色譜法的基本原理

色譜法的基本原理第一頁，共五十二頁，2022年，8月28日

色譜分析法是用來進(jìn)行混合物中各組分的分離和分析的一種物理化學(xué)分析方法。1.1色譜法概述1.1.1色譜法發(fā)展史固定相流動(dòng)相1第二頁，共五十二頁，2022年，8月28日

1903年，俄國植物學(xué)家Tswett利用吸附原理分離植物色素而發(fā)明色譜法(chromatography)。

1941年MartinAJP和SyngeRLM發(fā)明液液分配色譜、獲1952年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

1952年MartinAJP和JamesAT發(fā)明氣相色譜(gaschromatography,GC)70年代發(fā)展了高效液相色譜(High-performanceliquidchromaotgraphy,HPLC)成為重要分離分析技術(shù)

80年代JorgensonJW等的研究工作推動(dòng)了高效毛細(xì)管電泳(High-performancecapillaryelectrophoresis,HPCE)高速發(fā)展2第三頁，共五十二頁，2022年，8月28日1.1.2色譜法分類1、按兩相所處的狀態(tài)分類氣相色譜--------用氣體作流動(dòng)相液相色譜--------用液體作流動(dòng)相由于固定相可分為固體吸附劑和涂在固體擔(dān)體上或毛細(xì)管內(nèi)壁上的液體固定相，故可將色譜法分為下述四類：流動(dòng)相氣體液體固體液體固定相氣-固色譜液-液色譜氣-液液-固3第四頁，共五十二頁，2022年，8月28日2、按固定相形狀分類①柱色譜固定相裝在柱管內(nèi)。它又可分為填充柱色譜和空心毛細(xì)管色譜。GC填充柱:長1－10m，2－4mm空心毛細(xì)管:長10－100m，0.1－0.5mmLC:長0.1－0.5m，4－6mm②紙色譜用濾紙作固定相，試樣溶液在紙上進(jìn)行展開、分離。③薄層色譜將固定相研磨成粉末，再壓成薄膜或涂成薄膜。樣品的分離形式類似紙色譜。(紙色譜和薄層色譜又統(tǒng)稱作平板色譜)4第五頁，共五十二頁，2022年，8月28日3、按分離過程的物理化學(xué)原理分類①吸附色譜(L－S，G－S)利用吸附劑表面對(duì)不同組分物理吸附性能的差異進(jìn)行分離。②分配色譜(L－L，G－L)利用不同組分在兩相中分配系數(shù)的不同進(jìn)行分離。③離子交換色譜(L－S)利用組分離子與離子交換劑的交換能力不同進(jìn)行分離。④空間排阻色譜(L－S)用多孔物質(zhì)對(duì)不同大小分子的阻礙作用進(jìn)行分離。5第六頁，共五十二頁，2022年，8月28日1.2色譜分離原理1.2.1分配系數(shù)和分配比1.分配系數(shù)s：固定相m：流動(dòng)相2.分配比(保留因子)定義：在一定的溫度、壓力下，組分在氣液兩相間達(dá)平衡時(shí)，分配在液相中的質(zhì)量與分配在氣相中的質(zhì)量之比。即6第七頁，共五十二頁，2022年，8月28日k:隨K和流動(dòng)相、固定相體積的變化而變化，而K是由組分及固定液的熱力學(xué)性質(zhì)決定的。

β：相比Vm：色譜柱中流動(dòng)相體積，Vs：色譜柱中固定相體積7第八頁，共五十二頁，2022年，8月28日1.2.2分離原理8第九頁，共五十二頁，2022年，8月28日1.3色譜流出曲線、色譜峰流出曲線（色譜圖）：電信號(hào)強(qiáng)度隨時(shí)間變化曲線色譜峰：流出曲線上突起部分9第十頁，共五十二頁，2022年，8月28日

1.峰高

色譜峰頂點(diǎn)與基線之間的距離，以h表示，如圖中AB

2．標(biāo)準(zhǔn)偏差σ

0.607h處，拐點(diǎn)處，峰寬正好為2σ3．峰面積A

A＝1.065hY1/24．半峰寬Y1/2Y1/2=2.354σ5．峰底寬

Y=4σ，拐點(diǎn)作切線與基線相交，相交兩點(diǎn)，兩點(diǎn)間距離為峰底寬，如圖中AB。σ、Y1/2、Y統(tǒng)稱為區(qū)域?qū)挾?0第十一頁，共五十二頁，2022年，8月28日

