十字花科黑腐病菌一對(duì)假定的雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)基因的功能研究-生物化學(xué)與分子生物學(xué)專(zhuān)業(yè)畢業(yè)論文

缺失突變體DM3067／3068。測(cè)定生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與野生型菌株相缺失突變體DM3067／3068。測(cè)定生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與野生型菌株相比，突變體DM3067、DM3068和DM3067／3068在根本培養(yǎng)基和豐富培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)沒(méi)有變化；致病生化因子檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與野生型菌株相比，突變體DM3067、DM3068和DM3067／3068的胞外多糖、胞外蛋白酶、胞外淀粉酶和胞外纖維素酶和游動(dòng)性等均沒(méi)有顯著差異；抗逆性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與野生型菌株相比，DM3067、DM3068和DM3067／3068耐受蛋白質(zhì)變性劑的能力下降，滲透壓抗性和有機(jī)溶劑抗性沒(méi)有變化；在寄主滿(mǎn)身紅蘿卜的致病性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，與野生型菌株相比，突變體DM3068和DM3067／3068的致病力有顯著變化；在非寄主辣椒上的過(guò)敏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明，與野生型菌株相比，突變體DM3067和DM3068的過(guò)敏反響減弱。DM3067和DM3068的反式互補(bǔ)菌能根本回復(fù)表型至野生型水平，說(shuō)明XC3068與致病性相關(guān)，而XC3067和XC3068與過(guò)敏反響和蛋白質(zhì)變性劑抗性相關(guān)。RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，XC3067和XC3068位于同一轉(zhuǎn)錄單元，很可能組成一個(gè)雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果還說(shuō)明，XC3067和XC3068在MMX的表達(dá)量與在NYGB中的表達(dá)量一致，在MMX條件下中不受hrpG和hrpX調(diào)控。本研究結(jié)果顯示XC3067和XC3068這對(duì)推測(cè)的雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)基因可能與野生型的致病力、過(guò)敏反響和蛋白質(zhì)變性劑抗性相關(guān)。并且XC3067和XC3068位于同一轉(zhuǎn)錄單元，不被M^Ⅸ誘導(dǎo)表達(dá)，不被hrpG和hrpX在MMX培養(yǎng)基條件下調(diào)控。關(guān)鍵詞：十字花科黑腐病菌雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)致病性過(guò)敏反響耐受性V萬(wàn)方數(shù)據(jù)IDENTIFICATIONIDENTIFICATIONOFAPAIR0FHYPOTHETICALTWO·COMPONENTSIGNALTRANSDUCTIONSYSTEMGENESlNXANTHoMoNASCAMPEsTRISPN．cAMPESTRISABSTRACTXanthomonas campestris pv．campestris(Xcc)，belonging to the),-subdivisionoftheproteobacteria，caninfectalmostallmembersofthecruciferfamilyintheworldwide，whichisoneofthemodelorganismsinstudyingplant—pathogeninteractions．Two—componentsignaltransductionsystem(TCSs)isoneoftheimportantsignaltransductionsystemsinbacteria．Typically,thissystemiscomprisedofahistidinekinase(HK)thatreceivestheinputstimuliandaresponseregulator(RR)thateffectsanappropriatechangeincellularphysiology．GenomeanalysisshowedthatXcc8004strainhasatotalof111two-componentsignaltransductionsystemgenes．Therearestillmanygenesfunctionsoftwo—componentsignaltransductionsystemsunclear,includingXC3067andXC3068，whichconsistofapairofhypotheticaltwo—componentsignaltransductionsystemgenes．BioinformaticsanalysisshowedthatXC3068locatedinthegenomenexttoXC3067,has14bpoverlappingwitheachother,atthe5'-endofXC3067andthe3’endofXC3068．Theywerepredictedtobetranscribedinthesamedirection．XC3067wasannotatedtoencodeahistidinekinase／responseregulatorhybridprotein．AndVI萬(wàn)方數(shù)據(jù)XC3068XC3068encodeasensorprotein．Inthepreviousstudy,theTnSgusA5insertioninXC3068geneimpactedonpathogenicity．Inordertostudythebiologicalfunctionsofthetwo．componentsignaltransductionsystemXC3067andXC3068，weconstructedXC3067andXC3068deletionmutantsDM3067，DM3068andthedoublemutantDM3067／3068byusinggeneshomologousdoubleexchange．TheresultsshowedthatthegrowthofDM3067，DM3068andDM3067／3068wereidenticaltothewild—typebothinminimalmedium(MMX)andnutrientmedium0',rVG)．Andtheproductionofextracellularpolysaccharide，extracellularprotease，extracellularamylase，extracellularcelluloseandmotilityofthemutantswerenotinfluenced．InordertostudysensingtheenvironmentsignalinXcc8004，wetestsomestress，includingosmoticpressure，organicsolventandproteindenaturant．Theresultsindicatedthatcomparedwiththewild·type，DM3067，DM3068andDM3067／3068couldonlyaffecttheadaptationtoproteindenaturant，butnotaffectosmoticpressureandorganicsolvent．TheresultofpathogenicitytestinhostplantChineseradishshowedthatthevirulenceofDM3068andDM3067／3068decreased．Hypersensitiveresponsetestinnon-hostpeppershowedthatDM3067，DM3068andDM3067／3068haddecreasedhypersensitiveresponse．ThecomplementationstrainsofDM3067andDM3068canrestorethephenotypestothewild-typestrain．