組織病理學制片技術(shù)詳解演示文稿

組織病理學制片技術(shù)詳解演示文稿當前1頁，總共60頁。（優(yōu)選）組織病理學制片技術(shù)當前2頁，總共60頁。目的和要求

AimsandRequirements了解生物組織的特點及取材的注意事項；熟悉切片的原理、一般要求及注意事項；掌握石蠟切片制作技術(shù)；當前3頁，總共60頁。病理學常用的觀察手段

Thecommonsurveymeansinpathology1、大體標本觀察：主要用肉眼、量尺及各種衡器等輔助工具，對所檢標本的大小、形狀、色澤、重量、表面及切面、病灶特點進行觀察及測量。2、組織切片的觀察：取正?；虿∽兘M織進行切片、染色(HE染色最常用)在顯微鏡下進行觀察。當前4頁，總共60頁。病理學標本的種類

Typesofpathologicsamples1、活體組織檢查(Biopsy)：簡稱活檢，從患者活體局部切取、鉗咬、細針吸取和摘取等手術(shù)方法獲取病變組織進行病理檢查。2、脫落細胞學檢查(Exfoliativecytologicalexam)：對患者痰液、胸腹水、尿液以及陰道刮片、食管拉網(wǎng)、纖維胃/支氣管鏡所取得的材料進行涂片，以檢查脫落細胞，是早期發(fā)現(xiàn)和診斷腫瘤的好方法。當前5頁，總共60頁。3、尸體解剖(Autopsy)：通過尸檢可查出病因和病變，及時發(fā)現(xiàn)和確診某些傳染病、新發(fā)現(xiàn)的疾病，積累經(jīng)驗，提高診療水平。4、動物實驗(Animalexperiment)：根據(jù)研究需要，在動物身上復制人類某些疾病的模型、進行觀察研究，了解疾病的病因、發(fā)病機制及藥物療效等。5、組織/細胞培養(yǎng)(TissueandCellculture)：將某種組織或單細胞在適宜的培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)，來研究各種病因作用下組織、細胞的病理變化及治療效果。當前6頁，總共60頁。病理技術(shù)的應(yīng)用Applicationofpathologictechnique幫助臨床查明死因(尸檢);手術(shù)后病變標本，明確診斷(臨床活檢);為教學、科研提供資料;當前7頁，總共60頁。取材(Samplecollection)→固定(Fixation)→脫水(Dehydration)→透明(Transparentizing)→浸蠟(Paraffinsoaking)→包埋(Embedding)第一節(jié)組織處理

Tissueprocessing當前8頁，總共60頁。

1.人為因素

2.標本大小

3.取材時間

4.包埋方向

5.邊緣標記一、取材(Samplescollection)當前9頁，總共60頁。6.小標本的處理方法

7.特殊情況取材

8.取材數(shù)量

9.清除多余成分10.重復取材11.核對取材12.剩余組織存放當前10頁，總共60頁。二、固定(Fixation)固定就是用物理或化學方法，阻止組織細胞離體或培養(yǎng)細胞脫離生存環(huán)境后發(fā)生形態(tài)學變化。(一)固定的目的1.迅速阻斷組織細胞離體后的自溶性變化，防止腐敗，盡量保持組織細胞生活狀態(tài)下的形態(tài)結(jié)構(gòu)。2.使細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂肪、糖、酶等成分轉(zhuǎn)變成不溶性物質(zhì)，并保持原有的空間位置。3.固定劑有硬化作用,增加組織的硬度,便于制片。4.組織中的各種物質(zhì)經(jīng)固定后產(chǎn)生對染料的親和力，利于染色和觀察。當前11頁，總共60頁。（二）常用的固定方法1.浸泡固定法2.灌注固定法3.細胞涂片的固定方法4.微波固定法5.蒸氣固定法當前12頁，總共60頁。（三）常用的固定液1.單純固定液(1)甲醛(formaldehyde)(2)酒精(alcohol)(3)苦味酸(picricacid)

(4)丙酮(acetone)(5)醋酸(aceticacid)

