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腫瘤的分子機(jī)制基因診斷基因治療生物芯片技術(shù)腫瘤的分子機(jī)制腫瘤腫瘤(tumor)是一種當(dāng)調(diào)節(jié)正常細(xì)胞生長(zhǎng)的控制系統(tǒng)失靈的時(shí)候所發(fā)生的疾病。腫瘤細(xì)胞發(fā)展的過程:
正常細(xì)胞永生化轉(zhuǎn)化腫瘤轉(zhuǎn)移引起腫瘤的原因很多:物理因素化學(xué)因素病毒感染
一般化學(xué)致癌物都有類似的結(jié)構(gòu)特征:UV-light可以引起單鏈和雙鏈DNA的斷裂,雙鏈的斷裂是很難修復(fù)的。Integration(DNAvirus)
MalignanttransformationDNADNAvirusHostcellNeoplasticcellDNA的損傷修復(fù)Integration(DNAvirus)
MalignanttransformationDNADNAvirusHostcellNeoplasticcell任何原因引起的細(xì)胞癌變都是直接或間接引起宿主細(xì)胞基因功能的改變所致,因此,腫瘤是一種基因病。表觀遺傳學(xué)DNA甲基化染色體修飾
miRNA與腫瘤有關(guān)的兩類基因:癌基因(Oncogene,onc)抑癌基因(Tumorsuppressorgene)癌基因:癌基因(oncogene,onc)是指細(xì)胞內(nèi)控制細(xì)胞正常生長(zhǎng)的基因(原癌基因),在異常表達(dá)時(shí),這些基因不受體內(nèi)各種調(diào)節(jié)因素的影響,可持續(xù)表達(dá),或高活性表達(dá),其產(chǎn)物可使細(xì)胞持續(xù)增殖。
原癌基因:Proto-onc是一種正常的細(xì)胞基因,在正常細(xì)胞中編碼關(guān)鍵性調(diào)控蛋白,在細(xì)胞增殖和分化中起重要調(diào)控作用,當(dāng)其突變或調(diào)控失靈時(shí)可引起細(xì)胞癌變
原癌基因突變細(xì)胞癌基因(Cellularoncogene,c-onc)病毒癌基因(Virusoncogene,v-onc)癌基因分類:細(xì)胞癌基因:C-onc實(shí)際上是過度活化或持續(xù)表達(dá)的原癌基因。癌基因應(yīng)包括結(jié)構(gòu)基因及其調(diào)控區(qū)兩部分.
例如:erbB基因細(xì)胞癌基因的活化:病毒癌基因:V-onc存在于病毒基因組中,編碼的蛋白質(zhì)不是病毒的結(jié)構(gòu)蛋白,對(duì)病毒的繁殖也沒有影響作用,但可使病毒感染的宿主細(xì)胞持續(xù)增殖。能致癌的病毒稱作腫瘤病毒(TumorVirus)。
1911年P(guān)eytonRous發(fā)現(xiàn)雞肉瘤病毒(Rousavirus,RSV)具有致癌作用。野生型逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制時(shí)可將細(xì)胞原癌基因攜帶到病毒的基因組中?!圆《净蚪MRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄形成DNA;—DNA作為前病毒整合到宿主染色體上;—當(dāng)病毒復(fù)制完成后,整合部分從宿主染色體上解離下來。轉(zhuǎn)化性逆轉(zhuǎn)錄病毒:攜帶一個(gè)拷貝的細(xì)胞序列并取代一部分自身基因細(xì)胞癌基因的致癌機(jī)理正常產(chǎn)物量的表達(dá)量增加產(chǎn)物結(jié)構(gòu)改變?cè)黾诱.a(chǎn)物量?jī)煞N機(jī)制:基因調(diào)節(jié)發(fā)生改變基因拷貝數(shù)增加基因調(diào)節(jié)改變B細(xì)胞癌c-myc免疫球蛋白重鏈增強(qiáng)子8號(hào)染色體14號(hào)染色體c-myc大量表達(dá)基因拷貝數(shù)增加基因拷貝數(shù)的增加也能大大增加相應(yīng)蛋白的表達(dá)量人早幼粒白血病細(xì)胞株HL60中c-myc基因比相應(yīng)細(xì)胞多20倍乳腺癌細(xì)胞中Her2基因(酪氨酸激酶活性的受體)大量擴(kuò)增
高水平表達(dá)Her2的腫瘤細(xì)胞可以形成Her2的同源二聚體,這種二聚體在沒有配體結(jié)合的情況下能夠發(fā)生自身磷酸化,進(jìn)而啟動(dòng)下游的信號(hào)傳導(dǎo),引起細(xì)胞增殖產(chǎn)物結(jié)構(gòu)發(fā)生改變產(chǎn)物大小正常但活性發(fā)生改變(突變體)產(chǎn)物大小發(fā)生改變產(chǎn)物大小正常但活性發(fā)生改變
Mutationofras