TheresultssuggestthatXC3068mightcontributetothepathogenicityofthewild—typestrain．XC3067andXC3068wererequiredinhypersensitiveresponseandproteindenaturanttoleranceofthewild-typestrain．VII萬(wàn)方數(shù)據(jù)Th,reTh,rereersetrtranscriptio"ptionpopolymerasechaichainreactiI(RT-PCRreaction CRresultsshowedthatXC3067andXC3068werelocatedinthesametranscriptionunit，suggestingthattheyarelikelytoformatwo—componentsignaltransductionsystem．TheRT-PCRresultsalsoshowedthattheexpressionofXC3067andXC3068inMMXmediumweresametothatinNYGmedium．BothhrpGandhrpXcouldnotregulatetheexpressionofXC3067andXC3068inMMXmedium．ThisstudydemonstratedthatXC3068isrequiredforthefullvirulenceofXcc8004．XC3067andXC3068arerelatedtohypersensitiveresponseandproteindenaturingagentresistance．RT-PCRresultsshowedthatXC3067andXC3068werelocatedinthesametranscriptionunit．AndtheexpressionofXC3067andXC3068werenotinducedinMMXmediumandwerenotregulatedbyhrpGandhrpXinMMXmedium．KEYWORDS：Xanthomonascampestrispv．signaltransductionsystem；pathogenicity；hypotheticalresponse；toleranceVIII萬(wàn)方數(shù)據(jù)目 目 錄目 錄 Ⅸ第一章前言 11．1雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的相關(guān)進(jìn)展 11．1．1雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的簡(jiǎn)介與分布 ．11．1．2雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中HKs的功能域 ．．31．1．3雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中RRs的功能域 41．1．4雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的通路 ．51．2十字花科黑腐病菌研究進(jìn)展 71．2．1十字花科黑腐病菌概述 ．71．2．2雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)在8004中的研究進(jìn)展 ．．81．3本研究的主要目的、內(nèi)容和意義 ．111．3．1本研究的主要內(nèi)容 111．3．2本研究的主要目的和意義 11第二章材料與方法 ．122．1材料 ．．122．1．1應(yīng)試植株 122．1．2應(yīng)試菌株 122．2常規(guī)微生物學(xué)操作 ．142．2．1細(xì)菌培養(yǎng)基 142．2．2菌株的培養(yǎng) 152．2．3菌株的保存 152．2．4常用試劑與緩沖液 162．2．5突變體營(yíng)養(yǎng)缺陷型檢測(cè) 182．2．6胞外多糖的檢測(cè) 182．2．7胞外酶的檢測(cè) 182．2．8細(xì)菌游動(dòng)性的檢測(cè) 192．2．9抗逆性的檢測(cè) 192．2．10生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 ．202．3分子生物學(xué)操作技術(shù) ．20TX萬(wàn)方數(shù)據(jù)2．3．1十字花科黑腐病菌基因組DNA提取 2．3．1十字花科黑腐病菌基因組DNA提取 202．3．2細(xì)菌質(zhì)粒的提取 212．3．3DNA的分子生物學(xué)操作 ．212．3．4聚合酶鏈?zhǔn)椒错?PCR) 232．3．5RNA的分子生物學(xué)操作 一252．3．6Southem印記法 272．3．7細(xì)菌的感受態(tài)細(xì)胞制備與轉(zhuǎn)化接合實(shí)驗(yàn) 292．3．8三親本接合實(shí)驗(yàn) 302．3．9缺失突變體的構(gòu)建與互補(bǔ) 302．4植株實(shí)驗(yàn) ．312．4．1致病性實(shí)驗(yàn) 312．4．2過(guò)敏反響實(shí)驗(yàn) 3l第三章結(jié)果與分析 ．333．1生物信息學(xué)分析 ．333．1．1基因XC3067與瑚∞D(zhuǎn)卯的根本特征和結(jié)構(gòu)域分析 ．．333．1．2XC3067與XC3068蛋白質(zhì)序列比對(duì) 353．1．3小結(jié) 373．2缺失突變體的構(gòu)建 ．373．2．1重組質(zhì)粒的構(gòu)建 383．2．2缺失突變體的驗(yàn)證結(jié)果 423．2．3小結(jié) ．473．3反式互補(bǔ)菌株的構(gòu)建 ．473．3．1重組質(zhì)粒的構(gòu)建 473．3．2互補(bǔ)菌株的驗(yàn)證結(jié)果 483．3．3小結(jié) ．493．4突變體的生理生化表型檢測(cè)結(jié)果 ．493．4．1營(yíng)養(yǎng)缺陷性檢測(cè)結(jié)果 493．4．2在MMX和NYG培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)曲線的測(cè)定結(jié)果 ．．503．4．3胞外多糖的檢測(cè)結(jié)果 513．4．4胞外纖維素酶的檢測(cè)結(jié)果 52X萬(wàn)方數(shù)據(jù)3．4．5胞外淀粉酶的檢測(cè)結(jié)果 3．4．5胞外淀粉酶的檢測(cè)結(jié)果 533．4．6胞外蛋白酶的檢測(cè)結(jié)果 543．4．7游動(dòng)性的檢測(cè)結(jié)果 553．4．8脅迫實(shí)驗(yàn)結(jié)果 563．4．9小結(jié) ．583．5植株實(shí)驗(yàn)結(jié)果 ．583．5．1致病力檢測(cè)結(jié)果 583．5．2過(guò)敏性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 593．5．3小結(jié) ．603．6XC3067與XC3068的表達(dá)與調(diào)控關(guān)系 一613．6．1總RNA的提取 613．6．2RNA的消化 ．613．6．3共轉(zhuǎn)錄驗(yàn)證結(jié)果 623．6．4基因間的調(diào)控關(guān)系結(jié)果 633．6．5小結(jié) ．63第四章討論與結(jié)論 ．644．1討{念 ．．644．1．1突變體DM3067與DM3068不是營(yíng)養(yǎng)缺陷型 644．1．2基因XC3067與XC3068不影響8004的生長(zhǎng) 644．1．3基因XC3067與XC3068不影響大多數(shù)致病生化因子 一644．1．4基因XC3067與XC3068影響蛋白質(zhì)變性劑的耐受程度 一654．1．5基因XC3068與致病性相關(guān)，基因XC3067和XC3068與過(guò)敏反響相關(guān)654．1．6基因翔口舾7與．黝0礎(chǔ)位于同一轉(zhuǎn)錄單元，共用一個(gè)啟動(dòng)子 一664．1．7初步判斷基因XC3067與XC3068是一對(duì)雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)基因 一674．2結(jié)論 ．67參考文獻(xiàn) 68致 謝 ．76攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況 78XI萬(wàn)方數(shù)據(jù)第一章第一章弗一早刖 苗1．1雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的相關(guān)進(jìn)展1．