當前13頁，總共60頁。2.混合固定液(1)Bouin液：用于結(jié)締組織及脂肪染色；(2)Zenker液：常用于三色染色；(3)4%多聚甲醛-磷酸二氫鈉-氫氧化鈉液；當前14頁，總共60頁。（四）固定后的處理1.一般固定液(甲醛等)固定組織后，用流水沖洗以清除組織內(nèi)的固定液終止固定。2.含有乙醇、乙酸及苦味酸的固定液，組織固定后不需要或不能用水沖洗。3.含有鉻酸、重鉻酸鉀和鋨酸的固定液，組織固定后應(yīng)充分水洗，一般為12~24h。4.用含汞的固定液固定組織后，要進行脫汞處理，可在組織脫水前或切片染色前進行，一般多在染色前脫汞。其方法為切片脫蠟入水后，入0.5%碘乙醇5~10min，水洗后再入3%~5%硫代硫酸鈉或95%乙醇1~2min，再充分水洗，蒸餾水洗后進行染色。當前15頁，總共60頁。（五）固定時的注意事項1.標本應(yīng)新鮮并及時取材，快速放入固定液中。特殊標本應(yīng)單獨固定和存放。2.固定液的用量一般固定液用量為組織塊體積的10~20倍，貴重的固定液不少于3~5倍。避免組織緊貼容器底部，影響固定效果。對于特殊染色的組織(如神經(jīng)染色及酶組織化學染色等)固定時應(yīng)考慮組織塊的大小、固定液種類、固定時間和溫度等。酶組織化學染色組織的固定應(yīng)置于冰箱4℃固定。當前16頁，總共60頁。3.防止組織變形柔軟或較薄的組織先平鋪在吸水紙上，再投入固定劑中；含氣或脂肪多的組織易浮于液面，可在組織表面覆蓋棉花以達到充分固定。4.固定液的穿透性一般固定液在24h內(nèi)不能穿透厚度大于2~3mm的實體組織或5mm的多孔疏松組織，故取材組織塊的厚度原則上不應(yīng)超過3~4mm。5.固定時間固定的時間與固定液的種類、組織類型、塊大小、溫度等有關(guān)。一般1.5cm×1.5cm×0.2~0.3cm大小的組織塊,固定時間為12~24h。6.固定溫度大多數(shù)可在室溫(25℃)固定，在低溫(如4℃)固定時，固定時間要相應(yīng)延長。當前17頁，總共60頁。三、脫水(Dehydration)組織經(jīng)固定和水洗后含大量水分，水與石蠟不能混溶。因此在浸蠟和包埋前，必須進行脫水。常見的脫水劑有乙醇、正丁醇、丙酮等。為防止水份丟失過快，造成組織變形，一般采用梯度脫水法。也就是使脫水劑的濃度逐漸升高，脫水過程盡量緩和，減少組織變形。當前18頁，總共60頁。四、透明(Transparentizing)常用的透明劑有二甲苯、苯、甲苯、氯仿、環(huán)己酮、苯甲酸甲酯、香柏油、冬青油和苯胺油等。目前也有用環(huán)己酮作為透明劑，環(huán)己酮為無色無毒液體，可與苯、二甲苯和酒精等相混合，也可溶解石蠟。而且脫水時組織不收縮變硬，用于快速石蠟切片效果較好。當前19頁，總共60頁。五、浸蠟(Paraffinwaxsoaking)用熔化的切片石蠟逐漸替換組織中二甲苯的過程。當前20頁，總共60頁。當前21頁，總共60頁。當前22頁，總共60頁。六、組織的包埋和包埋方法(Embedding)（一）常規(guī)石蠟包埋（二）脫落細胞標本的包埋（三）微小標本的包埋當前23頁，總共60頁。當前24頁，總共60頁。當前25頁，總共60頁。當前26頁，總共60頁。當前27頁，總共60頁。第二節(jié)組織切片法

(Tissuesectioning)

組織切片法包括石蠟切片法、冰凍切片法、火棉膠切片法、樹脂包埋薄切片法和大組織石蠟切片法等。常用的切片工具包括組織切片機、切片刀和自動磨刀機等。當前28頁，總共60頁。一、組織切片機和切片刀1.石蠟切片機

2.火棉膠切片機

3.恒冷箱切片機

4.震動切片機

石蠟切片機震動切片機恒冷箱切片機當前29頁，總共60頁。切片刀切片刀是切片機的重要部件，常見的有兩種：一種為可重復使用的鋼刀，一般有4cm、8cm、14cm、18cm、20～24cm等，根據(jù)切片刀的形態(tài)，有平凹型、深平凹型、平楔型、雙凹型。

