常見問題分析及解決策略

關(guān)于常見問題分析及解決策略第1頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三PCR技術(shù)簡介PCR常見問題、原因分析及其解決方案提高PCR反應(yīng)特異性的策略臨床PCR檢測的常見問題定量PCR常見問題第2頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三PCR標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系DNA模板引物反應(yīng)緩沖液Mg2＋濃度

dNTPsdH2O

耐熱聚合酶第3頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三反應(yīng)體系對PCR擴(kuò)增的影響DNA模板純度蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)會抑制PCR反應(yīng)完整性

模板降解會導(dǎo)致PCR擴(kuò)增無產(chǎn)物濃度加量過多導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增增加引物特異性長度適當(dāng)、避免二級結(jié)構(gòu)和二聚體完整性避免反復(fù)凍融濃度應(yīng)適當(dāng),過高導(dǎo)致非特異性增加,

過低則擴(kuò)增產(chǎn)物太少第4頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三反應(yīng)體系對PCR擴(kuò)增的影響過高非特異性嚴(yán)重過低無擴(kuò)增產(chǎn)物濃度適當(dāng)避免反復(fù)凍融pH值適當(dāng)避免污染pH值,鹽離子濃度穩(wěn)定劑,增強(qiáng)劑反應(yīng)緩沖液dNTPsdH2OMg2＋濃度第5頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三如何選擇最合適的DNA聚合酶PCR用耐熱DNA聚合酶Taq酶pfu酶HotstartTaq酶混合酶Taq

plusLongTaqTaqplatinum第6頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三特異性-----基因組擴(kuò)增、RT-PCR保真性-----基因篩選、測序、克隆長片段擴(kuò)增-----構(gòu)建基因圖譜、測序等擴(kuò)增效率-----復(fù)雜模板擴(kuò)增（GC含量高、二級結(jié)構(gòu)）PCR試劑盒-----復(fù)雜模板擴(kuò)增、大規(guī)?；驒z測如何選擇最合適的DNA聚合酶-----根據(jù)PCR實(shí)驗(yàn)需求第7頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三PCR常見問題之一-----無擴(kuò)增產(chǎn)物現(xiàn)象：正對照有條帶，而樣品則無

M12正對照原因模板含有抑制物，含量低Buffer對樣品不合適引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降解反應(yīng)條件：退火溫度太高，延伸時間太短純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA或加大模板的用量更換Buffer或調(diào)整濃度重新設(shè)計(jì)引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu)）或者換一管新引物降低退火溫度、延長延伸時間對策第8頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三PCR常見問題之二-----非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象：PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。原因?qū)Σ咭锾禺愋圆钅０寤蛞餄舛冗^高酶量過多Mg2+濃度偏高退火溫度偏低循環(huán)次數(shù)過多重新設(shè)計(jì)引物或者使用巢式PCR適當(dāng)降低模板或引物濃度適當(dāng)減少酶量降低鎂離子濃度適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法減少循環(huán)次數(shù)第9頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三PCR常見問題之三-----拖尾現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)M12原因?qū)Σ吣０宀患傿uffer不合適退火溫度偏低酶量過多dNTP、Mg2+濃度偏高循環(huán)次數(shù)過多純化模板更換Buffer適當(dāng)提高退火溫度適量用酶適當(dāng)降低dNTP和鎂離子的濃度減少循環(huán)次數(shù)第10頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三PCR常見問題之四-----假陽性現(xiàn)象：空白對照出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物原因靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染對策操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外；除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用。各種試劑最好先進(jìn)行分裝，然后低溫貯存。第11頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三提高PCR反應(yīng)特異性策略巢式PCR（Nest-PCR）

遞減PCR（TouchDownPCR）

熱啟動PCR（HotStartPCR）

使用PCR增強(qiáng)劑第12頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三策略之一巢式PCRPF1PR1PF2PR2

巢式PCR的使用降低了擴(kuò)增多個靶位點(diǎn)的可能性，因?yàn)橥嗵滓锒蓟パa(bǔ)的靶序列很少。

巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的靈敏度，并且提高了困難PCR（如5'RACE）的特異性。

