植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)及有用物質生產(chǎn)

關于植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)及有用物質生產(chǎn)第1頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四

植物次生代謝產(chǎn)物：植物中一大類并非植物生長發(fā)育所必需的小分子有機化合物，其產(chǎn)生和分布通常有種屬、器官組織和生長發(fā)育期的特異性。次生產(chǎn)物在植物中的合成與分解過程稱為次生代謝。（一）、概述

第2頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四

植物產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的類型根據(jù)分子結構不同大致分為：

酚類化合物：黃酮類；醌類（苯醌、萘醌、蒽醌）萜類化合物：三萜皂甙；甾體皂甙；單萜、倍半萜、二萜含氮化合物：生物堿；胺類（伯、仲、叔、季胺）非蛋白氨基酸生氰甙多炔類、有機酸第3頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四

植物次生代謝產(chǎn)物在醫(yī)藥、食品、輕化工業(yè)等領域具有重要意義。李時珍在《本草綱目》中所開列的1892種藥物絕大多數(shù)是植物藥物，目前仍有約25％的法定藥品來自植物。其藥物的有效成分均為次生產(chǎn)物。許多植物次生代謝產(chǎn)物是優(yōu)良的食品添加劑和名貴化妝品原料。有些是生物毒素的主要來源，可以用于殺蟲、殺菌，而對環(huán)境和人畜無害是理想的環(huán)保產(chǎn)品。

第4頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四

自然植物和細胞培養(yǎng)的紫草寧含量比較生產(chǎn)方式生產(chǎn)周期紫草寧含量（％干重）完整植物2～3年1～2植物細胞培養(yǎng)3周14第5頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四植物次生代謝產(chǎn)品的市場潛能產(chǎn)品成分用途年銷售額（億美元）長春花堿治療白血病18～20（美國）奎寧治療瘧疾5～10（美國）致熱素殺蟲劑20（全世界）毛地黃心臟病藥20～55（美國）第6頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四

植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的技術要求：

從工程的角度講必須要進一步研究和開發(fā)適宜于植物細胞生長和次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的生物反應器，建立最佳的控制和調節(jié)系統(tǒng)。從細胞生長與培養(yǎng)技術方面講必須滿足以下3個條件：

1、培養(yǎng)的細胞在遺傳上應是穩(wěn)定的，以得到產(chǎn)量恒定的產(chǎn)物。

2、細胞生長及生物合成的速度快，在較短的時間內能得到較高產(chǎn)量的終產(chǎn)物。

3、代謝產(chǎn)物要在細胞中積累而不被迅速分解，最好能將其釋放到培養(yǎng)基中。第7頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四（二）、植物細胞規(guī)?；囵B(yǎng)體系的建立

1、種子細胞的選擇

（1）準確選擇能產(chǎn)生目的化合物的植物種類；（2）盡量選擇自然狀態(tài)下產(chǎn)生天然產(chǎn)物的組織器官為外植體；

(3)高產(chǎn)種子細胞克隆的方法：單細胞培養(yǎng)后，將單細胞擴增形成的愈傷組織分2份，1份成分含量分析，另1份保留培養(yǎng)。第8頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四2、種子細胞系的增殖與放大培養(yǎng)種子細胞增殖初期一般采用搖瓶培養(yǎng)，搖瓶體積從幾百毫升到幾升逐級放大。當細胞數(shù)量增加到一定值后，應轉移至體積較小的生物反應器培養(yǎng)。第9頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四3、大規(guī)模培養(yǎng)體系的建立

（1）成批培養(yǎng)：在一個培養(yǎng)體積中接種細胞或添加培養(yǎng)基后，中途不添加也不更換培養(yǎng)基的方式。

（2）連續(xù)培養(yǎng)：在培養(yǎng)過程中，不斷向反應器中以一定流量添加新培養(yǎng)基，同時以一定流量從系統(tǒng)中取出培養(yǎng)基的方式。

(3)半連續(xù)培養(yǎng)：在完成成批培養(yǎng)的一個周期后，從反應器中取出大部分細胞懸液，只保留小部分細胞懸液作為下一培養(yǎng)周期的種子細胞，然后加入新鮮培養(yǎng)基進行培養(yǎng)的方式。第10頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四(三)生物反應器類型及特點大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)基本原理方法與上述實驗室懸浮培養(yǎng)一致，但大規(guī)模培養(yǎng)所采用的設備及控制技術比實驗室小規(guī)模培養(yǎng)要復雜的多。