hasbeendemonstratedincoloncancer,lungcancer,thyroidcancer,melanoma,leukemiainhuman.突變的Ras蛋白不能水解GTP。Ras蛋白就成為GTPase活性蛋白(GAP)。GAP本身就成為癌蛋白。sis基因是編碼血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)-?鏈的基因,可結(jié)合和激活PDGF受體,促進(jìn)DNA合成.但其突變體半衰期明顯延長(zhǎng),使細(xì)胞過度增生,發(fā)生癌變.產(chǎn)物大小發(fā)生改變
慢性髓細(xì)胞白血病
22號(hào)染色體與9號(hào)染色體易位,前者的bcr基因與后者的ab1基因連在一起,產(chǎn)生異常的融合蛋白,具有較高的酪氨酸激酶活性,可以轉(zhuǎn)化血液細(xì)胞視黃酸α受體/急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)
17號(hào)染色體的視黃酸α受體基因(RARA)被轉(zhuǎn)移到15號(hào)染色體的PML基因旁,產(chǎn)生PMLRARA融合蛋白.此融合蛋白失去了部分轉(zhuǎn)錄激活機(jī)制,阻止早幼粒細(xì)胞的分化.腫瘤病毒的致癌機(jī)理RNA病毒提供癌基因不含癌基因,但能引起細(xì)胞原癌基因活化DNA病毒癌基因產(chǎn)物結(jié)合宿主蛋白并使其失活而發(fā)揮作用RNA病毒提供癌基因Rous肉瘤病毒RNA病毒不含癌基因,但能引起細(xì)胞原癌基因活化小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)LTR中含有轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子序列,通常整合在成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(int)基因附近LTRLTR病毒基因組細(xì)胞染色體int成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子促進(jìn)轉(zhuǎn)錄癌基因產(chǎn)物結(jié)合宿主蛋白并使其失活而發(fā)揮作用人乳頭瘤病毒(HPV)可引起子宮頸癌DNA病毒HPVE6E7P53RbP53E6E7Rb癌基因產(chǎn)物結(jié)合宿主蛋白并使其失活而發(fā)揮作用SV40病毒DNA病毒P53RbP53Rb大T抗原大T抗原一些癌基因及其產(chǎn)物:結(jié)合抑癌基因產(chǎn)物的蛋白E6,E7,大T抗原抑癌基因:Tumorsuppressorgene也是正常細(xì)胞內(nèi)的正?;?,在細(xì)胞增殖中起負(fù)調(diào)控作用。當(dāng)其缺失或失活時(shí),可使細(xì)胞惡性增生而引起癌變。常見的抑癌基因及其作用:名稱基因產(chǎn)物RB基因:Rb(retinoblastoma)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤隱性基因。Rb蛋白分布于細(xì)胞核內(nèi),存在有磷酸化和去磷酸化兩種形式,去磷酸化的Rb蛋白為活性形式。具有活性的Rb蛋白與轉(zhuǎn)錄因子E2F結(jié)合,在細(xì)胞周期的G1/S交界期阻斷細(xì)胞增殖E2F能有效地增加DNA聚合酶ɑ,胸腺嘧啶核苷激酶的轉(zhuǎn)錄視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤RB基因突變使RB蛋白功能異常導(dǎo)致細(xì)胞癌變?;蛲蛔兓虿《靖腥径伎梢砸种芌B蛋白與E2F的結(jié)合RB基因的致癌機(jī)理:P53基因:P53基因是迄今發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤相關(guān)性最高的抑癌基因,位于17號(hào)染色體上。P53蛋白分布于細(xì)胞核中,以四聚體形式與DNA結(jié)合,磷酸化的P53蛋白是活性形式。P53蛋白屬于核轉(zhuǎn)錄因子。
P53基因含3個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū):第1-75aa為酸性氨基末端;第76-150aa為富含脯氨酸的非極性區(qū);第276-390aa為堿性多螺旋的羧基末端。P53蛋白可以在DNA復(fù)制水平和DNA轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮作用P53蛋白可與受損傷DNA的復(fù)制點(diǎn)結(jié)合,阻止受傷DNA的復(fù)制。抑制細(xì)胞分裂,使其停留在細(xì)胞周期的G1期,使細(xì)胞凋亡。