另一種為一次性鋼刀片，是一種薄型切片刀片，用于普通石蠟切片。使用時固定在特制的刀架上。當前30頁，總共60頁。各種切片刀的剖面圖a平凹形

b深平凹形

c平楔形

d雙凹形當前31頁，總共60頁。石蠟切片機用一次性鋼刀片當前32頁，總共60頁。二、組織切片(Tissuesectioning)石蠟切片仍是目前各種切片制作方法中最常用、最普遍的一種方法。當前33頁，總共60頁。(一)切片前的準備1.備齊常用器具,如玻片、毛筆和鉛筆或刻字筆。2.檢查切片機的工作狀態(tài),將固件都擰緊，檢查切片刀是否鋒利,切片刀質(zhì)量是保證切片的關(guān)鍵。如果使用一次性刀片,應(yīng)根據(jù)切片情況及時調(diào)整刀刃位置。當前34頁，總共60頁。3.清潔玻片的方法（1）新載玻片的處理：先用清潔液浸泡12~24h,流水充分沖洗后,用蒸餾水洗3~5遍,95%酒精浸泡2h,用綢布擦干或用烘箱烤干備用。清潔液是用重鉻酸鉀和濃硫酸按比例配成的洗液。常用的有以下幾種配方：①重鉻酸鉀(g):濃硫酸(ml):蒸餾水(ml)=1:1:10;②重鉻酸鉀:濃硫酸:蒸餾水=2:3:25;③重鉻酸鉀:濃硫酸:蒸餾水=2:5:15。當前35頁，總共60頁。（2）蓋玻片的處理：蓋玻片可按以上方法處理，但因蓋玻片很薄，以上處理程序應(yīng)縮短。清潔液浸泡2h，流水沖洗。也可用以下方法清洗:蓋玻片立排于臥式染缸(排2行，中間隔以載玻片)。松緊度以玻片可輕松轉(zhuǎn)動為好，以下步驟應(yīng)保持液體進入每個玻片間隙，玻片之間不能有氣泡。用1%鹽酸酒精浸泡2h，然后流水沖洗干凈，再用蒸餾水沖洗數(shù)次。入95%酒精浸泡2~3h，無水酒精浸泡20min，倒掉酒精放60℃烘箱烤干備用。當前36頁，總共60頁。（二）切片制作過程1.蠟塊在冰箱中預(yù)冷，然后固定在切片機上。將切片刀裝在刀架上。調(diào)整蠟塊與刀的位置，使蠟塊切面與刀刃接近。2.切片機多為輪轉(zhuǎn)式，使用時左手執(zhí)毛筆，右手旋轉(zhuǎn)切片機轉(zhuǎn)輪。先修出標本，直到組織全部暴露于切面為止，標本過小時修塊應(yīng)多加注意，大標本要切全。切出蠟帶后，用毛筆輕輕挑起一端，用鑷子夾起另一端，正面向上放入展片水槽中(水溫一般低于蠟熔點10~12℃)，待切片展平后，即可進行撈片。當前37頁，總共60頁。3.切片時刀是由下向上運動，為得到完整的切片，防止組織出現(xiàn)刀紋裂縫，應(yīng)將組織硬脆難切的部分放在上端(如皮膚組織的表皮部分，胃腸等組織的漿膜面等)。4.撈片時注意組織片的擺放位置，盡量整齊美觀。要留出貼標簽的空間，5.撈片時注意在切片和玻片之間不要留有氣泡。撈好的切片應(yīng)在60℃左右烤箱內(nèi)烤至少30min。以防染色時脫片。當前38頁，總共60頁。當前39頁，總共60頁。當前40頁，總共60頁。當前41頁，總共60頁。（三）石蠟切片制作時的注意事項(Attentions)1.組織的取材和固定；2.組織脫水、透明和浸蠟；3.切片組織塊固定不牢時；4.切片刀和切片機；5.特殊要求切片的制作。當前42頁，總共60頁。第三節(jié)冰凍切片法