第11頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四

植物細胞培養(yǎng)具有周期長、細胞抗剪切能力弱、易團聚等特點。同時，植物細胞規(guī)模培養(yǎng)的目的是生產(chǎn)天然產(chǎn)物，所以，植物細胞培養(yǎng)反應器的設計不僅要考慮有利于細胞生長，還要考慮有利于產(chǎn)物的積累和分離?？傮w上，適合植物細胞培養(yǎng)的反應器應具有適宜的氧傳遞、良好的流動性和較低的剪切力。第12頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四機械攪拌式培養(yǎng)系統(tǒng)

機械攪拌式生物反應器通常是在微生物發(fā)酵罐的基礎上改進設計的，根據(jù)植物細胞的特性，其設備要求在微生物發(fā)酵罐的基礎上作如下改進：攪拌裝置要減少剪切，一般改葉輪式為螺旋式；因為植物細胞生長周期長，需要隨時補充水分和營養(yǎng)，因此必須設計加液裝置；由于植物細胞的生理活動需要新鮮空氣，且細胞代謝也可能產(chǎn)生有害氣體，所以必須設計通氣裝置；為便于取樣觀察，一般還設計有取樣口。

第13頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四生物反應器第14頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四StirredTankBioreactorsAnexternalmotorisusedtoagitatethegrowthmediumwithimpellers.Sterileairorcombinationsofgasescanbeintroduced(sparkling)第15頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四氣壓攪拌式培養(yǎng)系統(tǒng)

考慮到機械攪拌式反應器的剪切作用難以避免，同時攪拌器轉動的中軸往往是容易使培養(yǎng)物污染的部位，因此，發(fā)展出空氣提升式生物反應器，但其缺點是攪拌不均勻。

第16頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四BubbleColumnBioreactor

(AirliftReactor)Introductionofsterileairorpuregases

isusedbothforagitationandoxygenation第17頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四InternalLoopAirliftBioreactorTubeplacedinsidethereactorcreatesinternalcirculationloop

第18頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四ExternalLoopAirliftBioreactorCirculationthroughanexternalloop

第19頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四旋轉式培養(yǎng)系統(tǒng)

一般用于產(chǎn)品中試或某些必需裂解細胞才能獲得目的產(chǎn)物的培養(yǎng)，其優(yōu)點是控制精確，處理靈活，缺點是培養(yǎng)體積較小。

第20頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四②固定化培養(yǎng)系統(tǒng)這一技術的優(yōu)點在于：

可以較容易地控制培養(yǎng)系統(tǒng)的理化環(huán)境，從而可以研究特定的代謝途徑，并便于調節(jié)；細胞位置的固定使其所處的環(huán)境類似于在植物體中所處的狀態(tài)，相互間接觸密切，可以形成一定的理化梯度，有利于次生產(chǎn)物的合成；由于細胞固定在支持物上，培養(yǎng)基可以不斷更換，可以從培養(yǎng)基中提取產(chǎn)物，免除了培養(yǎng)基中因含有過多的初生產(chǎn)物對細胞代謝的反饋抑制，也由于細胞留在反應器中，新的培養(yǎng)基可以再次利用這些細胞生產(chǎn)初生產(chǎn)物，從而節(jié)省了生產(chǎn)細胞所付出的時間和費用；正是由于細胞固定在一定的介質中，并可以從培養(yǎng)基中不斷提取產(chǎn)物，因此，它可以進行連續(xù)生產(chǎn)。第21頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四細胞固定化培養(yǎng)技術按照其支持物不同可以分為兩大類：

包埋式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：支持物多采用瓊脂、瓊脂糖、藻酸鹽、聚丙烯酰胺等；附著式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：支持物采用尼龍網(wǎng)、聚氨酯泡沫、中空纖維等材料。

第22頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四

1、利用細胞培養(yǎng)生產(chǎn)有用物質的一般程序（1）選材

應注意以下條件：①藥效肯定；②對其有效成分有充分的了解；③有測定有效成分和藥理的可靠方法；④市場短缺或價格昂貴；⑤取有藥效成分的部位，且該部位較易形成愈傷組織。（四）、利用細胞培養(yǎng)生產(chǎn)有用物質第23頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四

（2）細胞株系建立

將誘導產(chǎn)生的愈傷組織進行分離，建立懸浮細胞繁殖體系（液體培養(yǎng)）。

在工廠化生產(chǎn)中，為了提高有用物質產(chǎn)品的產(chǎn)量和質量，對細胞培養(yǎng)的選擇有兩個基本要求：①有用物質的合成積累能力強②生長速度快

第24頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四

（3）大量培養(yǎng)