在復(fù)制水平P53抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制:在復(fù)制水平P53阻止DNA聚合酶與DNA復(fù)制起始復(fù)合物的結(jié)合。P53抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制:與協(xié)同抑制細(xì)胞增殖。P53Rb 在轉(zhuǎn)錄水平上在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面P53抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制:P53bax激活轉(zhuǎn)錄mRNABax蛋白是細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡蛋白P53失活的兩種情況:一個(gè)等位基因突變即可導(dǎo)致細(xì)胞癌變。基因突變病毒感染HPVE6P53P53E6腫瘤發(fā)生發(fā)展中多基因協(xié)同作用:小結(jié)腫瘤是一種基因病。兩類基因的異常與腫瘤發(fā)病密切相關(guān):癌基因和抑癌基因。原癌基因正常情況下是促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的,當(dāng)其突變時(shí)變成癌基因。抑癌基因?qū)?xì)胞的生長(zhǎng)起負(fù)調(diào)控作用.基因診斷
基因診斷的概念
◆狹義的概念
對(duì)疾病或與致病相關(guān)的核酸片段(DNA或RNA)的確定及核苷酸序列的測(cè)定◆廣義的概念
對(duì)疾病或與致病相關(guān)的基因(DNA)及其表達(dá)產(chǎn)物(mRNA、蛋白質(zhì))的確定和序列測(cè)定基因診斷的基本原理:通過檢測(cè)致病基因(包括內(nèi)源基因與外源基因)的存在、量的多少、結(jié)構(gòu)變化及表達(dá)水平是否正常,以確定被檢查者是否存在基因水平的異常變化,以此作為疾病確診的依據(jù)。
基因診斷的特點(diǎn)特異性強(qiáng)以分子雜交技術(shù)為基本原理靈敏度高基因探針帶有十分敏感的檢測(cè)標(biāo)記,待測(cè)標(biāo)本微量基因診斷的基本技術(shù)方法:1、核酸分子雜交2、PCR3、限制性酶切分析4、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)5、DNA序列測(cè)定6、DNA芯片技術(shù)染色體上片段的易位和重排基因缺失、倍增和插入的檢測(cè)三聯(lián)體重復(fù)疾病的檢測(cè)點(diǎn)突變的檢測(cè)基因診斷的疾病類型熒光原位雜交技術(shù)FlorescenceIn-SituHybridization,FISH利用熒光標(biāo)記的DNA探針與待測(cè)樣品(組織,細(xì)胞或染色體)中的核酸進(jìn)行原位雜交,并通過熒光顯微鏡對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行分析和計(jì)數(shù)的過程利用FISH技術(shù)可準(zhǔn)確反映出染色體上片段的易位和重排,比免疫組化靈敏度高,穩(wěn)定性好染色體上片段的易位和重排FISH的技術(shù)流程樣本制備(細(xì)胞固定,老化)樣本DNA變性和探針的預(yù)備(加熱變性)雜交熒光顯微鏡下觀察乳腺癌的診斷采用福爾馬林固定、石蠟包埋切片特異性和地高辛連接的HER2反義寡聚核苷酸通過針對(duì)于地高辛的免疫熒光素標(biāo)記的抗體用免疫熒光的方法測(cè)定熒光原位雜交法(FISH)可以檢測(cè)到HER2基因的擴(kuò)增,陰性(3個(gè)拷貝數(shù)/細(xì)胞核)為正常,陽(yáng)性(>10個(gè)拷貝數(shù)/細(xì)胞核)為異常
圖12-15熒光原位雜交顯示的著絲粒衛(wèi)星DNA圖12-19熒光原位雜交顯示的端粒(上)和端粒序列(下)基因缺失、倍增和插入的檢測(cè)假肥大肌營(yíng)養(yǎng)不良(DMD):
位于X染色體上的肌細(xì)胞增強(qiáng)蛋白的基因(79個(gè)外顯子)突變,其中72%的人是由于基因部分外顯子缺失或倍增,28%的人是由于基因點(diǎn)突變引起.設(shè)計(jì)一套引物來擴(kuò)增所有的外顯子正常缺失倍增倍增缺失三聯(lián)體重復(fù)疾病的檢測(cè)亨廷頓舞蹈病(HD)
4號(hào)染色體亨廷頓基因中CAG大量重復(fù)引起的.正常人最多有35個(gè)重復(fù),病人則有36到120個(gè)CAG重復(fù)通過PCR擴(kuò)增重復(fù)部位基因片段,依據(jù)大小判定.脆性X綜合征:X染色體上FMR1基因中CGG過量重復(fù)(PCR無法擴(kuò)增)強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良癥:19號(hào)染色體的強(qiáng)直性肌蛋白基因CAG過量重復(fù)患者正常6.6Kb2.8kb脆性X綜合征DNA限制酶切圖譜的Southernblot等位基因特異性寡核苷酸探針雜交法
