放射性示蹤的標(biāo)記技術(shù)

關(guān)于放射性示蹤的標(biāo)記技術(shù)第1頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)

放射性標(biāo)記的基本知識

天然放射性核素，半衰期比較長，比活度較低，分布分散而且品種有限。人工放射性核素，可用核反應(yīng)堆、加速器和核素發(fā)生器生產(chǎn)，其原始狀態(tài)通常都是無機(jī)鹽類。例如Ba14CO3，NaH232PO4，45CaCl2，59FeCl314C、3H、32P、35S和125I等作示蹤原子，并且要把它們做成與體內(nèi)物質(zhì)相應(yīng)的有機(jī)化合物而開展示蹤研究。第2頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四標(biāo)記化合物的概念凡是分子中某一原子或某些原子（或基團(tuán)）被放射性核素或穩(wěn)定核素所取代，而成為一類易被識別的化合物，則稱之為標(biāo)記化合物。第3頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四標(biāo)記化合物的分類1．同位素標(biāo)記化合物（isotopiclabeledcompound）化合物中某元素的穩(wěn)定同位素原子被同一元素的放射性同位素或穩(wěn)定同位素原子取代，取代前后的化合物在理化性質(zhì)上完全相同（同位素效應(yīng)除外），這類標(biāo)記稱為同位素標(biāo)記（isotopiclabeling）。2．非同位素標(biāo)記化合物（nonisotopiclabeledcompound）該類標(biāo)記化合物是用化學(xué)性質(zhì)相似或根本不同的放射性核素取代原化合物中所含的某元素的穩(wěn)定核素原子。這種標(biāo)記稱非同位素標(biāo)記（nonisotopiclabeling）。第4頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四標(biāo)記化合物的命名有機(jī)標(biāo)記化合物的命名，通常先指出標(biāo)記位置，再列出標(biāo)記核素，最后是化合物的名稱，如l-14C-醋酸。無機(jī)標(biāo)記化合物命名，通常在化合物的前面注明放射性核素，也可把標(biāo)記核素直接寫在分子式內(nèi)，如125I-碘化鈉（125I-NaI）或Na125I。第5頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四標(biāo)記化合物的分型l.定位標(biāo)記S（specificlabeling）它是指放射性核素只局限于標(biāo)記化合物分子中某一特定的位置上，而在其他位置上的同種原子就不具有放射性。常用“S”表示，如1-14C（S）-乙酸或1-14C-乙酸，表示第1位碳原子被放射性14C標(biāo)記。2.準(zhǔn)定位標(biāo)記n（nominallabeling）在3H標(biāo)記中，理論上應(yīng)獲得預(yù)期的定位標(biāo)記分子，實(shí)際上，3H在預(yù)期位置上的分布，有時低于化合物中3H總量的95％，或百分比值不詳。此類標(biāo)記稱準(zhǔn)定位標(biāo)記，用“n”表示。這是一種名義上的定位標(biāo)記，因此，也稱名義定位標(biāo)記。第6頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四標(biāo)記化合物的分型3.均勻標(biāo)記U（uniformlabeling）是一種非定位標(biāo)記（non-specificlabeling），常用于14C標(biāo)記的化合物中。它是指整個分子中某元素所有的原子均可能被放射性同位素取代，取代的幾率是相等的，而且放射性原子在分子中的分布是均勻的，達(dá)到統(tǒng)計學(xué)上的均一性。4.全標(biāo)記G（generallabeling）它是指化合物中某種原子不管在什么位置上都可能是帶放射性的。全標(biāo)記主要用于3H標(biāo)記的化合物，在化合物分子中，任何有氫元素的位置上，都可能被氚所取代。但是由于各個氫原子在分子中的位置不同，在標(biāo)記制備過程中被氚取代的幾率不同，不具有統(tǒng)計學(xué)上的均一性，因而全標(biāo)記的化合物往往是全而不均的。第7頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四標(biāo)記化合物的分型5.雙標(biāo)記或多標(biāo)記（doublelabelingormultiplelabeling）在生物學(xué)示蹤實(shí)驗(yàn)中，有時需要在化合物分子中引入兩種或兩種以上元素的同位素，或引入一種元素的兩種或兩種以上的同位素原子，這種標(biāo)記化合物稱為雙標(biāo)記或多標(biāo)記化合物。例如15NH214CH２COOH（氨基乙酸）第8頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四第二節(jié)