1．1雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的簡(jiǎn)介與分布雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(Two-componentsignalregulationsystems，簡(jiǎn)稱(chēng)TCSs)是微生物感受外界刺激的最重要的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)【l】。典型的TCSs由一個(gè)具有特殊細(xì)胞跨膜結(jié)構(gòu)的組氨酸激酶蛋白(histidinekinase，HK)和一個(gè)存在于胞內(nèi)的響應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白(responseregulator，RR)組成【1】。HKs經(jīng)常以雙體形式存在，每個(gè)HK的膜外的感應(yīng)功能域感受不同的外部環(huán)境因子的刺激，通過(guò)與之相連的ATPase功能域利用ATP自磷酸化胞內(nèi)的HisKA功能域保守的組氨酸殘基，隨后將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到胞內(nèi)相對(duì)應(yīng)的響應(yīng)調(diào)控蛋白接收功能域的天冬氨酸殘基，從而改變響應(yīng)調(diào)控蛋白輸出功能域活性，最后激活下游靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄【2，3】。不同的響應(yīng)調(diào)控蛋白含有不同類(lèi)型的調(diào)控功能域[4】，大多數(shù)調(diào)控功能域?qū)儆贖TH(helix．turn．helix)DNA結(jié)合功能域(例如，OmpR、NarL和NtrC家族)，其他類(lèi)型的調(diào)節(jié)功能域包括擁有酶功能的功能域(例如，CheB甲基化酶)[a】，磷酸化的接收功能域通過(guò)改變調(diào)控功能域的活性，繼而通過(guò)結(jié)合目標(biāo)基因的啟動(dòng)子區(qū)調(diào)控轉(zhuǎn)錄以及影響不同的細(xì)胞進(jìn)程，例如，生物膜的形成、蛋白質(zhì)降解、調(diào)節(jié)滲透壓和對(duì)抗生素產(chǎn)生抗性等等【51。除了典型的兩步式磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移外，TCSs還存在更復(fù)雜磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移方式，激活RRs所需要的磷酸基團(tuán)需要經(jīng)過(guò)多步反響才z日‘匕l(fā)-,到達(dá)最終位置[2】。隨著越來(lái)越多的微生物的基因組序列被公布，越來(lái)越多的編碼雙組份系統(tǒng)的基因被注釋?zhuān)欢诓煌奈⑸镏芯幋a雙組份系統(tǒng)的基因的數(shù)目存在很大的差異。HKs在基因組中所占的比例相對(duì)較少，HKs一般占全基因組的0．26％和O．65％之間【1】，一般來(lái)說(shuō)，相比擬寄生微生物來(lái)說(shuō)，非寄生微生物編碼更多的信號(hào)系統(tǒng)【61。在己測(cè)序植物病原細(xì)菌中，Xylellafastidiosa編碼的雙組份系統(tǒng)最少，而Pseudomonassyringae那么擁有最多數(shù)目的雙組份系統(tǒng)基因【71。雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)普遍存在于細(xì)菌界，感受蛋白基因和響應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白基因是兩種重要的基因家族，不同的基因家族中的基因具有很高的同源性[8】。感受蛋白和響應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白都可以通過(guò)基因序列的同源性分析加以鑒別，許多不同種的細(xì)菌感受蛋白與調(diào)節(jié)蛋白數(shù)量相同(圖1．1A)。通過(guò)分析知道雙組份基因的數(shù)量與萬(wàn)方數(shù)據(jù)基因組大小是相關(guān)的，通常情況下，隨著基因組長(zhǎng)度的增加，所包含的雙組份基因數(shù)量基因組大小是相關(guān)的，通常情況下，隨著基因組長(zhǎng)度的增加，所包含的雙組份基因數(shù)量增加(圖1．1B)。此外雙組份基因的多少還與細(xì)菌本身適應(yīng)環(huán)境相關(guān)[8,9,10,11】，細(xì)菌生長(zhǎng)的環(huán)境越單一，危害性因素越少，那么細(xì)菌體內(nèi)的雙組份調(diào)控基因越少。例如，許多細(xì)胞內(nèi)寄生蟲(chóng)或者內(nèi)共生菌只有很少量的信號(hào)通路。相反，如果細(xì)菌抵抗外界變化多端的環(huán)境，那么會(huì)編碼出大量的信號(hào)蛋白，Myxococcusxanthas有136個(gè)組氨酸激酶和127個(gè)響應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白，Nostocpunctifor朋P有160個(gè)組氨酸激酶和98個(gè)響應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白[12】。細(xì)菌基因組含有的雙組份信號(hào)基因與它們所處環(huán)境的波動(dòng)情況有關(guān)系。雖然大多數(shù)革蘭氏陰性菌和藍(lán)藻含有大量的雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)【10,13】，但是在古細(xì)菌和真核生物體內(nèi)雙組份存在的數(shù)量較少，在真核生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的多是雜合激酶和磷酸轉(zhuǎn)移子，這是否與它們選擇性壓力來(lái)抵抗不標(biāo)準(zhǔn)的生活環(huán)境有關(guān)，目前還不清楚。古細(xì)菌和真核生物的雙組份通路被認(rèn)為起源于細(xì)菌【l，10,14]。植物獲得雙組份通路是通過(guò)染色體基因整合了葉綠體內(nèi)的基因而得到的[15】。植物體內(nèi)的雙組份是通過(guò)復(fù)制，組織多樣性和現(xiàn)在所謂的整適宜應(yīng)環(huán)境的變化【16】。雙組份系統(tǒng)還被發(fā)現(xiàn)存在于酵母，絲狀真菌，黏菌，植物體內(nèi)，但是在高級(jí)的真核生物和后生動(dòng)物沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有雙組份基因，包括人類(lèi)也是沒(méi)有雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因[17，18】。在真核生物體內(nèi)，它們需要更長(zhǎng)，更穩(wěn)定的信號(hào)輸出裝置確保細(xì)胞與細(xì)胞之間的聯(lián)系和磷酸轉(zhuǎn)移，基于這樣的原理許多雙組份調(diào)控基因通路在真核生物體內(nèi)是不轉(zhuǎn)錄的，而是用許多細(xì)胞質(zhì)的其它蛋白質(zhì)代替。例如，Saccharomycescerevisiae位于細(xì)胞膜上的Slnl．Ypdl．Sskl的磷酸轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)機(jī)常lJ[19]。生物體內(nèi)的雙組份系統(tǒng)到底起源于哪里?目前尚無(wú)結(jié)論。但是有一條線索顯示組氨酸激酶的遠(yuǎn)古起源與熱激蛋白Hsp90，錯(cuò)配修復(fù)蛋白MutL，II型拓?fù)洚悩?gòu)酶的ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域相關(guān)[20,21]。這種蛋白質(zhì)名叫GHKL亞家族，通常是結(jié)合ATP，在一定條件下可以使ATP水解，這樣就解釋了感受蛋白中的DHp結(jié)構(gòu)域功能。但是到目前為止沒(méi)有發(fā)現(xiàn)響應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白的起源。2萬(wàn)方數(shù)據(jù)4．1404．140粕肭12100 G6舯肌螄∽蜘尺．