(allelespecificoligonucleotide,ASO)ASO法的基本原理:通過位于寡核苷酸探針中的基因(或序列)特異性堿基與靶序列DNA的堿基配對(duì)和嚴(yán)格條件下洗膜來達(dá)到檢測(cè)基因中少數(shù)堿基變化(少至單個(gè)堿基)的目的寡核苷酸探針與固定在膜上的靶序列DNA之間,只要有一個(gè)堿基不互補(bǔ),寡核苷酸探針就會(huì)被洗掉點(diǎn)突變的檢測(cè)囊性纖維化基因的11號(hào)外顯子的鑒定將基因擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)于尼龍膜上,與正常和突變的ASO探針雜交突變探針正常探針囊性纖維化基因的11號(hào)外顯子主要是應(yīng)用限制酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)為遺傳標(biāo)志進(jìn)行家系分析突變?cè)斐闪诵蛄猩系亩鄳B(tài)性,不少序列多態(tài)性發(fā)生在限制酶識(shí)別位點(diǎn)上,產(chǎn)生了限制酶酶切位點(diǎn)的多態(tài)性用該限制酶水解DNA就會(huì)產(chǎn)生長(zhǎng)度不同的片段,稱為RFLP限制性酶切位點(diǎn)分析EcoRⅠ酶切示意圖5’
AGGAATTCGAATTCGAATTCCG3’
3’TCCTTAAGCTTAAGCTTAAGGC5’
AGG
AATTCG
AATTCG
AATTCCG
TCCTTAA
GCTTAA
GCTTAA
GGC
5’AGGAATTCGAATCCGAATTCCG3’
3’TCCTTAAGCTTAGGCTTAAGGC5’
AGG
AATTCGAATCCG
AATTCCG
TCCTTAA
GCTTAGGCTTAA
GCGb
珠蛋白基因突變所造成的RFLP分析(鐮刀狀細(xì)胞性貧血癥)突變反應(yīng)擴(kuò)增系統(tǒng)(ARMS)設(shè)計(jì)一條PCR引物使其3’端最后一個(gè)堿基正好處于基因序列中的突變位點(diǎn);再設(shè)計(jì)一條3’端與突變堿基一致的引物.進(jìn)行兩次PCR反應(yīng),如果存在突變,在第二次PCR中有產(chǎn)物,第一次PCR中無產(chǎn)物.5’ATGCGCCCGATTAGGTTAACGCTTAGCTGCTCA3’正?;?’ATGCGCCCGATGAGGTTAACGCTTAGCTGCTCA3’突變基因5’ATGCGCCCGATT第一條引物5’ATGCGCCCGATG第二條引物單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)原理:
序列不同的DNA單鏈其空間構(gòu)象也不同,在非變性PAGE電泳上泳動(dòng)位置亦發(fā)生變化,由此可判斷突變是否存在.可檢測(cè)基因中單個(gè)堿基的突變.對(duì)小于300bp的DNA比較敏感.DNA測(cè)序分析PCR-SSCP分析法只能判斷基因是否存在突變,但不能檢測(cè)何種堿基突變以及突變的具體位置.可先PCR,然后測(cè)序基因芯片技術(shù):將大量探針分子(通常每平方厘米點(diǎn)陣密度高于400)固定于支持物上后與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交,通過檢測(cè)每個(gè)探針分子雜交信號(hào)的強(qiáng)度,獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息基因治療
(genetherapy)基因治療概念從分子生物學(xué)角度來看:基因治療(genetherapy)可以理解為用正常有功能的基因置換或增補(bǔ)缺陷基因的方法。從廣義疾病治療的角度講:可以認(rèn)為凡是將新的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到某一個(gè)體的細(xì)胞內(nèi),使功能正常的基因或表達(dá)量很低及原來不存在的外源基因得到正常表達(dá),賦予患者新的抗病功能,從而達(dá)到治療目的。由表達(dá)產(chǎn)物發(fā)揮治療作用的基因治療方法稱為基因療法(genetherapeutics)。