放射性標(biāo)記的基本方法

1．標(biāo)記核素的選擇（1）合適的核性質(zhì)：γ射線；半衰期；比活度；（2）得到的產(chǎn)物與被示蹤化合物性質(zhì)應(yīng)盡量接近；（3）標(biāo)記方便，標(biāo)記的化合物穩(wěn)定第9頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四放射性核素標(biāo)記的基本方法2．核素標(biāo)記的要求：（1）放射性核素標(biāo)記率應(yīng)盡量高，未標(biāo)記的核素應(yīng)注意回收利用。（2）放射性核素標(biāo)記需用微量或超微量方法進(jìn)行標(biāo)記、純化和鑒定。（3）盡量減少放射性核素的稀釋，避免加入不必要的載體；（4）最好用同位素標(biāo)記。如使用非同位素標(biāo)記，則標(biāo)記位置應(yīng)以不影響標(biāo)記分子的特定功能為佳；（5）標(biāo)記過程應(yīng)簡單、快速。最好在標(biāo)記的最后階段加入核素，以減少損失和污染；有條件時，在標(biāo)記前作冷實(shí)驗(yàn)，以取得經(jīng)驗(yàn)。第10頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四放射性標(biāo)記基本方法

1．化學(xué)合成標(biāo)記法（chemicalsynthesis）此方法是通過化學(xué)反應(yīng)將放射性核素引入化合物中。換言之，就是將放射性核素的初始原料，通過選定的工藝步驟，合成所需要的標(biāo)記化合物。此法不僅比活度高，而且能夠定位標(biāo)記，但合成步驟較多。14C、3H和放射性碘標(biāo)記化合物常用此法進(jìn)行合成標(biāo)記。這類標(biāo)記化合物已廣泛用于藥理、代謝和分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)等方面的研究。對于需要制備的標(biāo)記化合物來說，當(dāng)然是已知結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。第11頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四化學(xué)合成標(biāo)記法

（chemicalsynthesis）注意以下幾個問題：（1）必須注意操作量與比活度的關(guān)系對生物學(xué)示蹤實(shí)驗(yàn)來說，使用的標(biāo)記化合物的量愈少，愈接近于生物體的正常生理狀態(tài)。但另一方面，示蹤物質(zhì)進(jìn)入生物體以后，要受到大量正常物質(zhì)的稀釋，需要使用的標(biāo)記化合物的比活度愈高愈好。第12頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四1.化學(xué)合成標(biāo)記法（2）必須有較高的反應(yīng)產(chǎn)物。因?yàn)橛袡C(jī)反應(yīng)常常伴隨許多副反應(yīng)產(chǎn)物。較高的反應(yīng)產(chǎn)物一方面使原料的利用率高，更主要的是減少了樣品中的放射性雜質(zhì)。（3）標(biāo)記化合物必須在完全密封的系統(tǒng)內(nèi)有機(jī)合成因?yàn)樗械臉?biāo)記化合物的合成都要從簡單的放射性無機(jī)鹽類開始，大部分中間產(chǎn)物都是低分子量的放射性氣體或者揮發(fā)性液體，為了安全防護(hù)和防止物料損失，一般反應(yīng)要在“真空線中”進(jìn)行。第13頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四2．同位素交換標(biāo)記法

（isotopeexchange）同位素交換標(biāo)記法是利用同一元素的放射性核素與化合物中的非放射性核素之間的交換反應(yīng)來制備所需要的標(biāo)記化合物。該方法操作快速、簡便。在放射性核素半衰期短、化學(xué)合成步驟多的情況下，該方法的實(shí)用意義更大。適用于大量有機(jī)化合物、天然產(chǎn)物或難以制得前體的標(biāo)記化合物的制備，是制備3H標(biāo)記化合物的重要方法。同位素交換法包括酶促合成法、催化交換法和氣體曝射法。第14頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四2．同位素交換標(biāo)記法