第13頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三策略之二遞減PCR

遞減PCR通過在PCR的前幾個循環(huán)使用嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐嘶饤l件提高特異性。循環(huán)設(shè)在比估算的Tm高大約5℃的退火溫度下開始，然后每個循環(huán)降低1-2℃,直到退火溫度低于Tm5℃。特異性最高的目的模板會被優(yōu)先擴(kuò)增，這些產(chǎn)物在隨后的循環(huán)中繼續(xù)擴(kuò)增占據(jù)優(yōu)勢。遞減PCR對于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更為有用，如AFLP、DNA指紋分析等。第14頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三策略之三熱啟動PCR

熱啟動主要是通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀達(dá)到變性溫度；現(xiàn)在有很多公司都有HotStartTaq酶出售，該酶具有熱啟動的性能，使用簡單方便，適合于高通量應(yīng)用；熱啟動PCR是除了好的引物設(shè)計(jì)之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。第15頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三策略之四使用PCR增強(qiáng)劑

甲酰胺、DMSO、甘油、甜菜堿等都可充當(dāng)PCR的增強(qiáng)劑。其可能的機(jī)理是降低熔解溫度，從而有助于引物退火并輔助DNA聚合酶延伸通過二級結(jié)構(gòu)區(qū)。增強(qiáng)劑濃度要適當(dāng)。第16頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三熒光定量PCR常見問題熒光定量PCR擴(kuò)增效率確認(rèn)：相關(guān)系數(shù)（R2）：大于0.98標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率：-3~-3.5PCR擴(kuò)增效率（E）：0.9~1.2重復(fù)性好：STD＜0.2特異性好第17頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三熒光定量PCR常見問題無Ct值（信號）出現(xiàn)或出現(xiàn)過晚：陰性對照出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增：熒光PCRmix或水污染；出現(xiàn)引物二聚體：設(shè)計(jì)特異性引物。反應(yīng)循環(huán)數(shù)不夠；檢測熒光信號步驟有誤；引物、探針設(shè)計(jì)不佳或降解；模板量少或降解。反應(yīng)條件或體系不佳：優(yōu)化；擴(kuò)增片段過長：100~200bp。第18頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三熒光定量PCR常見問題溶解曲線不止一個主峰：引物設(shè)計(jì)不佳：設(shè)計(jì)特異性引物；引物濃度不適：降低引物濃度；退火溫度低：調(diào)整退火溫度；鎂離子濃度過高：降低鎂離子濃度；模板中有基因組污染：注意提取過程；耗材儀器不匹配；反應(yīng)體系污染等：設(shè)置陽性陰性對照。第19頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三熒光定量PCR常見問題擴(kuò)增效率低：重復(fù)性不好：反應(yīng)體系中部分成分尤其是熒光染料降解；反應(yīng)條件不佳：延長退火、延伸時間，改為三步法，降低退火溫度，提高引物濃度，重新設(shè)計(jì)引物；反應(yīng)體系中有抑制物：一般為模板引入。加樣不準(zhǔn)確；儀器溫度均一性不好；模板濃度低。第20頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三熒光定量PCR常見問題擴(kuò)增曲線不正常：基線等設(shè)置不當(dāng)：減小基線終點(diǎn)；模板量過多：將模板稀釋。第21頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三臨床PCR檢測的常見問題假陽性問題假陰性問題定量問題方法學(xué)問題：靶基因序列特異性、引物錯配、非特異性擴(kuò)增污染問題：樣本污染、產(chǎn)物污染試劑因素操作因素儀器因素標(biāo)本因素外標(biāo)定量與內(nèi)標(biāo)定量第22頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三臨床PCR檢測常見問題解決辦法嚴(yán)格區(qū)分及實(shí)驗(yàn)人員培訓(xùn)；使用UNG技術(shù)。假陽性解決辦法：假陰性解決辦法：設(shè)置陽性對照監(jiān)測試劑問題；降低操作難度，提高操作人員素質(zhì)；陽性對照、標(biāo)準(zhǔn)曲線或使用內(nèi)對照監(jiān)控儀器故障；使用抗干擾能力強(qiáng)的試劑提取樣本DNA。第23頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三臨床PCR檢測常見問題解決辦法外標(biāo)定量與內(nèi)標(biāo)定量：第24頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三RT常見問題

第25頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三RNA降解或起始量少