metallidurans IP，撕uginoSa N·pu槭forme-◆〞℃．crescentus；Rj目bstii’8．thetaiotaomicronm∞cocI岍∞．J．IO．Joo廣c3Z雹0 20 40 60 80 100 120 140 160 180Numberofhistidinekinases圄250 M．xanth盎N．punctiformeG．bemidji譬OSIs．·．C．crescentus ～麓徽瑚s150100 L尺．jostii。．b訾哪～腳￡UO?JIZ0 100020003000400050006000800090000000Totalnumberofproteinsingenome圖1．1細(xì)菌中雙組份信號(hào)基因的多樣性【22】Fig．1一lDiversityoftwo—componentsignalinggenecontentinbacterialgenomesA中的點(diǎn)代表不同生物體內(nèi)的組氨酸激酶和響應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白的數(shù)量。大多數(shù)基因組中組氨酸激酶和響應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白數(shù)量相等，正如典型的雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的一個(gè)激酶對(duì)應(yīng)一個(gè)響應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白，但是也有它們的數(shù)量不是1：l的時(shí)候。B中的點(diǎn)代表雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的數(shù)量與基因組大小的關(guān)系，往往基因組越大，雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的數(shù)量越多。A圖和B圖是基于504個(gè)細(xì)菌基因組繪制【23】。1．1．2雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中HKs的功能域典型的TCSs主要由感受外界環(huán)境刺激的組氨酸激酶感受蛋白(histidinekinase，HK)和執(zhí)行著調(diào)控下游基因表達(dá)的作用的響應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白(responseregulator，RR)組成。nKs經(jīng)常以雙體形式存在，每個(gè)HK的胞外感應(yīng)功能域感受不同的外部環(huán)境因子刺激，通過(guò)與之相連的ATPase功能域利用ATP自磷酸化胞內(nèi)的HisKA功能域保守的組氨酸殘基，隨后將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到胞內(nèi)相對(duì)應(yīng)的響應(yīng)調(diào)控蛋白接收功能域的天冬氨酸殘基，從而改變響應(yīng)調(diào)控蛋白輸出功能域活性，最后激活下游靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄【24】。3萬(wàn)方數(shù)據(jù)組氨酸激酶包括雙體化和磷酸受體(HisKA和HisKA-_2)功能域和HATPase—c功組氨酸激酶包括雙體化和磷酸受體(HisKA和HisKA-_2)功能域和HATPase—c功能域。典型的組氨酸激酶包含兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域：保守的C端(CA)和組氨酸磷酸傳遞結(jié)構(gòu)(Dimerizationandhistidinephosphotransferdomain，簡(jiǎn)稱(chēng)DHp)，又叫作HisKA(圖1．2)。多數(shù)nKs包含多個(gè)感受功能域，如PAS、GAF、HAMP、PAC、HPt和CheA等125]，Hpt(Histidine．containingPhosphotransferdomain)功能域可將磷酸基團(tuán)從一個(gè)接收功能域轉(zhuǎn)到另一個(gè)接收功能域參與到多步磷酸基團(tuán)傳遞鏈當(dāng)中【261，從而形成復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。CheA功能域接收信號(hào)和接受趨化蛋白(methylacceptingchemotaxisprotei‘ns，簡(jiǎn)稱(chēng)MCPs)相互作用繼而影響鞭毛旋轉(zhuǎn)[271。PAS和GAF結(jié)構(gòu)域，它們能感受包括胞內(nèi)氧、一氧化碳、光和中間代謝產(chǎn)物等多種信號(hào)的刺激[28】。PAS功能域一般和PAC功能域直接相連一起形成PAS的3D構(gòu)象，PAS功能域和PAC功能域的分化主要是因?yàn)閮蓚€(gè)功能域連接部位序列的差異【29，30】，有研究說(shuō)明，PAS功能域是EAG-IikeK+通道【3l】。PAS結(jié)構(gòu)域通常相鄰并為于蛋白的N．端【32】，這種結(jié)構(gòu)揭示感受蛋白之間的共同模式：感受蛋白N．末端的輸入功能域如PAS感知的信號(hào)，往往通過(guò)配體結(jié)合或輔助因子的修飾，從而信息傳送到C．端的輸出功能域[331。PAS功能域通常是蛋白質(zhì)相互作用的重要介質(zhì)，例如和孢子形成有關(guān)的激酶KinA和群體感應(yīng)蛋白LuxQ[34，351。PAS功能域也與信號(hào)傳輸和亞細(xì)胞定位有關(guān)，例如，突變植物光敏色素B在N一端PAS結(jié)構(gòu)域?qū)⒆柚构庑盘?hào)的傳遞【36】，而一個(gè)C一端PAS功能域提供一個(gè)核定位信號(hào)1371，PAS功能域在在序列上的相似性比擬低【38】。1．1．3雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中RRs的功能域典型的響應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白根本都有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，一個(gè)是保守的N端(REC)，一個(gè)是磷酸輸出功能域(outputdomain)(圖1．2)。REC功能域催化磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移，并且調(diào)節(jié)輸出功能域的活性，不同的輸出結(jié)構(gòu)域行使不同的調(diào)控功能，引起下游基因不同的響應(yīng)應(yīng)答【391。在己發(fā)現(xiàn)的REC結(jié)構(gòu)域中，有17％的CheYREC存在于原核生物體【40J，大多數(shù)響應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白的輸出結(jié)構(gòu)域含有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA。bindingdomain，簡(jiǎn)稱(chēng)DBD)【4l】。另外還有酶催化結(jié)構(gòu)域，例如，趨化性甲基酯酶CheB，GGDEF二鳥(niǎo)苷環(huán)化酶，HI)．GYP磷酸二酯酶等，這類(lèi)蛋白主要調(diào)控c．di．GMP通路【42】。還含有類(lèi)Hnr調(diào)控因子和6因子的HPt、GAF、RpoS、PAS和cNIV伊功能域【43】。響應(yīng)蛋白的調(diào)控機(jī)理主要是磷酸化使非活性物質(zhì)轉(zhuǎn)化為有活性的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，非磷酸化的NtrC的ATPase處于非活性狀態(tài)，REC結(jié)構(gòu)域接收磷酸基團(tuán)后促進(jìn)ATPase結(jié)構(gòu)域和鄰近的ATPase組萬(wàn)方數(shù)據(jù)合，進(jìn)而處于有活性狀態(tài)【刪。一合，進(jìn)而處于有活性狀態(tài)【刪。一一一一一圖1．2雙組份調(diào)控系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域【22】Fig．