（isotopeexchange）（1）酶促合成法在酶的催化下，可以合成某些特殊的標(biāo)記化合物，例如γ-32P-ATP的合成常用此法。反應(yīng)機(jī)理是利用非放射性的腺苷三磷酸在3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶的催化下，使腺苷三磷酸γ位上的磷酸與磷-32標(biāo)記的無機(jī)磷酸鹽之間進(jìn)行同位素交換反應(yīng)。第15頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四2．同位素交換標(biāo)記法

（isotopeexchange）（2）催化交換法常用于氚標(biāo)記化合物的制備。將欲標(biāo)記的有機(jī)化合物和催化劑（常用PdO-BaSO4或者Pd-C）置于溶劑中，通入氚氣，室溫攪拌數(shù)小時后竟分離純化后即可得氚標(biāo)記的化合物。此法可制備氚標(biāo)記的氨基酸、嘌呤類核苷和核苷酸、激素等。液相的催化交換法是將待標(biāo)記物溶解在氚水（3H2O）中，用鈀、鉑作催化劑，在一定pH值和溫度下，置特定的真空系統(tǒng)里進(jìn)行氫和氚的交換反應(yīng)。第16頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四2．同位素交換標(biāo)記法

（isotopeexchange）（3）氣體曝射法將需要標(biāo)記的有機(jī)化合物置于比活度很高的氚氣中，密封放置幾天至幾星期，使氚氣中的氚與有機(jī)化合物中的氫原子發(fā)生交換反應(yīng)而制得氚標(biāo)記化合物?？捎酶哳l放電、微波、紫外線、γ射線照射等促使氚氣電離，或者在反應(yīng)中加貴金屬作催化劑，使交換標(biāo)記過程加速。第17頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四3．生物合成標(biāo)記法（biosynthesis）該方法是利用酶、微生物、動植物的生理代謝過程，引入放射性核素合成有機(jī)化合物。特別是對目前尚不能用人工方法合成的有機(jī)化合物，如某些激素、蛋白質(zhì)、抗生素、核酸、維生素等，可用生物合成法制備。生物合成法比化學(xué)合成法容易，能夠從自然界直接獲得有生物活性的異構(gòu)體。生物合成的缺點(diǎn)是產(chǎn)額低，標(biāo)記位置不易控制，易造成類似標(biāo)記物，增加了標(biāo)記的分離和提純的難度。生物合成法可分為兩類：全生物合成法和酶促合成法（enzymaticsynthesismethod）。第18頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四3．生物合成標(biāo)記法（biosynthesis）（1）全生物合成法

它是利用完整的生物或其某一個器官的生理代謝過程來進(jìn)行標(biāo)記。如生物合成氨基酸、糖和核酸均為全生物合成。常用的生物有細(xì)菌、藻類、酵母等低等生物，它們?nèi)菀自趯?shí)驗(yàn)室中培育，代謝旺盛，繁殖迅速，因而制備效率高。第19頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四3．生物合成標(biāo)記法（biosynthesis）（2）酶促合成法