保留值是用來描述待測(cè)試樣中各組分在色譜柱中滯留情況的物理量，通常用距離或?qū)⒏鹘M分帶出色譜柱所需的載氣體積（或時(shí)間）表示。在一定的固定相和操作條件下，任何一種物質(zhì)都有一個(gè)固定的保留值，故組分的保留值可用于該組分的定性鑒定。1．死時(shí)間tM

不被固定相吸附或溶解的組分從進(jìn)樣開始到柱后出現(xiàn)響應(yīng)信號(hào)極大值時(shí)所需時(shí)間。對(duì)于氣相色譜，常把空氣（熱導(dǎo)檢測(cè)器）和甲烷（氫火焰離子化檢測(cè)器）從進(jìn)樣到出峰的時(shí)間稱為死時(shí)間。1.3.2保留值11第十二頁，共五十二頁，2022年，8月28日

2．保留時(shí)間tR

試樣從進(jìn)樣開始到柱后出現(xiàn)峰極大點(diǎn)時(shí)所經(jīng)歷的時(shí)間，稱為保留時(shí)間，如圖O‘B′。它相應(yīng)于樣品到達(dá)柱末端的檢測(cè)器所需的時(shí)間。3.調(diào)整保留時(shí)間

扣除死時(shí)間后的保留時(shí)間。

tR′=tR－tM4.流動(dòng)相的流速Vc=qct12第十三頁，共五十二頁，2022年，8月28日5．死體積VM

不被保留的組分，即分配色譜中K=0的組分，可由死時(shí)間來確定。

VM=tMqV,c

6．保留體積VR從進(jìn)樣開始到柱后出現(xiàn)待測(cè)組分響應(yīng)信號(hào)極大值時(shí)所通過的載氣體積。VR=tRqV,c13第十四頁，共五十二頁，2022年，8月28日7．調(diào)整保留體積VR′

指扣除死體積后的保留體積。

VR′=VR－VM

8．相對(duì)保留值r2,1指組分2的調(diào)整保留值與組分1的調(diào)整保留值之比，是一個(gè)無因次量，只和柱溫與固定相性質(zhì)有關(guān)，故其可以作為一個(gè)定性指標(biāo)。

r2,1也可用α表示，即，α也叫做選擇因子。14第十五頁，共五十二頁，2022年，8月28日9．保留值與保留因子間的關(guān)系15第十六頁，共五十二頁，2022年，8月28日16第十七頁，共五十二頁，2022年，8月28日從色譜流出曲線可以得到以下一些信息：a．樣品所含最少組分(峰個(gè)數(shù))b．根據(jù)色譜峰的保留值可以進(jìn)行定性分析c．根據(jù)色譜峰的面積或峰高可以進(jìn)行定量分析d．根據(jù)色譜峰的位置和區(qū)域?qū)挾瓤蓪?duì)色譜柱效能進(jìn)行評(píng)價(jià)17第十八頁，共五十二頁，2022年，8月28日1.4塔板理論實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證假設(shè)理論模型(數(shù)學(xué)表達(dá)式)修改模型完善模型1.4.1塔板理論的假設(shè)在自然科學(xué)上，科學(xué)理論：塔板理論思路源于精餾塔18第十九頁，共五十二頁，2022年，8月28日塔板理論的假設(shè)：1.柱分成n段，n為理論塔板數(shù)，每段高為H，H為塔板高度，柱長為L，則n=L/H2.所有組分開始都加在第零號(hào)塔板上。3.在每塊塔板上被測(cè)物在氣液間的平衡是瞬間建立的。4.載氣是以脈沖式(塞子式)進(jìn)入色譜柱進(jìn)行沖洗的，每次恰好為一個(gè)塔板體積ΔV。5.在所有塔板上，同一組分的分配系數(shù)為常數(shù)，即和組分的量無關(guān)。6.沿色譜柱方向不存在塔板與塔板間被測(cè)物的縱向擴(kuò)散。19第二十頁，共五十二頁，2022年，8月28日假定：K=1Vs/Vm=1k=1n=5進(jìn)樣量m=10.50.50.250.250.250.250.1250.250.1250.1250.250.1250.06250.1880.1880.06250.06250.1880.1880.06250.031250.1250.1880.1250.031250.031250.1250.1880.1250.03125

m=1μg1ΔV2ΔV3ΔV4ΔV0123420第二十一頁，共五十二頁，2022年，8月28日被測(cè)物流出色譜柱時(shí)流動(dòng)相中被測(cè)物濃度隨體積(或時(shí)間)的變化曲線。21第二十二頁，共五十二頁，2022年，8月28日這一理論得到結(jié)果1．分布有一最大，兩邊逐漸減小2．最大及整個(gè)分布曲線向后推移3．流出曲線方程(也稱塔板理論方程)，即數(shù)學(xué)表達(dá)式：C：不同流出體積時(shí)的組分濃度m：進(jìn)樣量VR：保留體積n：塔板數(shù)V：流出體積22第二十三頁，共五十二頁，2022年，8月28日理論塔板數(shù)與色譜參數(shù)之間的關(guān)系為：