基因治療的策略(1)基因置換用正常的外源基因替換產(chǎn)生疾病的基因,使致病基因得到永久地更正,是最理想的基因治療方法。(2)基因修正將致病基因的突變堿基序列加以糾正,而基因的其它正常部分予以保留。因?yàn)閱位蜻z傳病在多數(shù)情況下是由于基因內(nèi)部的單個(gè)堿基發(fā)生突變而引起的,其它核苷酸序列均是正常的,因此只要將突變的單個(gè)堿基予以更正就能達(dá)到基因治療的目的,而不必將整個(gè)基因進(jìn)行置換。(3)基因修飾將目的基因?qū)氩∽兗?xì)胞或其它細(xì)胞,目的基因的表達(dá)產(chǎn)物可以補(bǔ)償致病基因的功能,致病基因本身并未得到改變。由于已經(jīng)發(fā)展了許多有效的方法可以將目的基因?qū)胝婧思?xì)胞,并獲得表達(dá),因而是目前較為成熟的方法。只是由于目的基因不是在原位導(dǎo)入的,所以治療效果有時(shí)并不理想。(4)基因抑制導(dǎo)入外源基因去干擾、抑制有害基因的表達(dá),如向腫瘤細(xì)胞導(dǎo)入腫瘤抑制基因,以抑制癌基因的表達(dá)。(5)基因封閉利用反義技術(shù)封閉某些特定基因的表達(dá),以達(dá)到抑制有害基因表達(dá)的目的。反義技術(shù)是以mRNA為靶分子.基因轉(zhuǎn)移基因轉(zhuǎn)移的途徑invivo(體內(nèi)),即活體直接轉(zhuǎn)移,是將帶有遺傳物質(zhì)的病毒、脂質(zhì)體或裸露的DNA直接注射到試驗(yàn)個(gè)體內(nèi);exvivo(離體),稱為回體轉(zhuǎn)移,是將試驗(yàn)對(duì)象的細(xì)胞取出,在體外培養(yǎng)并插入基因后,將這些經(jīng)過遺傳修飾的細(xì)胞重新輸回到試驗(yàn)個(gè)體體內(nèi)。exvivo方法比較經(jīng)典、安全、效果容易控制,但缺點(diǎn)是步驟多,技術(shù)復(fù)雜,難度大,不容易推廣;invivo方法操作簡(jiǎn)便,容易推廣,缺點(diǎn)是方法尚未成熟,存在療效短、免疫排斥和安全性等問題,但它是基因轉(zhuǎn)移的方向,只有invivo基因轉(zhuǎn)移方法成熟了,基因治療才能真正走向臨床。基因轉(zhuǎn)移基因轉(zhuǎn)移的方法物理方法化學(xué)方法生物學(xué)方法物理方法裸露DNA的直接注射DNA顆粒轟擊
Agracetus公司開發(fā)出一種粒子加速裝置,它可以使攜帶有外源DNA的金顆粒打入到機(jī)體的一定部位以產(chǎn)生治療作用。電脈沖介導(dǎo)法顯微注射法化學(xué)方法包括DNA磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體包埋法、DEAE-葡聚糖法和多聚季胺鹽法等。其中以脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方法應(yīng)用較多。物理方法和化學(xué)方法轉(zhuǎn)移的外源基因的表達(dá)是暫時(shí)的,因?yàn)檫@些基因不容易整合到宿主細(xì)胞的基因組中,容易被細(xì)胞內(nèi)的DNA酶降解,并將其排出體外。但是這些方法不存在野生型病毒的污染問題,也不會(huì)誘導(dǎo)免疫反應(yīng),理論上比病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方法安全。Liposome生物學(xué)方法主要指病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移,包括RNA病毒和DNA病毒兩類。逆轉(zhuǎn)錄病毒(RV)、腺病毒(AV)、腺病毒相關(guān)病毒(AAV)、單純皰疹病毒(HSV)、禽類病毒(PoV)、痘苗病毒(VV)和細(xì)小病毒(PaV)等。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體優(yōu)點(diǎn):
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能將外源基因穩(wěn)定地插入靶細(xì)胞的染色體中,進(jìn)行復(fù)制和轉(zhuǎn)錄,因此轉(zhuǎn)基因效果比較穩(wěn)定、表達(dá)持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)。逆轉(zhuǎn)錄病毒可感染的細(xì)胞范圍廣、感染效率較高;缺點(diǎn):
由于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可能產(chǎn)生具有復(fù)制能力的逆轉(zhuǎn)錄病毒,而且由于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在染色體上的隨機(jī)整合,有可能造成插入突變、干擾和影響細(xì)胞中某些正?;虻膹?fù)制和轉(zhuǎn)錄,甚至激活一些癌基因的表達(dá),產(chǎn)生嚴(yán)重的后果,因而在安全性方面具有潛在的危險(xiǎn)。