它是利用生物組織中某種特定的酶，促進(jìn)標(biāo)記前體物質(zhì)的合成反應(yīng)，生成所需的標(biāo)記產(chǎn)物。在酶的催化下，可將放射性核素結(jié)合到生物分子上。該方法合成的標(biāo)記化合物很多是具有旋光性的異構(gòu)體，產(chǎn)物不必經(jīng)過分離。因此，酶促合成法也可看作是應(yīng)用特殊催化劑的化學(xué)合成法。例如，應(yīng)用3H、32P、35S等核素標(biāo)記的核苷酸類就屬于酶促合成法。第20頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四常用標(biāo)記化合物及其制備1．放射性碳的標(biāo)記化合物生物醫(yī)學(xué)中用得最多的是14C和11C。14C半衰期為5730年,半衰期長，能保證連續(xù)實(shí)驗(yàn)，又不需要進(jìn)行放射性衰變校正。只發(fā)射β-粒子（0.159MeV），用液閃測量很方便；外照射較弱，易防護(hù)；用于自顯影時，影像清晰；14C標(biāo)記化合物的放射性比活度可高達(dá)2308.8MBq／毫克原子，豐度可達(dá)100％（商品達(dá)80％以上）；14C可定位標(biāo)記，純化方便。與3H相比，14C標(biāo)記化合物輻射自分解速度低；由于構(gòu)成物質(zhì)的C－C鍵比較牢固，標(biāo)記化合物中的14C原子也比較穩(wěn)定。第21頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四1．放射性碳的標(biāo)記化合物由反應(yīng)堆生產(chǎn)的14C為Ba14CO3，放射性碳的標(biāo)記常從最簡單的化合物（如11CO2或Ba14CO3）為原料，先制備出一批基本的“鑰匙”化合物，然后逐步合成得到更復(fù)雜的所需的產(chǎn)品。14C標(biāo)記化合物制備工藝復(fù)雜，要求設(shè)備條件高和防護(hù)措施全。一般放射性實(shí)驗(yàn)室從事14C標(biāo)記有一定的困難。14C標(biāo)記化合物的制備方法，基本上分為化學(xué)合成法、生物合成法和輻射合成法三類。第22頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四（1）14C標(biāo)記化合物的有機(jī)合成以Ba14CO3為起始物制備14C的標(biāo)記化合物可通過以下三條途徑：①通過14CO2合成②通過14C–氰化鈉（Na14CN）合成③通過14CH≡14CH合成第23頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四（2）14C標(biāo)記化合物的生物合成將某一植物放在充滿14CO2的密閉室里，用強(qiáng)光照射時，葉子進(jìn)行光合作用。幾個小時以后，葉子中已合成了標(biāo)記的葡萄糖、淀粉和其他化學(xué)成分。如果植物的量足夠多，根據(jù)需要可進(jìn)行分離提取，有些標(biāo)記的藥物就是這樣制備出來的。用這種生物合成的方法，可以準(zhǔn)確地制備某種具有生理活性的旋光異構(gòu)體。第24頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四2．3H標(biāo)記化合物在生物學(xué)示蹤實(shí)驗(yàn)中，氚的重要性僅次于14C。氚標(biāo)記化合物有許多突出的特點(diǎn)：（1）氚的半衰期為12.35a，故有充裕的時間制備標(biāo)記化合物和從事示蹤研究。（2）氚的比活度高，可達(dá)1077.44GBq／毫克分子，比較容易獲得高比活度的標(biāo)記化合物。并可借助核磁共振儀鑒定3H在標(biāo)記物中的標(biāo)記結(jié)構(gòu)。（3）氚為弱β-輻射體（Emax=18.4keV），射線能量低，射程短，操作時易于防護(hù)，在放射自顯影中具有很好的分辨率。（4）氚的豐度高，標(biāo)記化合物的制備方法較14C容易。一些難以用14C標(biāo)記的化合物，如肽類、蛋白質(zhì)等，?？捎?H標(biāo)記。此外，還能作為碳骨架結(jié)構(gòu)的示蹤劑，這點(diǎn)是14C所不及的。第25頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四2．3H標(biāo)記化合物氚標(biāo)記化合物的缺點(diǎn)是碳-氚鍵的結(jié)合不夠牢固，有時會發(fā)生丟失；分子中氚標(biāo)記的位置不易準(zhǔn)確估計；氚標(biāo)記的化合物比相同比活度的14C標(biāo)記的化合物因受輻射而分解的程度嚴(yán)重的多。氚標(biāo)記的化合物的用途較廣，用化學(xué)合成法、同位素交換法和生物合成法均可制備。第26頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四（1）氚標(biāo)記化合物的有機(jī)合成法氚標(biāo)記的原始原料是氚氣和氚水。①以氚氣（T2）為原料，通常對氚的豐度和比活度要求很高，一般有催化法、氚鹵置換和還原法三種。氚特別適于標(biāo)記比較復(fù)雜的化合物，例如酶、蛋白質(zhì)和藥物等。將待標(biāo)記化合物研成粉末，放在管子里，通入高活性的氚氣。當(dāng)氚氣與有機(jī)化合物密切接觸時，大量的β射線足以使C-H鍵斷裂，形成不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物，可以與氚結(jié)合形成新的C-T鍵，于是經(jīng)過取代反應(yīng)氚就進(jìn)入待標(biāo)記化合物的分子中。②以氚水（T2O）為原料。第27頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四（2）氚標(biāo)記化合物的生物合成法利用細(xì)胞離體培養(yǎng)法可以制備比活度較高的標(biāo)記核酸。分子生物學(xué)的核酸標(biāo)記方法，是利用酶促反應(yīng)將3H標(biāo)記的NTP或dNTP通過DNA合成反應(yīng)參入到核酸分子的內(nèi)部，或通過酶促將其連接到核酸分子兩端。第28頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四3.碘標(biāo)記化合物化學(xué)合成法:一般先將放射性碘離子氧化成分子碘（2Na*I+H2O2→2NaOH+*I2）或者一氯化碘，然后利用有機(jī)化合物很易發(fā)生碘代反應(yīng)的特點(diǎn)，制備碘標(biāo)記的化合物。氧化反應(yīng)通常使用的氧化劑有H2O2