1-2Overviewoftwo-componentsignaltransductiondomainTM：跨膜結(jié)構(gòu)域；DHp：組氨酸磷酸傳遞結(jié)構(gòu)域；CA：保守C端結(jié)構(gòu)域；含有不保守結(jié)構(gòu)域(PAS、HAMP、GAF)；RD：接收結(jié)構(gòu)域；DBD：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域；AAA+：AAA+結(jié)構(gòu)域；methyltrans：甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域。1．1．4雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的通路不同的環(huán)境刺激信號(hào)被不同的HKs的感受功能識(shí)別，形成不同的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，同時(shí)控制RRs的磷酸化水平。大局部RRs僅在磷酸化以后起功能才被激活【45】，影響RRs磷酸化狀況的任何外在條件或產(chǎn)物都將影響RRs的生化功能，因而，RRs的磷酸化不僅僅由一個(gè)特殊的HK所決定，同時(shí)一些基因的產(chǎn)物都將會(huì)刺激或者抑制RRs的磷酸化水平。理論上，這些產(chǎn)物可以作用于TCSs磷酸基因傳遞鏈的任何一步，包括nKs的自磷酸化，磷酸基團(tuán)從aKs傳遞到RRs，RRs的去磷酸化以及RRs的輸出功能域活性。雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)磷酸傳遞主要包括經(jīng)典一步傳遞法(圖1-3A)、感受蛋白雜合子傳遞法(圖1-3B)和交叉?zhèn)鬟f法(圖1．4)。磷酸一步傳遞方式是雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)應(yīng)用最廣泛的傳遞方式。組氨酸激酶感受外界信號(hào)后自身組氨酸殘基發(fā)生磷酸化，然后將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到響應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白的RECS萬(wàn)方數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)域Asp殘基上，發(fā)揮調(diào)控下游基因的功能。它是大多數(shù)原核生物主要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，在大腸桿菌誘導(dǎo)ato結(jié)構(gòu)域Asp殘基上，發(fā)揮調(diào)控下游基因的功能。它是大多數(shù)原核生物主要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，在大腸桿菌誘導(dǎo)atoDAEB操縱子表達(dá)的AtoS．AtoC系統(tǒng)屬于該傳導(dǎo)方法146]。感受蛋白雜合子傳遞方式是一些雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，感受外界信號(hào)的組氨酸激酶不僅含有組氨酸激酶殘基His，還含有REC結(jié)構(gòu)域，有的甚至含有多個(gè)REC結(jié)構(gòu)域，磷酸基團(tuán)的傳遞如同“接力〞，在幾個(gè)REC結(jié)構(gòu)域之間依次傳遞【4刀。出現(xiàn)這種傳遞途徑的原因可能有兩方面，第一微弱的外界信號(hào)可以通過(guò)多級(jí)傳遞放大，第二復(fù)雜的雙組份系統(tǒng)提供了多調(diào)控結(jié)合位點(diǎn)【躺】。A ClassicalTwo·ComponentSystemB HybridTwo-ComponentSystem面金寧夕圖1．3經(jīng)典和雜合雙組份系統(tǒng)【481Fig．1-3Schematicdiagramofclassicalandhybridtwo—componentsystems．A：經(jīng)典的雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，包含一個(gè)有跨膜結(jié)構(gòu)域的感受激酶，一個(gè)響應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白；B：雜合雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，感受激酶和響應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白都位于膜上，組氨酸把磷酸基團(tuán)傳遞給自身相連的天冬氨酸殘基。TM：跨膜結(jié)構(gòu)域；DHp：二聚體／組氨酸磷酸傳遞結(jié)構(gòu)域；DBD：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域；AmCI-rrH：maC螺旋．轉(zhuǎn)疊．螺旋DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在研究雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中，有人發(fā)現(xiàn)除了上述兩種信號(hào)傳導(dǎo)通路，還存在著一類(lèi)被稱(chēng)為cross．talk的傳導(dǎo)方式149】。交叉?zhèn)鬟f主要有三種情況：(1)一個(gè)組氨酸激酶對(duì)應(yīng)兩個(gè)或者多個(gè)響應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白，就是所謂的“onetomany〞模式，該模式主要存在于細(xì)菌的趨化性調(diào)節(jié)，例如，CheA接收信號(hào)后把磷酸基團(tuán)傳遞給CheY和CheB[50l。(2)兩個(gè)或者多個(gè)組氨酸激酶?jìng)鬟f磷酸基團(tuán)至同一個(gè)響應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白，就是所謂的“manyto6萬(wàn)方數(shù)據(jù)one〞one〞模式，該模式主要調(diào)節(jié)細(xì)菌的群感效應(yīng)，例如，Vibriharveyi的LuxN／LuxQ／CqsS—LuxU系統(tǒng)【51】。(3)兩對(duì)或者多對(duì)雙組份調(diào)控系統(tǒng)的組氨酸激酶不僅將磷酸基團(tuán)傳遞給自己的響應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白，還傳遞給其它雙組份的響應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白。這種傳遞模式相對(duì)較復(fù)雜，也是細(xì)菌的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要組成局部。例如，大腸桿菌的NarQ-Narp和NarX-NarL屬于此類(lèi)復(fù)雜調(diào)控系統(tǒng)【52】。見(jiàn)圖1—4。@ @l|O．．×掣-=■：；；；；，^，@>一RRl RR2圖1．4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)模式㈣F遠(yuǎn)．1-4Thetwo-componentpathways1．2十字花科黑腐病菌研究進(jìn)展1．2．1十字花科黑腐病菌概述十字花科黑腐病菌(Xanthomonascampestrispv．campestris，簡(jiǎn)稱(chēng)Xcc)是引起十字花科植物(如油菜、甘藍(lán)和蘿卜等經(jīng)濟(jì)作物)黑腐病的病原細(xì)菌【53】，能引起大局部十字花科類(lèi)植物產(chǎn)生黑腐病，給世界上的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)造成重大損失【54】。Xcc是一個(gè)高G+C含量的革蘭氏陰性菌，Xcc整個(gè)侵染植物的過(guò)程一般要經(jīng)歷腐生、到附生、再到內(nèi)生和寄生階段，Xcc遇到寄主植物之前該菌為腐生菌，當(dāng)在環(huán)境中遇到適宜的寄主后，病原菌通過(guò)寄主植物葉表的水孔或著葉緣邊上的傷口浸染植物體，并在植物體內(nèi)快速增殖，菌體會(huì)沿植物的維管束蔓延，形成對(duì)植物的有力致病性感染【5l】。該病原菌引起的典型病癥是在受害十字花科植物葉片部位形成倒三角型黑色病斑，隨著病斑的蔓延，葉脈逐漸變黑，故稱(chēng)之為黑腐病【53】。