培養(yǎng)基配制及消毒與滅菌及LB培養(yǎng)基制備

培養(yǎng)基配制及消毒與滅菌及LB培養(yǎng)基制備第1頁/共16頁培養(yǎng)基的配制及消毒與滅菌及LB培養(yǎng)基的制備第2頁/共16頁一、實驗目的1了解培養(yǎng)基的種類、掌握培養(yǎng)基的配制、分裝方法和滅菌前的準備工作；高壓滅菌的原理、使用范圍和注意事項。2明確培養(yǎng)基的配制原理。3通過對LB培養(yǎng)基的配制，掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。第3頁/共16頁培養(yǎng)基是人工地將多種物質按各種微生物生長的需要配制而成的一種混合營養(yǎng)基質，用以培養(yǎng)或分離各種微生物。因此，營養(yǎng)基質應當有微生物所能利用的營養(yǎng)成分（包括碳源、氮源、能源、無機鹽、生長因素）和水。根據微生物的種類和實驗目的不同，培養(yǎng)基也有不同的種類和配制方法。第4頁/共16頁按成分的不同分類

1．天然培養(yǎng)基:主要成分是復雜的天然有機物質，如馬鈴薯、豆芽汁、牛肉膏、蛋白胨、血清等。這些復雜天然有機物質的成分不完全了解，每次所用的原料，其中各成分的數量也不恒定。這類培養(yǎng)基是實驗室常用的培養(yǎng)基，例如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬鈴薯培養(yǎng)基等。2．合成培養(yǎng)基:用化學成分完全了解的純試劑配制而成的培養(yǎng)基，如高氏1號培養(yǎng)基，查氏培養(yǎng)基等。一般用于營養(yǎng)代謝、分類鑒定、菌種選育、遺傳分析等。第5頁/共16頁按培養(yǎng)基的物理狀態(tài)分類

1．固體培養(yǎng)基:在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑即為固體培養(yǎng)基。實驗用的凝固劑有瓊脂、明膠和硅膠，后者用于配制自養(yǎng)微生物的固體培養(yǎng)基。對其他多數微生物來講，以瓊脂最為合適，一般加入1．5—2．5%即可凝固成固體。此培養(yǎng)基可供分離、鑒定、活菌計數、菌種保藏等用。2．半固體培養(yǎng)基:在液體培養(yǎng)基中加入少量凝固劑即為半固體培養(yǎng)基，例如瓊脂只需加入0．2—0．7%。常用作細菌動力檢查和菌種保存、噬菌體制劑的制備等。3．液體培養(yǎng)基:沒有加瓊脂，配好后成液體狀態(tài)的培養(yǎng)基。常用于生理代謝的研究和工業(yè)發(fā)酵等。第6頁/共16頁按培養(yǎng)基的用途分類