單位柱長的塔板數(shù)越多，表明柱效越高。

用不同物質(zhì)計(jì)算可得到不同的理論塔板數(shù)。23第二十四頁，共五十二頁，2022年，8月28日有效塔板數(shù)和有效塔板高度

組分在t0時(shí)間內(nèi)不參與柱內(nèi)分配，需引入有效塔板數(shù)和有效塔板高度：24第二十五頁，共五十二頁，2022年，8月28日塔板理論的成功與局限1．成功①導(dǎo)出流出曲線數(shù)學(xué)表達(dá)式(模型)②解釋了流出曲線形狀、濃度極大點(diǎn)③提出了評(píng)價(jià)柱效的參數(shù)(n)及其計(jì)算式2．局限①僅考慮了熱力學(xué)因素，沒有考慮動(dòng)力學(xué)因素。②不能說明影響柱效的原因及譜帶擴(kuò)張的原理③不能說明流速對(duì)柱效的影響，實(shí)驗(yàn)測(cè)得流速不同時(shí)n和H不同。25第二十六頁，共五十二頁，2022年，8月28日

1956年荷蘭學(xué)者范弟姆特(VanDeemter)提出了色譜過程的動(dòng)力學(xué)理論，導(dǎo)出了塔板高度H與載氣線速度u

的關(guān)系式：渦流擴(kuò)散項(xiàng)縱向擴(kuò)散項(xiàng)傳質(zhì)阻抗項(xiàng)1.5速率理論1.5.1氣相色譜法26第二十七頁，共五十二頁，2022年，8月28日A─渦流擴(kuò)散項(xiàng)

A=2λdp

dp：固定相的平均顆粒直徑λ：固定相的填充不均勻因子影響A的因素：A與填充物顆粒大小dP和填充均勻性λ(取決于填充物顆粒的大小分布和裝柱情況)有關(guān),與載氣性質(zhì)、線速和組分無關(guān)。減小渦流擴(kuò)散提高柱效的有效途徑：使用適當(dāng)?shù)牧６惹翌w粒均勻的擔(dān)體，并盡量填充均勻。27第二十八頁，共五十二頁，2022年，8月28日B/u—分子擴(kuò)散項(xiàng)

B=2γDg

γ：彎曲因子，填充柱色譜，γ<1。Dg：試樣組分分子在氣相中的擴(kuò)散系數(shù)（cm2·s-1）

分子量大的組分Dg小，Dg反比于載氣密度(分子量)的平方根,故采用分子量較大的載氣可使B項(xiàng)降低。

分子擴(kuò)散項(xiàng)還與彎曲因子γ有關(guān)。填充柱γ=0.5－0.7毛細(xì)管柱γ=1.0保留時(shí)間長，分子擴(kuò)散項(xiàng)對(duì)色譜峰變寬的影響顯著。28第二十九頁，共五十二頁，2022年，8月28日C·u—傳質(zhì)阻力項(xiàng)傳質(zhì)阻力包括氣相傳質(zhì)阻力Cg和液相傳質(zhì)阻力CL即：C=（Cg+Cl）k為分配比dp:填充物(固定相)直徑平均值氣相傳質(zhì)阻力項(xiàng)與填充物粒度的平方成正比，與組分在載氣流中的擴(kuò)散系數(shù)成反比，因此采用粒度小的填充物和分子量小的氣體作載氣可使Cg減小，從而提高柱效。29第三十頁，共五十二頁，2022年，8月28日液相傳質(zhì)過程：指待測(cè)試樣組分從固定相的氣液界面移動(dòng)到液相內(nèi)部，發(fā)生質(zhì)量交換以達(dá)到分配平衡，然后又返回氣液界面的傳質(zhì)過程。Cl：液相傳質(zhì)阻力系數(shù)df：固定相液膜厚度Dl：組分在液相中的擴(kuò)散系數(shù)(m2/s)減小液膜厚度df，增大組分在液相中的擴(kuò)散系數(shù)Dl，均可提高柱效。30第三十一頁，共五十二頁，2022年，8月28日擔(dān)體(Substrate)固定液(Liquidstationaryphase)組分(Component)dpdf31第三十二頁，共五十二頁，2022年，8月28日范氏方程說明了在色譜分離條件的選擇中，填充均勻程度、填充物的粒度、流動(dòng)相的種類及流速、固定相的液膜厚度等對(duì)柱效和峰展寬的影響32第三十三頁，共五十二頁，2022年，8月28日33第三十四頁，共五十二頁，2022年，8月28日2．分子擴(kuò)散項(xiàng)(縱向擴(kuò)散項(xiàng))B/uB＝CdDmCd：常數(shù)Dm：分子在液相中擴(kuò)散系數(shù)一般Dg＝10－1cm2/s，Dm＝10－5cm2/s，所以對(duì)于液相色譜，這一項(xiàng)可忽略。341.5.2液相色譜法1．渦流擴(kuò)散項(xiàng)AA＝2λdpλ：填充不規(guī)則因子dp：填充物平均直徑第三十五頁，共五十二頁，2022年，8月28日3．傳質(zhì)阻力項(xiàng)Cu固定相傳質(zhì)阻力項(xiàng)滯留的流動(dòng)相傳質(zhì)阻力項(xiàng)流動(dòng)相滯留在一個(gè)局部，一般停滯不動(dòng)，Csm與液相中流動(dòng)相的多少及k有關(guān)。Cs與容量因子k有關(guān),df：液膜厚度流動(dòng)相傳質(zhì)阻力項(xiàng)Cm與k有關(guān)35第三十六頁，共五十二頁，2022年，8月28日36第三十七頁，共五十二頁，2022年，8月28日1.6分離度