目前，全世界常用的Xcc菌株是ATCC33913、B100和8004，本研究所用模式菌株為本實(shí)驗(yàn)室參與完成全基因組測(cè)序的菌株Xcc8004，以下簡(jiǎn)稱(chēng)為8004。7萬(wàn)方數(shù)據(jù)廣西大學(xué)碩士學(xué)位論文 廣西大學(xué)碩士學(xué)位論文 十字花科黑腐病菌一對(duì)假定笪墼塑墮堡量整曼壅塾叁固絲墊絲塹室8004的基因組共為5，148，708kb，其中包含著4273個(gè)開(kāi)放閱讀框，每個(gè)開(kāi)放閱讀框的平均長(zhǎng)度為1033bp。此外8004的細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒，只含一條環(huán)狀的染色體，其中的G+C含量為64．94％[551。該菌的致病機(jī)理的調(diào)控成為近些年研究病原菌致病機(jī)理的熱點(diǎn)，主要的致病生化因子包括胞外多糖，脂多糖，胞外酶和III型效應(yīng)物【561。目前認(rèn)為黃單胞菌中的致病系統(tǒng)主要有兩個(gè)，一個(gè)是基于nrpG和HrpX調(diào)控的T3SS效應(yīng)物體系【571，另一個(gè)是受群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控的致病生化因子體系[ss，591。1．2．2雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)在8004中的研究進(jìn)展8004共有111個(gè)雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)基因，55個(gè)感受基因中的30個(gè)與回應(yīng)調(diào)控基因成對(duì)存在，很有可能組成一個(gè)雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，25個(gè)感受基因和26個(gè)回應(yīng)調(diào)控基因獨(dú)立存在于基因組中【刪，另外，3個(gè)HKs和2個(gè)RRs未被注釋。作為研究微生物與寄主相互作用分子機(jī)理的模式菌，8004的致病調(diào)控機(jī)制一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)，我們?nèi)娴姆治隽?004基因組中TCSs蛋白，感受外界環(huán)境因子的變化的過(guò)程中起到直接或間接的關(guān)鍵作用，如此大量的TCSs蛋白是8004適應(yīng)不同環(huán)境和侵染不同的植物所必需的[61—62631。盡管二十多年來(lái)人們己從8004鑒定了近百個(gè)致病相關(guān)基因，但其中只有hpaS／hpaR2、hrpG、rp3℃／G、COIS／R、ravS／R、vemR和．毗K倪俘等幾個(gè)屬于雙組份系統(tǒng)基因，并且它們調(diào)控致病過(guò)程的分子機(jī)制也還遠(yuǎn)沒(méi)有研究清楚。根據(jù)對(duì)十字花科黑腐病菌前期研究可知，hrpG屬于TCS的調(diào)控子OmpR家族成員【64J，是T3SS致病系統(tǒng)的主要調(diào)控子，也rJcc中目前己知的該致病系統(tǒng)的最上游的調(diào)控子【65】。最近相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，hpaS可能通過(guò)激活HrpO，從而調(diào)控T3SS的表達(dá)進(jìn)而影響致病和過(guò)敏反響【52】。r#G／C是8004中研究最多、作用機(jī)理最清楚的TCSs基因，活化狀態(tài)的IⅫfG能降解C—di．GMp[561。研究說(shuō)明RpfC／Rpf系統(tǒng)通過(guò)感受包括DSF在內(nèi)的信號(hào)來(lái)激活下游基因的表達(dá)，同時(shí)RpfC負(fù)調(diào)控DSF的合成157]。DSF／Rpf調(diào)控系統(tǒng)正向調(diào)控胞外酶和胞外多糖的合成【611，而且還負(fù)向調(diào)控細(xì)菌生物膜形成與解聚以及細(xì)胞群體感應(yīng)等【66,67】。RavR／S參與對(duì)低氧脅迫的感受，并調(diào)控耐受相關(guān)基因的表達(dá)。推測(cè)RavR是通過(guò)響應(yīng)群體感應(yīng)系統(tǒng)感受低氧信號(hào)，經(jīng)由全局調(diào)控子Clp來(lái)調(diào)控致病基因的表達(dá)的【681。COIRIS(也稱(chēng)vgrR／S)，在8004菌株中與葉表定殖、抗逆能力、致病力及過(guò)敏性相關(guān)【69】。研究結(jié)果說(shuō)明，colR／S基因與8004的早期侵染有關(guān)[691，并只調(diào)控hrpC和勵(lì)加兩個(gè)hrp操縱子的表達(dá)而不調(diào)控其它hrp操縱子，也不受HrpG,ni-kpX的調(diào)控[691。vemR的編碼產(chǎn)物僅具有REC結(jié)構(gòu)域，在8004菌株中己被證實(shí)與該菌的胞外多糖產(chǎn)量、運(yùn)動(dòng)R萬(wàn)方數(shù)據(jù)性和致病力相關(guān)[601。SreK／SreR／SreS組成的三組分信號(hào)系統(tǒng)的研究說(shuō)明性和致病力相關(guān)[601。SreK／SreR／SreS組成的三組分信號(hào)系統(tǒng)的研究說(shuō)明，SreS參與到SreK／R的磷酸化，并調(diào)控eXcc在鹽離子壓力下的抗逆過(guò)程。去磷酸化的SreR反響調(diào)控sreK／sreR／sreS／hppK操縱子，從而調(diào)控葉酸合成調(diào)控基[]hppK的表達(dá)[70】。GntR家族的研究說(shuō)明，hapRl感受外界信號(hào)后，通過(guò)調(diào)節(jié)hrpG基因的表達(dá)影n(可hrp基因簇的功能，從而影響致病力和過(guò)敏反響【7l】。一般認(rèn)為，HKs和其對(duì)應(yīng)的RRs在基因組上相互靠近并且轉(zhuǎn)錄方向一致，但也有例外，肥2227f配222刪229在基因組上順序排列，XC2227／XC2228轉(zhuǎn)錄方向?yàn)檎蚨鳻C2229轉(zhuǎn)錄方向?yàn)榉聪颉?2】，其在Xanthomonasoryzaepv．oryzae中的同源基因分別為PXO01020／PXO01019／PXO01018，其中PXO01020／PXO01019轉(zhuǎn)錄方向一致而尸如01018那么與它們相反。在Xanthomonascampestrispv．campestris中RavS(XC2227)／RavR(XC2228)組成一個(gè)TCS[681，而在Xanthomonasoryzaepv．oryzae中，PdeK(PXO01018)／PdeR(PxO01019)組成的一個(gè)TCSs通過(guò)調(diào)節(jié)c．di．GMP的濃度調(diào)節(jié)的致病性[73】。這種不同微生物間HKs和RRs組合的多樣性也為我們研究TCSs的信號(hào)途徑進(jìn)化現(xiàn)象的可能機(jī)制提供了新的思路。8004中存在大量的HKs和RRs說(shuō)明，TCSs在8004適應(yīng)不同的寄主植物和非寄主植物環(huán)境中起著重要的調(diào)控作用。特別需要關(guān)注的是在8004的基因組中存在大量的不成對(duì)的HKs和RRs，稱(chēng)為“孤兒〞HKs和RRs。這些“孤兒〞HKs和RRs為8004感受不同的環(huán)境并作出反響提供了更多可能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。利用遺傳和生化研究的方法將有助于在分子水平上探索某些TCS蛋白質(zhì)介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如TCSs基因缺失突變體的構(gòu)建和分析，以確定HKs的感受信號(hào)和每個(gè)系統(tǒng)中RR的靶基因。此外，這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路解開(kāi)也為防治8004病害提供了新的策略。在8004的55個(gè)HKs中，有23個(gè)HKs存在最少1個(gè)，最多12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，30對(duì)TCSs中的19個(gè)HKs具有跨膜結(jié)構(gòu)域，說(shuō)明其感受功能域能夠監(jiān)測(cè)到外界環(huán)境的變化。