1．基礎培養(yǎng)基:含有一般細菌生長繁殖需要的基本的營養(yǎng)物質。最常用的基礎培養(yǎng)基是上面提及的天然培養(yǎng)基中的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基可作為一些特殊培養(yǎng)基的基礎成分。2．營養(yǎng)培養(yǎng)基（加富培養(yǎng)基）:在基礎培養(yǎng)基中加入某些特殊營養(yǎng)物質，如血液、血清、酵母浸膏或生長因子等。用以培養(yǎng)對營養(yǎng)要求高的微生物，如培養(yǎng)百日咳桿菌需要含有血液的培養(yǎng)基。第7頁/共16頁3．鑒別培養(yǎng)基:是一類含有某種特定化合物或試劑的培養(yǎng)基。某種微生物在這種培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，它所產生的某種代謝產物與這種特定的化合物或試劑能發(fā)生某種明顯的特征性反應，根據這一特征性反應可以將某種微生物與其他種微生物區(qū)別開來。主要用于不同類型微生物的快速鑒定，如用來檢查細菌能否產生硫化氫的醋酸鉛培養(yǎng)基。4．選擇培養(yǎng)基:利用微生物對某種或某些化學物質的敏感性不同，在培養(yǎng)基中加入這類物質，抑制不需要的微生物生長，而利于所需分離的微生物生長，從而達到分離或鑒別某種微生物的目的，如分離真菌的馬丁氏培養(yǎng)基。既有選擇作用又有鑒別作用的培養(yǎng)基，如鑒別腸道桿菌的遠藤氏培養(yǎng)基等。第8頁/共16頁二、基本原理LB培養(yǎng)基是一種應用最廣泛和最普通的細菌基礎培養(yǎng)基，有時又稱為普通培養(yǎng)基。它含有酵母提取物、蛋白胨和NaCl。碳源和能源：酵母提取物，氮源：磷酸鹽、蛋白胨，無機鹽：NaCl。在配制固體培養(yǎng)基時還要加入一定量瓊脂作凝固劑。瓊脂在常用濃度下96℃時溶化，一般實際應用時在沸水浴中或下面墊以石棉網煮沸溶化，以免瓊脂燒焦。瓊脂在40℃時凝固，通常不被微生物分解利用。第9頁/共16頁由于這種培養(yǎng)基多用于培養(yǎng)細菌，因此，要用稀酸或稀堿將其pH調至中性或微堿性，以利于細菌的生長繁殖。LB培養(yǎng)基的配方如下：酵母提取物5g、蛋白胨10g、NaCl5g、瓊脂15～20g、水1000mL、pH7.4～7.6第10頁/共16頁三、實驗器材酵母提取物，蛋白胨，NaCl，瓊脂；1mol/LNaOH，1mol/LHCl；試管，三角燒瓶，燒杯，量筒，玻棒，培養(yǎng)基分裝器，天平，牛角匙，高壓蒸汽滅菌鍋，pH試紙（pH5.5～9.0），棉花，牛皮紙，記號筆，麻繩，紗布等。第11頁/共16頁四、實驗步驟1．稱量按培養(yǎng)基配方比例依次準確地稱取酵母提取物、蛋白胨、NaCl放入燒杯中。蛋白胨很易吸潮，在稱取時動作要迅速。另外，稱藥品時嚴防藥品混雜，一把牛角匙用于一種藥品，或稱取一種藥品后，洗凈、擦干，再稱取另一藥品，瓶蓋也不要蓋錯。2．溶化在上述燒杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒攪勻，然后，在石棉網上加熱使其溶解。待藥品完全溶解后，補充水分到所需的總體積。如果配制固體培養(yǎng)基，將稱好的瓊脂放入已溶化的藥品中，再加熱溶化，在瓊脂溶化的過程中，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底使燒杯破裂。最后補足所失的水分。第12頁/共16頁3．調pH在未調pH前，先用精密pH試紙測量培養(yǎng)基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培養(yǎng)基中逐滴加入1mol/LNaOH，邊加邊攪拌，并隨時用pH試紙測其pH值，直至pH達7.6。反之，則用1mol/LHCl進行調節(jié)。注意pH值不要調過頭，以避免回調，否則，將會影響培養(yǎng)基內各離子的濃度。對于有些要求pH值較精確的微生物，其pH的調節(jié)可用酸度計進行（使用方法，可參考有關說明書）。4．分裝

(1)液體分裝分裝高度以試管高度的1/4左右為宜。(2)固體分裝分裝試管，其裝量不超過管高的1/5，滅菌后制成斜面，分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積的一半為宜。(3)半固體分裝試管一般以試管高度的1/3為宜，滅菌后垂直待凝。第13頁/共16頁5．加塞培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口或三角燒瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物進入培養(yǎng)基內而造成污染，并保證有良好的通氣性能。6.包扎加塞后，將全部試管用麻繩捆扎好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時冷凝水潤濕棉塞，其外再用一道麻繩扎好。用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、日期。三角燒瓶加塞后，外包牛皮紙，用麻繩以活結形式扎好，使用時容易解開，同樣用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、日期。7．滅菌將上述培養(yǎng)基以1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.3℃，20分鐘高壓蒸汽滅菌。如因特殊情況不能及時滅菌，則應放入冰箱內暫存。第14頁/共16頁