目的蛋白表達(dá)與純化protocol

00000000000000000000000000000000000000目蛋表與化protocol小量表測(cè)試：1、挑一單隆到3mlLB（含抗生素）中C，蕩培養(yǎng)10h~12h。2、保種：μl菌+μl滅菌甘油，充分混勻后置于-C保存。3、擴(kuò)大培：以菌，即取50l液到5mlLB（含抗生素）中37

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C，220rpm振蕩培養(yǎng)至OD達(dá)到0.6。4、對(duì)照?。喝【海x心，棄盡上清，-20保存。對(duì)照5、另1ml菌液于一新的試管中1/1000IPTG（終濃度C振蕩培養(yǎng)3h后收菌：12000rpm離心1min，棄盡上清品

C存。

C6、其余約3ml液于220rpm繼續(xù)振蕩培養(yǎng)后，0.5/1000IPTG（終濃度為C220rpm蕩培養(yǎng)通常18h收菌12000rpm離心，棄盡上清，

C保存。16

C樣品7、分別處理上述三個(gè)樣品，取20μl總蛋白，其余離心后分離上清和沉淀，進(jìn)行SDS電泳鑒定，上樣順序?yàn)椋簩?duì)照總蛋白上沉淀

樣總蛋白上沉

樣總蛋白上沉若目的蛋白在上清中有表達(dá)，則可以進(jìn)行大量表達(dá)與純化，具體操作如下。大量表：1、挑一單隆到LB（含抗生素）中，37C，220rpm振蕩培養(yǎng)10h~12h。注意：此步用心管搖菌！2、擴(kuò)大培：以菌，即取將上述液全部接到TB（含抗生素）中，37

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C，蕩培養(yǎng)至OD達(dá)到1.0。3、對(duì)照取：取1ml菌液，12000rpm離心1min，棄盡上清，-20C存照）4、其余約液于16C220rpm續(xù)振蕩培養(yǎng)后，0.5/1000IPTG（終濃為0.5mM

C，220rpm振蕩培養(yǎng)12~24h（通常18h）后收菌：6000rpm、4離心10min棄盡上清取一點(diǎn)沉淀做表達(dá)鑒（16樣品余-20C保存。

000000005、分別處理上述兩樣品，進(jìn)行SDS泳鑒定同小量表達(dá)中的7）菌體破（高壓破菌1、若目的白在上清中有表達(dá)則可取剩余菌體g(根據(jù)目的蛋白的表達(dá)量而定，用×Nml的buffer菌體重懸，加入0.1mM的PMSF，置于燒杯中，并將燒杯置于冰上。2、用超聲碎儀進(jìn)行破碎，功率一般為，超聲時(shí)間為3s，間隙時(shí)間為5s工作次數(shù)一般為×次。3、將破碎的菌液移入BECKMAN高速離心管中，4離心30-40min，將上清移入一個(gè)新的離心管中。Ni柱親和層：buffer:50mM300mMNaCl,pH8.0可加入的甘油和1mMdTT，咪唑）Washbuffer:Tris,20mM咪唑,pH8.0ElutionTris,300mM500mM咪唑pH8.01、取適量beads灌入玻璃柱中，用大量的沖洗，一般為10CV×25（代表柱體積，下同2、用lysisbuffer進(jìn)平衡：×。3、將平衡的beads入菌體破碎最后得到的上清中，Mix。4、，4離心2min，收集上清——。5、加washbuffer，，4

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C離心收集上清——1。6、加washbuffer，，4C心收集上清——wash2。7、加washbuffer，，4C心收集上清——wash3。8、將beads入玻璃柱中，繼續(xù)用buffer洗10CV×3。9、用Elutionbuffer洗脫：0.5CV×，用EP管分別收集。10SDS電泳鑒定。1、用洗2CV（清洗至無色2、ddH洗。2

00000000003、0.1M洗2CV4、ddH洗。25、加2CVNiCl。26、ddH洗。27、用20%乙醇洗2次beads，置于保存。GST親和析：buffer:×NaCl,2.7mMHPO,1.8mMKHPO,2pHWashbuffer:1×PBSElutionTris,reducedglutathione,pH8.01、取1ml的beads灌入玻璃柱中，用大量的ddHO洗。22、用lysisbuffer進(jìn)平衡：×。3、將平衡的beads入菌體破碎最后得到的上清中，Mix。4、，4

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C離心2min收集上清——flow-through。5、加washbuffer，，4C心收集上清——wash1。6、加washbuffer，，4C心收集上清——wash2。7、加washbuffer，，4C心收集上清——wash3。8、將beads入玻璃柱中，繼續(xù)用buffer洗10CV×3。9、用Elutionbuffer洗脫：0.5CV×，用EP管分別收集。10SDS電泳鑒定。1、用6Mhydrochloride2柱體積。2、立即用1PBS洗5個(gè)柱體積。3、用70%乙醇洗柱體積。4、立即用1PBS洗5個(gè)柱體積。5、用20%乙醇洗2次beads，置于

C保存。·Tactin柱和層析：Washbuffer:Tris,150mMNaCl,1mMEDTA,pH8.0ElutionTris,NaCl,1mMEDTA,2.5mMpH8.0

00001、取適量beads灌入玻璃柱中。2、用buffer進(jìn)行平衡：×。3、將破碎的上清灌入裝有beads的玻璃柱中，控制流速為1滴2s，收集，再重復(fù)上樣一次。4、用buffer沖洗：1CV×5，收集。5、用Elutionbuffer洗脫：0.5CV×6，用分別收集。6、電泳鑒定。buffer:100mMTris,150mMNaCl,1mMEDTA,1mMHABA,pH8.01、用buffer洗柱子，5CV×3，直到柱子變?yōu)榧t色且顏色均一。2、加2CVbuffer或regeneration，置于

C保存柱子。凝膠過層析（75/200：Bindingbuffer:100mMNaCl,pH7.01、ddH沖洗2CV:flowrate:0.3MPa（下同22、buffer衡2CV。3、樣品離：12000rpm,4C離心30min。4、沖loop:ddHO5個(gè)體積，bind