而26個(gè)“孤兒〞HKs中只有4個(gè)HKs具有跨膜結(jié)構(gòu)域，其中XC4167編碼的HyHKs具有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，其功能目前還不清楚。HKs具有跨膜結(jié)構(gòu)域的19對(duì)TCSs中，其RRs的輸出功能域?qū)儆贒NA結(jié)合功能域以及酶。沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)域的HKs一般被認(rèn)為不能感受胞外信號(hào)，例女1]CheA、NtrB、KinA、KinB和KinC等[74】，但在其N(xiāo)端，大局部具有胞內(nèi)感受功能域，!／I]PAS和GAF，說(shuō)明它們能感受包括胞內(nèi)氧、一氧化碳、光和中間代謝產(chǎn)物等多種信號(hào)的刺激【74】，并且多數(shù)HKs包含多個(gè)感受功能域，見(jiàn)圖1．5。8004的RRs功能域的組合區(qū)別十分大，根據(jù)RRs的功能域分析可把它們劃分到不9萬(wàn)方數(shù)據(jù)同的類(lèi)另Ut7sl，典型的RRs的功能域一般包括N．端的一個(gè)接收功能域REC以及C．端的一個(gè)輸出功能域，該輸出功能域包括DNA結(jié)合功能域(OmpR、NarL、NtrC和LytTR)，同的類(lèi)另Ut7sl，典型的RRs的功能域一般包括N．端的一個(gè)接收功能域REC以及C．端的一個(gè)輸出功能域，該輸出功能域包括DNA結(jié)合功能域(OmpR、NarL、NtrC和LytTR)，RNA結(jié)合功能域ANTAR【76]，酶功能域(CheB、GGDEF、EAL和HDc)。27個(gè)RRs具有DNA結(jié)合功能域，10個(gè)RRs具有酶功能域，1個(gè)RRs具有RNA結(jié)合功能域，16個(gè)RRs只具有一個(gè)REC結(jié)構(gòu)域，該類(lèi)RRs被認(rèn)為和蛋白質(zhì)發(fā)生作用【77】。在8004的RRs中除了XC2233(包含CheW功能域)和XC2965(包含Hpt功能域)外，其他RRs沒(méi)有與蛋白質(zhì)或配體結(jié)合的輸出功能域(CheW、PAS和GAF等)，這些蛋白質(zhì)結(jié)合功能域一般在HKs中編碼。Conservedcorestructure HKtypeTypelA0aytnid)TypeIB善詈一 TypeIC孵對(duì)一 0aybria)TypeIBTypeIDTypell叵)司<亟≥七亙?nèi)齥套㈣T)t圮II(a一甌＼鯉川竺鱉I TypelT!TypeIVTypeV圖1．58004基因組中HK的保守結(jié)構(gòu)域Fig．1-5TheconservedstructuresofilKtypesat8004genomelO萬(wàn)方數(shù)據(jù)1．3本研究的主要目的、內(nèi)容和意義1．3．1本研究的主要內(nèi)容1．3本研究的主要目的、內(nèi)容和意義1．3．1本研究的主要內(nèi)容8004共有111個(gè)雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)基因，目前仍有很多雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)基因的功能還不清楚，包括XC3067和XC3068這對(duì)推測(cè)的雙組份信號(hào)調(diào)控系統(tǒng)基因。根據(jù)前期突變體庫(kù)篩選結(jié)果，本研究結(jié)合生物信息學(xué)分析，確定了要研究的目的基因一一8004基因組中的一對(duì)假定雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因XC3067與XC3068。首先，采用同源雙交換策略分別構(gòu)建XC3067與XC3068的缺失突變體DM3067與DM3068，及雙缺失突變體DM3067／3068，對(duì)突變體進(jìn)行根本的生理生化表型檢測(cè)、抗逆性檢測(cè)、致病性檢測(cè)和過(guò)敏反響檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)突變體與野生型在抗蛋白質(zhì)變性劑，致病力和HR反響有差異，因此構(gòu)建突變體的反式互補(bǔ)菌株。RT-PCR分析了基因XC3067與XC3068的表達(dá)調(diào)控關(guān)系。1．3．2本研究的主要目的和意義雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是病原菌感受外界環(huán)境變化并作出反響的最重要的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，但是目前對(duì)8004雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)基因功能的研究還比擬少，具體的作用和調(diào)控機(jī)制還不清楚。本研究將通過(guò)研究XC3067與XC3068這對(duì)假定雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)基因的調(diào)控機(jī)制，對(duì)深入了解XC3067與XC3068在病原菌信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和致病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的作用都具有重要意義。萬(wàn)方數(shù)據(jù)第二章材料與方法2．1材料第二章材料與方法2．1材料2．1．1應(yīng)試植株本研究用到的植物材料，如表2．1所示：表2．1本研究所用植物Table2—1Plantsusedinthisstudy本研究所用到的植物有滿(mǎn)身紅蘿卜苗和ECW-10R辣椒苗。滿(mǎn)身紅蘿b苗：滿(mǎn)身紅蘿b的種子發(fā)芽后種植在塑料盆中，在溫室培養(yǎng)一個(gè)月左右到達(dá)4．5葉齡期，用于黃單胞菌致病性實(shí)驗(yàn)。ECW-10R辣椒苗：辣椒的種子發(fā)芽后種植在小盆中，在溫室培養(yǎng)2．3個(gè)月到達(dá)6葉齡期，用于黃單胞菌過(guò)敏反響實(shí)驗(yàn)。2．1．2應(yīng)試菌株本研究需要用到的菌株和質(zhì)粒，見(jiàn)表2．2。12萬(wàn)方數(shù)據(jù)表2．2本研究用到的菌株和質(zhì)粒Table表2．2本研究用到的菌株和質(zhì)粒Table2-2Strainsandplasmidsinthisstudy菌株與質(zhì)粒 性質(zhì) 源于ECOliDH5relA1△(1ac-proAB)F’【lacD，lacZAM15】 本實(shí)驗(yàn)室ED8767 RecA56，metB，hsdS，supE，supF,含有pRK2073，Spc’本實(shí)驗(yàn)室DH5a中含有pKD3067重組質(zhì)粒 本研究DH5Ⅱ／pKD3067DH50【／pKD3068 DH50t中含有pKD3068重組質(zhì)粒 本研究DH50．／DKD3067／3068 DH5ct中含有pKD3067／3068重組質(zhì)粒 本研究DH5d／pLC3067 DH50t中含有pLC3067重組質(zhì)粒 本研究DH5僅／DLC3068 DH5a中含有pLC3068重組質(zhì)粒 本研究Xccstrains8004 野油菜黃單胞菌野油菜致病變種，Rif 本實(shí)驗(yàn)室DM3067 8004中XC3067的缺失突變體，Rif 本研究DM3068 8004中．配3D鉀的缺失突變體，Rig 本研究DM3067／3068 8004中XC3067與XC3068的缺失突變體，Rif 本研究C3067 突變體DM3067中轉(zhuǎn)入pL3067質(zhì)粒，R．if，Tcr 本研究C3068 突變體DM3068中轉(zhuǎn)入pL3068質(zhì)粒，Rif，W 本研究PlasmidspLAFR3 廣宿主接合轉(zhuǎn)移載體，Tc‘ 本實(shí)驗(yàn)室pRK2073 幫助質(zhì)粒，Tra+，Mob+，CoiEI，Spc‘ 本實(shí)驗(yàn)室pKl8mobXcc中自殺式質(zhì)粒，Kan。本實(shí)驗(yàn)室pK18mobsacBpKl8mob上連有一段sacB基因，Kan‘本實(shí)驗(yàn)室pKD3067XC3067基因的左臂和右臂連接到pKl8mobsacB質(zhì)本研究粒上，KanrpKD3068 XC3068基因的左臂和右臂連接到pKl8mobsacB質(zhì)本研究粒上，KanrpKD3067／3068 XC3067與XC3068基因大片段的左臂和右臂連接到 本研究pKl8mobsacB質(zhì)粒上，Kan‘pL3067 XC3067整個(gè)ORF序列連接到pLAFR3質(zhì)粒上，W本研究pL3068 XC3068整個(gè)ORF序列連接到pLAFR3質(zhì)粒上，Tcr本研究13萬(wàn)方數(shù)據(jù)2．