，ICl和氯胺-T等。第29頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四第三節(jié)

蛋白質(zhì)和多肽的放射性碘標(biāo)記

原理:

大多數(shù)有機(jī)化合物分子中并沒有碘原子，但由于碘原子具有高度的化學(xué)活性，所以放射性碘很容易通過置換法取代肽鏈上酪氨酸苯環(huán)的氫原子而得到碘標(biāo)記的化合物。碘標(biāo)記率與被標(biāo)記的蛋白質(zhì)、多肽類激素分子中酪氨酸的含量及暴露程度有關(guān)。放射性碘有131I、125I、123I、124I等，其中125I和131I是生物醫(yī)學(xué)中最常用的放射性核素。第30頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四碘標(biāo)記化合物的優(yōu)點(diǎn)放射性比活度高，可提高分析的靈敏度；它們的半衰期不短也不長，很適于生物樣品的測量；特別是125I能放出均勻的γ射線，便于體外進(jìn)行γ計數(shù)測量，易于推廣。放射免疫測定法多半使用碘標(biāo)記的化合物，可用碘-125放免儀進(jìn)行測量。123I和124I標(biāo)記化合物主要用于核醫(yī)學(xué)臨床功能檢查，131I用于甲狀腺疾病和各種腫瘤的治療，125I標(biāo)記化合物則主要用于生物醫(yī)學(xué)研究與體外示蹤分析。第31頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四放射性碘的標(biāo)記方法1.氯胺-T（Ch-T）法氯胺-T是一種較溫和的氧化劑，在水溶液中形成次氯酸，能連續(xù)不斷地將溶液中的碘離子I-氧化為分子態(tài)的碘*I2或*I+，在pH為7.5的環(huán)境里能與蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基上羥基鄰位的氫原子發(fā)生置換反應(yīng)，制得碘標(biāo)記物。第32頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四放射性碘的標(biāo)記方法2.乳過氧化物酶法