1.6.1定義分離度Rs是相鄰兩組分色譜峰保留值之差與兩個(gè)組分色譜峰峰底寬度總和的一半的比值。Y1，Y

2：兩組分色譜峰峰底寬度：兩組分保留時(shí)間37第三十八頁，共五十二頁，2022年，8月28日

分離度R是既能反映柱效率又能反映選擇性的指標(biāo)，稱總分離效能指標(biāo)。分離度又叫分辨率R=0.8：兩峰的分離程度可達(dá)89%，有部分重疊；R=1：分離程度98%；R=1.5：達(dá)99.7%（相鄰兩峰完全分離的標(biāo)準(zhǔn)）。38第三十九頁，共五十二頁，2022年，8月28日熱力學(xué)動(dòng)力學(xué)容量因素1.6.2分離方程

39第四十頁，共五十二頁，2022年，8月28日1.柱效的影響

分離度與柱效因子n的平方根成正比，α一定時(shí)，增加柱長以增加柱效n，可提高分離度，但組分保留時(shí)間增加且峰擴(kuò)展，分析時(shí)間長。增加n值得另一辦法是減小柱的H值2.分配比的影響柱容量項(xiàng)k/(k+1)值隨k的值增大而增加，分離度隨之增加，但當(dāng)k>10時(shí)，對(duì)Rs改進(jìn)已不明顯，一般控制在1～10之間。1.6.3影響分離度的因素

40第四十一頁，共五十二頁，2022年，8月28日2.選擇性的影響

增大是提高分離度的最有效方法。在相同分離度下當(dāng)增加一倍，需要的n有效減小10000倍。增大的最有效方法是選擇合適的固定相。41第四十二頁，共五十二頁，2022年，8月28日1.6.1色譜定性鑒定方法1.利用純物質(zhì)定性的方法

利用保留值定性：通過對(duì)比試樣中具有與純物質(zhì)相同保留值的色譜峰，來確定試樣中是否含有該物質(zhì)及在色譜圖中的位置。

利用加入法定性：將純物質(zhì)加入到試樣中，觀察各組分色譜峰的相對(duì)變化。1.6定性和定量分析42第四十三頁，共五十二頁，2022年，8月28日與其他分析儀器聯(lián)用的定性方法

小型化的臺(tái)式色質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS；LC-MS）色譜-紅外光譜儀聯(lián)用儀；組分的結(jié)構(gòu)鑒定SampleSample

58901.0DEG/MINHEWLETTPACKARDHEWLETTPACKARD5972AMassSelectiveDetectorDCBA

ABCDGasChromatograph(GC)MassSpectrometer(MS)SeparationIdentificationBACD43第四十四頁，共五十二頁，2022年，8月28日1.6.2色譜定量分析方法1.峰面積的測(cè)量（1）峰高（h）乘半峰寬（Y1/2）法：近似將色譜峰當(dāng)作等腰三角形。此法算出的面積是實(shí)際峰面積的0.94倍：

A=1.065h·Y1/2（2）峰高乘平均峰寬法：當(dāng)峰形不對(duì)稱時(shí)，可在峰高0.15和0.85處分別測(cè)定峰寬，由下式計(jì)算峰面積：

A=h·（Y

0.15+Y

0.85）/2

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