CapacitytocarrytherapeuticgenesissmallInfectivitylimitedtodividingcells腺病毒載體優(yōu)點(diǎn):腺病毒載體有較大的宿主范圍可以感染非分裂期細(xì)胞由于其感染細(xì)胞時(shí)不整合到宿主染色體,潛在的致癌危險(xiǎn)性小;
EfficiencyoftransductionishighHighlevelgeneexpression缺點(diǎn):腺病毒和痘苗病毒載體由于表達(dá)時(shí)間有限,所以很難用于需要長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)的一些基因治療項(xiàng)目,如遺傳病的基因治療等。單純皰疹病毒載體單純皰疹病毒具有嗜神經(jīng)性,可用作中樞神經(jīng)系統(tǒng)靶向的良好載體不整合入宿主基因組,不會(huì)引起被感染細(xì)胞出現(xiàn)插入突變的可能性可以在細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期存在,有可能獲得穩(wěn)定的表達(dá)基因治療疾病的種類遺傳病的基因治療
腫瘤的基因治療常見遺傳病的基因治療腺苷脫氨酶(ADA)基因缺陷病:ADA缺乏者有反復(fù)受感染的危險(xiǎn),并且極容易較早患上癌癥首次實(shí)際應(yīng)用始于1990年9月,美國(guó)一名患腺苷脫氨酶(ADA)基因缺陷病的4歲女孩進(jìn)行了人類歷史上首次基因治療獲得成功,它標(biāo)志著基因治療臨床應(yīng)用階段的開始。將ADA轉(zhuǎn)入自身T細(xì)胞,5年后仍10%造血細(xì)胞ADA陽(yáng)性只需小劑量服用ADA蛋白,其它體征正常14歲時(shí)仍然健康一年之后,又在一名9歲的兒童身上進(jìn)行了臨床試驗(yàn)。均取得了較好的治療效果。血友病血友病是一種常見的遺傳性出血性疾病,它是由于血液中缺乏某種凝血因子而導(dǎo)致患者的凝血功能出現(xiàn)障礙。根據(jù)患者所缺乏的凝血因子的種類不同,可以將常見的血友病分為血友病A、血友病B和血友病C三類。其中血友病A缺乏凝血因子Ⅷ,血友病B缺乏凝血因子Ⅸ,血友病C缺乏凝血因子Ⅺ。血友病的共同特點(diǎn)是機(jī)體在受到輕微損傷時(shí),就會(huì)出現(xiàn)出血不止的傾向。傳統(tǒng)的治療方法是患者輸入凝血因子的血制品.細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)篩選培養(yǎng)上清凝血因子Ⅸ的測(cè)定細(xì)胞連續(xù)傳代形態(tài)學(xué)觀察、染色體分析、內(nèi)毒素過敏試驗(yàn)、裸鼠接種試驗(yàn)、常規(guī)病理學(xué)檢查和輔助病毒的PCR檢測(cè)攜帶有人凝血因子ⅨcDNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體患者自身的皮膚成纖維細(xì)胞
感染未發(fā)現(xiàn)致畸和致癌現(xiàn)象從1987年起,復(fù)旦大學(xué)遺傳所就以血友病B為基因治療的研究對(duì)象。1991年11月對(duì)2例血友病B患者進(jìn)行了世界上首次血友病B基因治療的臨床Ⅰ期試驗(yàn)?zāi)壳埃灿?名血友病B患者接受了基因治療。結(jié)果:
患者經(jīng)治療后體內(nèi)凝血因子Ⅸ濃度上升,出血癥狀不同程度減輕,2位患者療效較顯著,其中1位治療后年內(nèi)沒有出現(xiàn)自發(fā)出血現(xiàn)象。4位治療后均未出現(xiàn)與基因治療有關(guān)的毒副反應(yīng)。問題:
凝血因子Ⅸ的水平只能達(dá)到正常值的5%,只能使血友病患者從中型轉(zhuǎn)變?yōu)檩p型,還不能從根本上使血友病患者消除癥狀下一步工作:選擇更好的表達(dá)載體和靶細(xì)胞以便獲得凝血因子Ⅸ在體內(nèi)的長(zhǎng)期高效表達(dá),以及建立更為簡(jiǎn)便有效的基因轉(zhuǎn)移和細(xì)胞移植途徑等問題都還有待于進(jìn)一步研究。家族性高膽固醇血癥:家族性高膽固醇血癥是由于低密度脂蛋白受體缺陷而導(dǎo)致血中膽固醇水平過高,患者多死于冠心病。通過基因治療可以表達(dá)更多的低密度脂蛋白受體,以便降低血液中膽固醇的水平。1992年6月Willson等利用低密度脂蛋白受體cDNA構(gòu)建的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,感染體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞,并將受感染的肝細(xì)胞輸回體內(nèi),經(jīng)治療后,患者血清中的膽固醇下降20%-40%,取得了明顯的治療效果。