需經(jīng)常查閱更多科研報道。2.為什么不用兩個而要用多個細胞進行動物細胞間的融合？就目前常用的細胞融合方法來看，不管是用物理的、化學(xué)的方法，還是生物的方法，其融合率都不可能是100%。僅用兩個細胞融合，其效率太低，不一定能得到融合細胞。更重要的是，即使兩個細胞已發(fā)生融合，但并不一定是研究者期望得到的細胞類型。目前動物細胞融合技術(shù)最有價值的應(yīng)用就是單克隆抗體的制備。我們以制備單克隆抗體為例來說明這一問題。我們知道，體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體種類可多達百萬種以上，但是每一個B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體，如果僅取一個脾細胞（含B淋巴細胞）和一個瘤細胞雜交，我們不能確定該脾細胞分泌的抗體是否正是我們所需要的；若用大量的脾細胞和瘤細胞進行融合，就可以從融合細胞中篩選出能分泌所需抗體的雜交瘤細胞。3.如何進行雜交瘤細胞的抗體檢測及克隆化培養(yǎng)？融合后的細胞經(jīng)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)后，能存活的細胞就是雜交瘤細胞。但這些雜交瘤細胞并非都是能分泌所需抗體的細胞，通常用“有限