(Frozensectioning)冰凍切片可用于新鮮組織、甲醛固定的組織和低溫冰箱冷藏的組織塊等。已固定的組織塊經(jīng)流水沖洗后再進行切片。當前43頁，總共60頁。一、冰凍切片法（一）恒冷箱切片機提前開機預(yù)冷，一般工作溫度設(shè)定在-22℃左右。待刀臺、樣品臺和箱內(nèi)達到設(shè)置溫度后即可切片。順序如下：①將組織用OCT粘在樣品托后放置在速凍臺上；②組織凍結(jié)后，將樣品托固定到樣品臺上；③調(diào)整組織切面與刀刃位置，初步修出組織切面后，放下防卷板，關(guān)閉觀察窗，開始切片。④切出的切片粘貼到載玻片上，直接凍存或吹干固定。（二）半導體制冷切片機當前44頁，總共60頁。二、冰凍組織的取材及保存方法（一）取材負責診斷的醫(yī)師應(yīng)親自檢查大體標本，做多切面詳細檢查，必要時可在解剖鏡下觀察。選取最具代表性的組織制片，必要時應(yīng)多點取材。如切面有特殊要求，應(yīng)向技術(shù)人員說明。取材和切片的剩余組織須進一步做石蠟切片進行對照，有利于病理醫(yī)師對照閱片，不斷提高觀察冰凍切片的水平。當前45頁，總共60頁。（二）保存方法組織速凍的方法很多，常用方法為液氮和干冰~丙酮法。1.液氮法：將組織塊平放于瓶蓋或標本盒等適當容器內(nèi)，緩慢放入盛有液氮的容器內(nèi)。當組織塊凍結(jié)后，取出用鋁箔包好，做好標記后入液氮罐或-70℃低溫冰箱保存?？杀４鏀?shù)月至數(shù)年。如短期內(nèi)使用，可保存于-30℃冰箱。當前46頁，總共60頁。2.干冰-丙酮法：將組織塊放入盛有OCT包埋劑的標本盒內(nèi)，使組織塊完全浸沒。將丙酮倒入盛有10g干冰的保溫杯調(diào)成糊狀。將裝有組織塊的標本盒放入保溫杯，待包埋劑成白色凍塊時，取出如上法保存。此法組織速凍快，組織結(jié)構(gòu)保存好。當前47頁，總共60頁。3.異戊烷-液氮法：此法的優(yōu)點可防止冰晶破壞組織細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，對含水較多的組織適宜用此法進行速凍。先用甲基纖維素包埋組織塊。將盛有異戊烷的小燒杯放入裝有液氮的大保溫杯或冰壺內(nèi)，攪拌異戊烷待杯底出現(xiàn)一層白色糊狀物時，放入包埋好的組織塊，數(shù)秒鐘即可取出，按上述方法保存。當前48頁，總共60頁。（三）注意事項1.液氮速凍時，標本盒不能直接浸入液氮，以免組織膨脹破碎。2.速凍的包埋劑應(yīng)適量。3.新鮮組織不能放入-10℃冰箱內(nèi)緩慢冷卻，否則組織內(nèi)水分可逐漸析出形成冰晶，造成組織結(jié)構(gòu)破壞。4.冷凍后的組織塊應(yīng)密封保存，防止失水。5.在組織塊復溫時，應(yīng)在37℃加溫速融，自然復溫將造成組織結(jié)構(gòu)破壞。當前49頁，總共60頁。第四節(jié)脫落細胞制片技術(shù)

PreparationofExfoliativecytologicsamples脫落細胞標本包括：胸水、腹水、尿液、腦脊液穿刺液和一些涂片、刷片及印片的細胞，在臨床上具有非常重要的診斷價值。當前50頁，總共60頁。一、細胞標本的取材細胞標本取材和制片方法一般有印片法、穿刺法、沉淀法和活細胞標本的制備等。(一)印片法常用于活檢和手術(shù)標本，新鮮標本沿病灶中心剖開，將載片輕壓于切面上，吹干后立即浸入固定液內(nèi)5~l0min，取出自然干燥，低溫儲存。優(yōu)點是操作簡單，細胞抗原保存好。當前51頁，總共60頁。(二)穿刺液沉淀法常用于淋巴結(jié)、軟組織、肝、腎和肺等，穿剌液少，可直接涂片，細胞盡量涂均勻。穿刺液多，細胞豐富，可置離心管內(nèi)，以500rpm低速離心5~l0min，棄上清，將沉淀制成細胞懸液(2×105細胞/ml)。當前52頁，總共60頁。涂片鏡檢,以細胞較密不重疊為好。干燥后固定。胸水、腹水、尿液和腦脊液等如細胞較少時，也可用此方法制片。此法細胞保存好，操作簡單。注意涂片時，盡量涂均勻。(三)單核細胞分離法主要用于外周血和胸腹水中淋巴細胞的分離。如為血性胸腹水，經(jīng)上述方法分離淋巴細胞然后在37℃培養(yǎng)30min，離心沉淀取上清，制成濃度為2×106細胞/ml的細胞懸液，吸50μl涂片，略干后固定l0min。當前53頁，總共60頁。當前54頁，總共60頁。當前55頁，總共60頁。2023/3/956宮頸脫落細胞涂片見分化不良細胞體積大、核深染；正常上皮細胞核小、胞漿豐富。當前56頁，總共60頁。二、血涂片的制作血涂片的顯微檢查是血液細胞學檢查的基本方法，臨床上應(yīng)用極為廣泛，制備厚薄適宜、分布均勻、染色良好的血涂片是血液學檢查的基本技術(shù)之一。(一)操作步驟1.消毒：先按摩取血部位，使血流通暢；再用酒精消毒采血針和