問題:上述受感染的肝細(xì)胞輸回體內(nèi)后,轉(zhuǎn)染的基因可能只是有效地糾正了肝臟某處的3%-4%的肝細(xì)胞,如果能糾正5%的肝細(xì)胞,就可以使患者的癥狀得到明顯改善;如果能使被糾正的肝細(xì)胞超過15%,患者就能正常生活。為克服上述基因治療的缺點(diǎn),用腺病毒代替逆轉(zhuǎn)錄病毒可能更有效。有關(guān)這方面的研究正在進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。腫瘤的基因治療細(xì)胞因子導(dǎo)入療法編碼細(xì)胞因子的基因?qū)爰?xì)胞(腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞本身),使其在腫瘤浸潤(rùn)部位合成細(xì)胞因子或在局部腫瘤中穩(wěn)定、持續(xù)的表達(dá),通過增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境中抗癌免疫達(dá)到治療腫瘤的目的。常用的細(xì)胞因子白細(xì)胞介素Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ,干擾素-α,腫瘤壞死因子(TNF)和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)等。腫瘤抑制基因療法腫瘤抑制基因的失活與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。將正常的腫瘤抑制基因?qū)肽[瘤細(xì)胞可以替代或補(bǔ)償有缺陷的基因,從而達(dá)到抑制腫瘤的生長(zhǎng)或逆轉(zhuǎn)其表型的目的。如p53基因就是人類腫瘤發(fā)生過程中最常發(fā)生變化的腫瘤抑制基因之一。缺點(diǎn)是必須處理100%的轉(zhuǎn)化細(xì)胞才能達(dá)到治愈癌癥的目的.“自殺”基因療法自殺基因所編碼的蛋白產(chǎn)物能夠使無毒性的化療藥物的前體在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)換為強(qiáng)毒性藥物,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞“自殺”而死亡,達(dá)到選擇性地殺傷腫瘤的目的。正常組織由于未轉(zhuǎn)染該基因,不能表達(dá)該“自殺基因”的產(chǎn)物,因而不能激活前體藥物,避免了組織的損傷。GCVGCV-TP有毒性GCV-MPGCVHSVtk細(xì)胞內(nèi)激酶丙氧鳥苷:GCV單純皰疹病毒胸苷激酶:HSVtk載基因納米粒注射劑Tumor-TargetedGeneTherapyVectorRexin-G抗腫瘤藥伊佩尤斯生物技術(shù)(EpeiusBiotechnologies)2007年12月13日(菲律賓)本品是全世界范圍內(nèi)首個(gè)獲準(zhǔn)上市的載基因納米粒藥品(2003年美國(guó)FDA批準(zhǔn)其為治療胰腺癌的罕用藥物),是對(duì)人體實(shí)際有效的靶向基因釋藥系統(tǒng)。每一Rexin-G納米粒僅100nm大小,盡管其外形小,但內(nèi)部結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜。包裹外層、基質(zhì)、殼體、多種酶和基因物質(zhì)等成分組成的納米粒,可釋放致命的殺傷部件。此殺傷部件是專門殺滅腫瘤的基因,可選擇性殺死癌細(xì)胞并阻斷其相關(guān)的血供而不損傷正常細(xì)胞和健康組織。以納米粒釋放致命部件是“趨病理”的,即它特異地靶向疾病組織。趨病理靶向讓Rexin-G尋找出和摧毀不管在人體任何部位的腫瘤,因而減少腫瘤對(duì)人體的危害,延長(zhǎng)存活期并改善患者的生活質(zhì)量。
DNA疫苗以基因治療為基礎(chǔ)的疫苗已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的有瘧疾,乙肝,AIDS的DNA疫苗目前,腫瘤的基因治療主要選擇惡性程度高、其它方法難以治療的腫瘤作為研究對(duì)象,如惡性腦膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、腎母細(xì)胞瘤、肝癌、肺癌、胃癌和白血病等大多數(shù)研究還只是處在臨床或即將進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段許多問題還有待于進(jìn)一步的研究,這其中既有研究和應(yīng)用的技術(shù)問題,也有大量的安全性問題基因治療的問題:1、發(fā)現(xiàn)切實(shí)有效的治療基因;2、外源基因表達(dá)的調(diào)控;3、構(gòu)建高效、靶向性基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng);生物芯片技術(shù)何為生物芯片?