PCR反應(yīng)模板核酸的提取制備方法

PCR反應(yīng)模板核酸的提取制備方法PCR反應(yīng)的關(guān)鍵因素緊要有引物的選擇與設(shè)計，酶的質(zhì)量。模板的制備，在前二者都穩(wěn)定可行的情況下，PCR模板的制備尤為緊要。模板處理方法的選擇及操作人員的基本技能，決議分別模板核酸（DNA或RNA）的質(zhì)和量及PCR的成敗。而提高模板核酸質(zhì)量的關(guān)鍵是除去雜質(zhì)（蛋白質(zhì)、酶、脂肪等）。除去抑制TaqDNA聚合酶活性抑制因子，提高模板核酸的產(chǎn)量。傳統(tǒng)的核酸模板提取方法是接受去垢劑如SDS等來破壞細胞組份，溶解細胞膜，使蛋白質(zhì)變性，再用蛋白酶K來消化去除蛋白質(zhì)，尤其是與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)，再用酚:抽提，然后用乙醇或異丙醇沉淀核酸，供PCR試驗用。但近幾年來也進展了些簡便應(yīng)用較為有效的標本消化處理方法。亦可充分PCR試驗的要求。接受哪種方法消化處理標本，視PCR試驗的目的（是科研還是檢測）及環(huán)境條件而定。模板核酸的提取制備方法:一、蛋白酶K消化裂解法：適用于全部標本的消化處理，尤以DNA樣品為佳。如組織細胞（包括石蠟包埋組織）絨毛、毛發(fā)、精斑、血液（血清、血漿、全血）局部分泌物、尿，糞便等。1、試劑配制1）蛋白酶K消化液:10mmol/LTris.cl（PH8.0）10mmol/LEDTA150mmol/LNaCL0.5%SDS100～200ug/ml蛋白酶K.2）蛋白酶K最好用水配成20mg/ml，臨用時加入消化液中。2、提取方法:有些標本、在用蛋白酶K消化前，還需預(yù)處理一下，如糞便、分泌物、痰液、組織塊、石蠟包埋組織等，其方法有離心去掉雜質(zhì)，脫蠟等。臨床標本或經(jīng)預(yù)處理的標本加蛋白酶K裂解液50～100ul.混勻，55℃1～3小時，或37℃過夜。加等體積的飽和酚抽提1～2次，再加等體積的:（49:1）抽提一次，上清加入1/10體積的pH值5.23mmol/L醋酸鈉緩沖液，加入2.5倍體積的冰冷無水乙醇（或加等體積的異丙醇）—20℃放置至少3h.取出后14000轉(zhuǎn)/min離心15min.當(dāng)心吸棄或倒出上清，沉淀加入75%冰冷乙醇15000r/min5min離心洗滌1～2次，特別當(dāng)心的吸棄或倒掉上清，真空或37℃溫箱或室溫干燥，加TE緩沖液20ul.溶解后，取3～8ul用于PCR擴增，或放—20℃保存。蛋白酶K消化法除上述經(jīng)典處理法外，亦可在蛋白K消化處理標本，經(jīng)離心處理后，吸取上清經(jīng)95～97℃或煮沸10min滅活蛋白酶K后，直接作核酸模板用于PCR擴增。如雜質(zhì)較多，還可經(jīng)酚:抽提后，即可用于PCR反應(yīng)。此法蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)除去*，Taq酶活性不受影響，具有良好的重復(fù)性與穩(wěn)定性。但操作繁復(fù)，技術(shù)要求高。二、直接裂解法:標本（組織細胞，分泌物）加PBS或生理鹽水離心洗滌后，加消化裂解液20～50ul（0.5%NP—40和0.5%吐溫—20），95～98℃，15～30min以裂解病原體，裂解細胞。然后12000r/min離心5～10min，取上清20～30ul用于PCR擴增。血清標本可直加等體積的消化液，加熱處理離心后PCR擴增。亦有用5%的NP—40和1.5%2—ME做裂解液，95℃30min消化處理，離心取上清，PCR擴增檢測HBVDNA.三、堿變性法:取血清20ul，加入1mol/LNaOH20ul，37℃30min，離心，加1mol/LHCl20ul，離心后，取上清5ul，用于PCR擴增。*亦有用10ul血清加NaOH至0.2mol/L，37℃1h，再加HCL中和離心后取上清10ul做PCR，其特異性和敏感性較前法更好。四、煮沸法:經(jīng)離心洗滌過的組織細胞，分泌物及血液標本，加適量無菌蒸餾水或PBS，混勻后，100℃煮沸10～15min，14000r/min10min，取上清做PCR.五、碘化鈉法:取組織細胞及抗凝血液10～100ul，加等體積的6MNaI，反復(fù)輕混20s，加等體積:（49:1）振勻后，離心取上清加0.6體積的異丙醇，混勻后置室溫3min.14000r/min10min，沉淀加10～100ul，TE溶解，取5～10ul做PCR，亦有用100ul血清加裂解液300ul（6MNaI，0.5%十二烷基肌酸鈉，10ug糖原，26mmol/LpH8.0Tris—HCL，13mmol/LEDTA）混勻后，60℃15min，加等體積異丙醇，離心沉定后，加TE液用于PCR擴增，其產(chǎn)量和質(zhì)量較高。六、異硫氰酸胍法此法緊要用于RNA的提取。標本為組織細胞及血清等。1、異硫氰酸胍消化液異硫氰酸胍4mol/L檸檬酸鈉（PH7.0）25mmol/L十二烷基肌酸鈉0.5%β—巰基乙醇0.1mol/L2、消化方法:用50～100ul細胞懸液及血清，加等體積的異硫氰酸胍消化液振混勻后，或65℃1小時，或室溫放置數(shù)分鐘，然后加1/10體積的3mmol/LpH5.2的醋酸鈉緩沖液，再加等體積的酚：用力振搖約10s，10000r/min，離心5min，取上清加等體積異丙醇—20℃放置3h后，14000r/min離心15min，沉定用75%冰冷乙醇離心洗滌1～2次，真空干燥，沉淀用TE緩沖