將選出的優(yōu)良細胞株擴大繁殖后，可作為細胞工廠化培養(yǎng)的生產(chǎn)“種子”，進行大量培養(yǎng)。

（4）產(chǎn)品提取與純化從植物細胞培養(yǎng)物中提取和純化有的產(chǎn)品。第25頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四2、提高有用物質生產(chǎn)效率的技術因素

①篩選高產(chǎn)細胞系

從實驗材料中篩選高產(chǎn)的細胞株系是提高生產(chǎn)率、降低生產(chǎn)成本的重要因素。特異的次生代謝產(chǎn)物往往是特異的器官中形成的。因此，用特異器官為材料，建立特異功能的細胞系，并從中反復多代培養(yǎng)選擇有效的、高產(chǎn)的細胞株。

第26頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四

篩選出的高效、高產(chǎn)細胞株系，有的植物細胞系其高效、高產(chǎn)性能穩(wěn)定多年，但有的植物細胞系不穩(wěn)定，因此，還需要定期檢測，更新細胞株系。第27頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四

第一步：解決生物量生產(chǎn)（促進細胞裂）；第二步：促進次生代謝物合成，即在細胞指數(shù)生長停止期前后才更換培養(yǎng)基，有利于次生物質的積累。

②、二步培養(yǎng)法第28頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四③、培養(yǎng)基中添加前體前體：有用次生代謝物的前驅物。煙草愈傷組織培養(yǎng)中，將前體物質—煙堿酸加入，會增加煙堿的生成量。第29頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四

④、培養(yǎng)基中生長調節(jié)劑的作用

植物生長調節(jié)劑不僅影響植物的脫分化與再分化，而且能影響次生代謝物質的產(chǎn)生。如煙草愈傷組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中添加IAA，能合成煙堿，而在含有2,4-D的培養(yǎng)基上，煙堿合成受阻。

第30頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四⑤、培養(yǎng)條件的影響光照、溫度等影響次生代謝。在胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)中，光照條件使紫紅色愈傷組織能夠生成大量的花箐苷，并且低溫條件下，生成量高。

第31頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四⑥、采用固相細胞培養(yǎng)系統(tǒng)

細胞生長分裂旺盛時，次生代謝物產(chǎn)量低。采用固相培養(yǎng)，將細胞培養(yǎng)在惰性基質中，細胞生長緩慢，可提高次生代謝物質的產(chǎn)量。第32頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四思考題1．一個好的懸浮細胞系有哪些特征？用于建立懸浮細胞系的愈傷組織有何要求？2．建立懸浮細胞系的關鍵技術有哪些？3．懸浮細胞系在繼代培養(yǎng)中其群體生長規(guī)律？4．細胞大規(guī)模培養(yǎng)有哪些培養(yǎng)系統(tǒng)？第33頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四第34頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四第35頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四紫杉醇：二萜類化合物最早由太平洋紅豆杉Taxus

brevifolia的樹皮中分離廣泛用于治療卵巢癌、乳腺癌、非小細胞肺癌等十幾種癌癥目前主要來源于紅豆杉屬植物紫杉醇簡介第36頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四理化性質英文名：Paclitaxel,Taxol?orTM分子式：C47H51NO4水溶性：0.7mg／ml穩(wěn)定性：pH4～8穩(wěn)定；pH<4較穩(wěn)定；pH>8易分解；在特定條件下紫杉醇可被氧化，但極難還原；第37頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四紫杉醇研發(fā)過程年代進展1958NCI開始大規(guī)模植物藥研發(fā)篩選1967

發(fā)現(xiàn)紫杉醇抗癌活性1968

從紅豆杉中分離出紫杉醇1971

完成結構鑒定1979

發(fā)表作用機制1983

臨床Ⅰ試驗1985

臨床II期1991

臨床III期1992

FDA批準上市NCI稱其為過去15年中開發(fā)的最好的抗癌藥物20世紀90年代抗腫瘤藥的三大成就之一湯姆森科技桂冠獎RameshPanchagnula,InternationalJournalofPharmaceutics.1998(172)1-15.第38頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四市場需求抗癌一線用藥

銷售額年增長率5億美元

理論需求量

2g/人,500萬人/年

1000kg/年實際銷量

350kg/年紫杉醇供需相差十分懸殊

圖1：國際紫杉醇原料藥需求走勢圖（單位：公斤）圖2：國際紫杉醇銷售額（億美元）第39頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四紫杉醇開發(fā)的關鍵問題上游產(chǎn)業(yè)——藥源問題

下游制劑產(chǎn)業(yè)藥效（活性、水溶性）安全性生物相容性第40頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四藥源問題紅豆杉