生物芯片主要指通過平面微細(xì)加工技術(shù)在固體芯片表面構(gòu)建的微流體分析單元和系統(tǒng),以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、蛋白質(zhì)、核酸以及其他生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測(cè)。他是繼大規(guī)模集成電路之后的又一次具有深遠(yuǎn)意義的科學(xué)技術(shù)革命。生物芯片技術(shù)原理生物芯片分類基因芯片(Genechip)生物芯片主要指基因芯片?;蛐酒址QDNA芯片(DNAChip)。它是在基因探針的基礎(chǔ)上研制出的,所謂基因探針只是一段人工合成的堿基序列,根據(jù)堿基互補(bǔ)的原理,利用基因探針到基因混合物中識(shí)別特定基因。它將大量探針分子固定于支持物上,然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交,通過檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)度及分布來進(jìn)行分析。
基因芯片是生物芯片研究中,最先實(shí)現(xiàn)商品化的產(chǎn)品。蛋白質(zhì)芯片與基因芯片的基本原理相同,但它利用的不是堿基配對(duì)而是抗體與抗原結(jié)合的特異性即免疫反應(yīng)來檢測(cè)。蛋白質(zhì)芯片構(gòu)建的簡(jiǎn)化模型為:選擇一種固相載體能夠牢固地結(jié)合蛋白質(zhì)分子(抗原或抗體),這樣形成蛋白質(zhì)的微陣列,即蛋白質(zhì)芯片。如果加入與之特異性反應(yīng)的帶有特殊標(biāo)記的蛋白質(zhì)分子(抗體或抗原),兩者結(jié)合后,通過對(duì)標(biāo)記物的檢測(cè)來實(shí)現(xiàn)抗原抗體的互檢,即蛋白質(zhì)的檢測(cè)。此種方法構(gòu)建的模型所需蛋白質(zhì)的量極少,反應(yīng)相對(duì)較快,蛋白質(zhì)芯片穩(wěn)定性較好,靈敏度較高,在臨床檢測(cè)方面大有發(fā)展。芯片實(shí)驗(yàn)室為高度集成化的集樣品制備、基因擴(kuò)增、核酸標(biāo)記及檢測(cè)為一體的便攜式生物分析系統(tǒng),它最終的目的是實(shí)現(xiàn)生化分析全過程全部集成在一片芯片上完成,從而使現(xiàn)有的許多煩瑣、費(fèi)時(shí)、不連續(xù)、不精確和難以重復(fù)的生物分析過程自動(dòng)化、連續(xù)化和微縮化,屬未來生物芯片的發(fā)展方向?;蛐酒谱鞣椒ㄔ缓铣煞?/p>
(InSituSynthesis)以Affymetrix公司開發(fā)的光引導(dǎo)聚合法為代表光引導(dǎo)聚合技術(shù)是照相平板印刷技術(shù)(photolithography)與傳統(tǒng)的核酸、多肽固相合成技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物。其主要特征是:①可在芯片上根據(jù)已知序列原位合成,省去了麻煩的樣品處理過程;②使用合成試劑將芯片之間的差異減少到最??;③能得到高密度的陣列。
原位合成
(InSituSynthesis)合成點(diǎn)樣法合成工作用傳統(tǒng)的DNA或多肽固相合成儀完成,只是合成后用特殊的自動(dòng)化微量點(diǎn)樣裝置將其以比較高的密度涂布于硝酸纖維膜、尼龍膜或玻片上。優(yōu)點(diǎn):保持樣品原型,操作迅速,成本低廉,用途廣泛。缺點(diǎn):樣品必須預(yù)先合成,需要一系列的純化及儲(chǔ)存等后續(xù)過程;密度達(dá)不到類似照相平板印刷術(shù)的水平?,F(xiàn)在已有比較成型的點(diǎn)樣裝置出售,如美國(guó)Biodot公司的點(diǎn)膜產(chǎn)品以及CartesianTechnologies公司的PixSysNQ/PA系列產(chǎn)品。
生物芯片的應(yīng)用基因表達(dá)譜研究
基因疹斷
藥物篩選
個(gè)體化醫(yī)療
測(cè)序
生物信息學(xué)研究基因表達(dá)譜研究理論上,有10000個(gè)基因的人類基因組可在一張芯片上、一次雜交反應(yīng)中觀察到其在目的細(xì)胞的實(shí)際表達(dá)狀態(tài),包括表達(dá)與否,表達(dá)豐度,而且兩種相關(guān)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)可在同一張片子上同時(shí)做出來,便于最小實(shí)驗(yàn)誤差情況下比較二者細(xì)微差異(雙色熒光檢測(cè))。這樣將具體的分
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