用乳過氧化物酶（lactoperoxidase，LPO）催化過氧化氫（H2O2

）釋放出活潑的新生態(tài)氧，使125I離子活化并標(biāo)記在蛋白質(zhì)酪氨酸殘基上的一種標(biāo)記方法。以標(biāo)記蛋白質(zhì)為例，LPO與H2O2首先形成絡(luò)合物，將放射性碘負(fù)離子氧化成碘分子，在LPO的催化下，將蛋白質(zhì)碘化。此類酶催化反應(yīng)速度很快，標(biāo)記物比活度高，又保持其生物活性和免疫活性。特別適用于一些容易失活的多肽類的標(biāo)記，如血纖維蛋白原、胰島素、嘧啶、核苷和組氨酸等小分子化合物。第33頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四放射性碘的標(biāo)記方法3.固相氧化劑法包括Iodogen標(biāo)記法和IodoBeads標(biāo)記法兩種。Iodogen（1，3，4，6-tetrachloro-3α-6α-diphenlglycoluril,氯甘脲）不溶于水，能溶于氯仿、二氯甲烷、二甲基亞砜等有機(jī)溶劑。Iodogen在碘標(biāo)記過程中起催化作用，使用時毋須新鮮配制，催化反應(yīng)終止時不需加還原劑。Iodogen和Ch-T同屬于氯酰胺碘化反應(yīng)類型，是一種不溶于水的固相氧化劑，能將放射性碘負(fù)離子氧化成碘分子，從而與蛋白質(zhì)或多肽分子中酪氨酸殘基上羥基鄰位的氫原子發(fā)生置換反應(yīng)。該法已用于單克隆抗體、多肽、生物膜和活細(xì)胞的碘標(biāo)記。第34頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四放射性碘的標(biāo)記方法3.固相氧化劑法Iodogen標(biāo)記法不與蛋白質(zhì)密切接觸，反應(yīng)過程中的氧化損傷小，反應(yīng)時間易控制，碘利用率高于Ch-T法，利用Iodogen不溶于水的特點(diǎn)，可直接對培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行碘標(biāo)記，方法簡便。第35頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四放射性碘的標(biāo)記方法4.聯(lián)接標(biāo)記法（conjugationallabeling）這是一種間接標(biāo)記方法。先使放射性碘與聯(lián)接劑相結(jié)合，然后碘標(biāo)記的聯(lián)接劑再結(jié)合到蛋白質(zhì)或多肽分子上，成為標(biāo)記化合物。最常用的聯(lián)接劑是3-（對-羥基苯）丙酸-N琥珀亞胺酯?；瘎℉PNS，即Bolton－Hunter試劑）?；驹硎牵涸贑h-T作用下，先用Na125I使?；瘎〩PNS碘化。然后在弱堿性條件下，125I-HPNS通過一個酰氨鍵與蛋白質(zhì)N末端的氨基聯(lián)結(jié)，制得蛋白質(zhì)標(biāo)記物。此法適用于缺乏酪氨酸的蛋白質(zhì)如卵清蛋白、肌紅蛋白的標(biāo)記。第36頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四第四節(jié)

核苷和核苷酸的放射性標(biāo)記

一、32P-核苷酸標(biāo)記技術(shù)磷和硫是核酸和蛋白質(zhì)本身所含有的元素。32P標(biāo)記的核苷酸類是基因工程研究中不可缺少的標(biāo)記化合物，如用于DNA序列測定；35S-胱氨酸和35S-蛋氨酸用于研究蛋白質(zhì)代謝過程，它們均為生物醫(yī)學(xué)中不可缺少的試劑。32P及35S均發(fā)射β-射線，32P（T1/2=14.3d，Emax=1.71MeV）和35S(T1/2=87d，Emax=0.167MeV)標(biāo)記物的制備主要有化學(xué)合成、生物合成、酶促法和同位素交換法等。兩種核素比較，35S能量低，不需特殊防護(hù)，電泳自顯影條帶清晰，分辨率高。而32P則因射線能量較高，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)加必要的防護(hù)第37頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四一、32P-核苷酸標(biāo)記技術(shù)γ-32P-ATP（32P-三磷酸腺苷）和α-32P-dATP的標(biāo)記通常用酶促法。方法見書.第38頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四二、[甲基-3H]-TdR標(biāo)記技術(shù)胸腺嘧啶核苷的氚標(biāo)記通常用生物合成法得到,即以[甲基-3H]-胸腺嘧啶作為前體，在脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶的催化作用下，生成[甲基-3H]-胸腺嘧啶核苷。氚標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷（tritiatedthymidine，3H-TdR）可有效結(jié)合到DNA中，因此在體外細(xì)胞培養(yǎng)中可使細(xì)胞被標(biāo)記，主要用于淋巴細(xì)胞的免疫功能測定、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、分裂、和增殖以及分子遺傳等研究。第39頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四三、5-125I-2′-脫氧尿嘧啶核苷