主要原料植物國家一級保護野生植物，全球十大瀕危物種之一生長緩慢分布有限Taxol含量低

樹皮中Taxol含量:0.00001-0.069%3000棵樹=10噸樹皮=1kgTaxol=500病人第41頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四人工栽培采用種子繁殖、扦插等無性繁殖方法快速、大面積人工繁育紅豆杉幼苗尋找紅豆衫的替代物

從紅豆杉非樹皮部位提取產(chǎn)紫杉醇的非紅豆杉植物優(yōu)點：生長周期縮短簡便、直接缺點：1、紫杉醇含量低生長緩慢

2、提取工藝復雜藥源問題解決辦法（一）第42頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四藥源問題解決辦法（二）化學合成全合成

1994年獲得成功現(xiàn)有六種途徑半合成以10-DABⅢ和BaccatinⅢ作為半合成原料獲得紫杉醇新方法用10-DAT缺點：1、合成過程煩瑣復雜，幾十步

2、費用高，化學試劑昂貴

3、總收率太低（2%）優(yōu)點：1、原料枝葉含量豐富、提取相對容易，充分利用再生資源

2、產(chǎn)率高

3、最具實用價值可以工業(yè)化生產(chǎn)

4、獲取紫杉醇構效關系信息，進行結構改造缺點：合成過程相對復雜（11步化學轉化和7步分離）第43頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四藥源問題解決辦法（三）生物方法組織和細胞培養(yǎng)微生物發(fā)酵生物合成研究階段紅豆杉生物合成途徑基本明確

10種相關酶基因被克隆表達利用基因工程手段改造紅豆杉提高紫杉醇產(chǎn)量

優(yōu)點：1、擺脫自然因素，可長期穩(wěn)定生長

2、適應市場、方便調節(jié)

3、成分簡單，有利于分離純化

4、成本低、生長周期短

5、為半合成提供原料

6、有望工業(yè)化生產(chǎn)缺點：1、產(chǎn)量低、不穩(wěn)定

2、工業(yè)化放大研究第44頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四紫杉醇水溶性很差0.77mM/L使用增溶劑：聚氧乙烯蓖麻油和無水乙醇

存在問題穩(wěn)定性和水溶性較差（7mm/L）過敏反應產(chǎn)生沉淀缺點：1、產(chǎn)量低、不穩(wěn)定

2、工業(yè)化放大研究藥效問題第45頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四一、植物來源藥物的特點全世界有40%的藥物來源于植物。我國是中草藥資源最豐富的國家，有詳細記載的近5000種。中草藥治療疾病的歷史上千年，中醫(yī)藥已形成完整的科學體系。對于植物藥效成分的研究已形成“天然藥物化學”研究的新領域。藥用植物中具有藥物功能的物質種類繁多，結構復雜。除小分子的天然有機化合物以外，還有多種生物大分子活性物質。

對不同組方的藥用成分和功能的研究是一項巨大的工程，相當于基因組和蛋白質組工程。中藥復方復雜系統(tǒng)研究（北京大學韓啟德院士）第46頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四二、植物來源藥物的種類

1、天然有機化合物（1）糖和糖苷類（2）苯丙素類：苯丙烯、苯丙酸、香豆素等（3）醌類：輔酶Q10、紫草素（4）黃酮類：黃酮醇、花色素

（5）鞣質：奎寧酸、槲皮醇。（6）萜類：青蒿素、齊墩果酸（7）甾體：烏沙苷元、毛第黃毒苷元（8）生物堿：咖啡因、喜樹堿第47頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四2、植物蛋白質、多肽、酶類生理活性物質表2-163、植物糖類藥物包括單糖、聚糖和糖衍生物。表2-174、植物脂類藥物（1）脂肪和脂肪酸類：亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸（2）磷脂類：大豆磷脂（3）固醇類：豆固醇、β-谷固醇。第48頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四三、植物來源藥物的植被實例

1、植物SOD2、植酸鈣鎂與肌醇

3、植物不飽和脂肪酸四、植物藥物來源的研究前景

1、植物細胞培養(yǎng)

2、植物組織培養(yǎng)

3、有效成分的分離、純化，結構和功能測定。第49頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四第50頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四第51頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四

3、若干有用物質的生產(chǎn)

①、生物堿許多生物堿已經(jīng)用作醫(yī)學上的藥物。如嗎啡等生物堿通常從鴉片中提取，用作神經(jīng)麻醉劑，利用罌粟種子的愈傷組織培養(yǎng)，可提取嗎啡堿及其它生物堿。第52頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四②、苷類物質利用人參愈傷組織培養(yǎng)生產(chǎn)皂苷