（125I-UdR）標(biāo)記技術(shù)方法見書。

四、核酸的體外碘標(biāo)記標(biāo)記原理：加熱把DNA解析成單鏈，在三氯化鉈（TlCl3）氧化作用下，使125I原子與胞嘧啶環(huán)上5位碳原子以穩(wěn)定的共價鍵相結(jié)合，而形成5-碘胞嘧啶。第40頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四第五節(jié)

放射性標(biāo)記化合物的質(zhì)量控制

1.檢驗(yàn)合成的標(biāo)記化合物是否與原來設(shè)計的化合物相符，特別是標(biāo)記原子是否在預(yù)定的位置上；2.檢驗(yàn)標(biāo)記化合物中是否有雜質(zhì)以及雜質(zhì)含量有多少。第41頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四標(biāo)記化合物的純化各種方法得到的標(biāo)記化合物都含有一定量的雜質(zhì)，放存一段時間的標(biāo)記化合物也會出現(xiàn)分解產(chǎn)物，所以在使用前必須分離純化。常用的純化方法：沉淀法、萃取法、離子交換分離法和層析分離法等。第42頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四標(biāo)記化合物的質(zhì)量鑒定

1．放射性核素純度（radionuclidepurity）

指標(biāo)記化合物所需要放射性核素的活度占樣品中各種核素總放射性活度的百分比，計算公式如下：

一般要求標(biāo)記化合物的放射性核素純度應(yīng)在98％以上。常用檢查方法有兩種：（1）半衰期測定法，適用半衰期短的核素，一般跟蹤時間為3～5個半衰期；（2）射線能量測定法，利用各種放射性核素固有的能譜，測定放射性核素的純度。第43頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四標(biāo)記化合物的質(zhì)量鑒定2．標(biāo)記率（labelingefficiency）指所標(biāo)記的物質(zhì)（有可能包括一種以上的化學(xué)形態(tài)）放射性活度占樣品中總放射性活度的百分比。3.放射化學(xué)純度（radiochemicalpurity）指某一特定化學(xué)形態(tài)的標(biāo)記物活度占總放射性活度的百分比。放射化學(xué)純度一般應(yīng)達(dá)到95％以上方可使用。

第44頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四標(biāo)記化合物的質(zhì)量鑒定標(biāo)記率和放射化學(xué)純度的檢查方法有放射性層析法，包括電泳、薄層色譜、紙色譜以及高效液相色譜法等，有時也用放射性核素稀釋法和放射自顯影法。最簡單的是紙色譜第45頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四標(biāo)記化合物的質(zhì)量鑒定4．放射性比活度（specificactivity）簡稱比活度，是指單位質(zhì)量物質(zhì)所含放射性活度。用MBq/mmol或GBq/mmol（舊單位：mCi/mmol或Ci/mmol）表示。測定方法：直接測定計算法；層析掃描面積計算法等。第46頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四標(biāo)記化合物的質(zhì)量鑒定5．生物學(xué)鑒定

包括生物活性和免疫活性等測定。如果放射性核素標(biāo)記的是生物活性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、細(xì)胞等，經(jīng)過標(biāo)記后可能喪失部分活性，影響使用，因此它們的活性鑒定很重要。方法：受體的生物活性可通過受體和配基結(jié)合率測定，免疫活性可通過抗體和抗原結(jié)合率測定。如果標(biāo)記化合物進(jìn)入體內(nèi)，則還需根據(jù)進(jìn)入體內(nèi)的途徑，如口服、靜脈注射等，進(jìn)行相關(guān)項(xiàng)目的檢測。第47頁，共54