2常規(guī)微生物學(xué)操作2．2．1細(xì)菌培養(yǎng)基2．2常規(guī)微生物學(xué)操作2．2．1細(xì)菌培養(yǎng)基本研究所要用到的培養(yǎng)基都是需要用去離子水配制，并且用滅菌鍋進(jìn)行濕熱滅菌，方可使用。一般培養(yǎng)基可在121℃，101KPa，條件下滅菌15．20min；MMX，SOC等培養(yǎng)基在115。C條件下滅菌15min。2．2．1．1培養(yǎng)黃單胞菌的豐富培養(yǎng)基NYGB：其中1000mLNYGB培養(yǎng)基中的成分：Peptone 5．0gYeastextract 3．0gGlycerol 20．0g去離子水定容到1000mL，pH調(diào)至7．0。NYGA：按照NYGB培養(yǎng)基中含有1％(W／V)的量參加瓊脂粉。2．2．1．2培養(yǎng)黃單胞菌的誘導(dǎo)培養(yǎng)基MMX：每1000mL液體MMX培養(yǎng)基中的成分如下，Glucose 5．0gNa3C6H507 1．0g(NH4)2504 2．0gK2HP04 4．0gKH2P04 6．0gMgS04‘7H20 0．2g去離子水定容至1000mL，pH調(diào)至7．02．2．1．3大腸桿菌培養(yǎng)基LB：每1000mLLB培養(yǎng)基中的成分如下，Yeastextract 5．0gTrytone 10．0gNaCl 10．0g14萬(wàn)方數(shù)據(jù)亡亙盔堂塑±堂垡鯊塞 亡亙盔堂塑±堂垡鯊塞 ±皇煎登墨煎煎墮=壁堡墨絲壑絲墮垡量蕉曼丕絲叁墾塑盟絲塑塞加水定容至1000mL，pH調(diào)至7．0。LA：LB培養(yǎng)基按照1％(WⅣ)的量參加瓊脂。SOC：培養(yǎng)感受態(tài)的大腸桿菌的液體培養(yǎng)基，每1000mLLB培養(yǎng)基中所含成分如下：Trytone 10．0gYeastextract 5．0gNaCl 10．0gGlucose 4．0gMgS04‘7H20 2．5gMgCl2’7H20 2．03g加水定容至1000mL，pH調(diào)至7．0。2．2．2菌株的培養(yǎng)2．2．2．1細(xì)菌的活化從．80℃冰箱取出待活化菌株迅速置于冰盒上，在超凈臺(tái)內(nèi)用滅菌的牙簽挑取少量冰渣放在提前準(zhǔn)備的培養(yǎng)基平板上，在超凈臺(tái)中靜止晾干，倒置培養(yǎng)在適宜溫度的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)1．2天。2．2．2．2大腸桿菌的培養(yǎng)固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)：把菌種接種在LA培養(yǎng)基上，在37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)平板倒置，靜置12—16小時(shí)；液體培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)：把菌種接種在LB液體培養(yǎng)基中，于37"C，200rpm搖床內(nèi)培養(yǎng)12．16小時(shí)。2．2．2．3黃單胞菌的培養(yǎng)固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)：把菌種接種在NYGA培養(yǎng)基上，在28。C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)平板倒置，靜置16．24小時(shí)；液體培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)：把菌種接種在NYGB液體培養(yǎng)基中，于28。C，200rpm搖床內(nèi)培養(yǎng)18．24小時(shí)。2．2．3菌株的保存用微量移液器取7509l新鮮過(guò)夜培養(yǎng)的菌液于滅菌的Eppendorf(EP)管內(nèi)，再加入7509l無(wú)菌的50％甘油，將兩者充分混勻，可以根據(jù)后期使用量選擇保存一管或者多萬(wàn)方數(shù)據(jù)管，放置在．80。C冰箱長(zhǎng)期保存或者放置在．20。C冰箱可以保存半年。2．2．4常用試劑與緩沖液管，放置在．80。C冰箱長(zhǎng)期保存或者放置在．20。C冰箱可以保存半年。2．2．4常用試劑與緩沖液本研究經(jīng)常用到的抗生素見(jiàn)表2．3。表2—3抗生素濃度表Table2-3Theantibioticusedinthisstudy注：抗生素在液體培養(yǎng)基內(nèi)的使用濃度為在固體培養(yǎng)基的一半?？股氐臏缇话阌眠^(guò)濾法除菌。下面的所有試劑均使用超純水配制，局部溶劑需要經(jīng)過(guò)高壓濕熱滅菌(1．0MPa，20min)后使用。有些試劑不能滅菌(如NaOH、SDS、HCl、IPTG、酚類(lèi)、氯仿和冰乙酸等)。有些試劑易炭化變黃，需采用減壓滅菌(115℃，15min)，或著是過(guò)濾除菌(如葡萄糖溶液)。常用溶液與緩沖液如下：16萬(wàn)方數(shù)據(jù)試劑： 試劑： 終濃度(或需要量)：(1)SolutionIGlucose 10mMEDTA(pH8．0) 25mMTris-HCI(pH8．01 10mM(2)SolutionIISDS l％NaOH 0．2M(3)SolutionIIIKAc(PH4．8) 3M(4)LysisBufferTris-Ac(pH7．8、 40mMNaAc 20mMEDTA 1mMSDS 1％(W／V、(5)10×TBE"Iris 108g／1000mLBoricacid 55g／1000mLEDTA(O．5M，pH8．0) 40mL／1000mL(6)電泳上樣緩沖液Ficoll(聚蔗糖) 15％(WⅣ)溴酚藍(lán) 0．1％(WⅣ)EDTA(pH8．0) 40mM(7)NaCI溶液 5M(8)50％甘油溶液 50％(V／V)(9)lO％甘油溶液 lO％(V～)(10)CuS04 500inM(11)葡萄糖溶液 20％(12)脫脂牛奶 10％(13)可溶性淀粉 10％(14)CMC 10％(15)20×SSC(1000m1)檸檬酸 88．23g氯化鈉 175．329(16)馬來(lái)酸buffer(1000ml，pH7．5)馬來(lái)酸 11．61g氯化鈉 8．775g(17)檢測(cè)液(1000ml，pH9．5)Tris 12．1g氯化鈉 5．85g萬(wàn)方數(shù)據(jù)2．2．5突變體營(yíng)養(yǎng)缺陷型檢測(cè)在2．2．5突變體營(yíng)養(yǎng)缺陷型檢測(cè)在根本培養(yǎng)基(MMX)平板上檢測(cè)。取培養(yǎng)過(guò)夜的新鮮菌液，離心收集菌體，用MMX培養(yǎng)基重懸，紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD600，用不加抗生素的MMX液體培養(yǎng)基統(tǒng)一調(diào)至OD600=0．1，用微量移液器吸取2uL菌液點(diǎn)在不含抗生素的MMX固體培養(yǎng)基平板上，在28。C恒溫培養(yǎng)箱靜止倒置二到三天，根據(jù)菌落直徑大小和形態(tài)比擬，以8004為對(duì)照，觀察菌株在MMX固體培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)情況是否不同，實(shí)驗(yàn)需重復(fù)三次。2．2．6胞外多糖的檢測(cè)接種待檢測(cè)的菌體于小白蓋瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)，小白蓋瓶?jī)?nèi)提前裝入NYGB培養(yǎng)基，并加入抗生素，小白蓋瓶固定在28℃，200rpm搖床過(guò)夜，再將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液用紫外分光光度計(jì)測(cè)定ODs00，通過(guò)計(jì)算，用無(wú)抗生素的培養(yǎng)基調(diào)為OD600=0．1，用微量移液器取2此菌液點(diǎn)在不含抗生素，含有2％(WⅣ)葡萄糖，不含抗生素的NYGA平板上，超凈臺(tái)內(nèi)待菌液晾干，倒置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h觀察，觀察菌落的形態(tài)，并且測(cè)量菌落的直徑。2．2．7胞外酶的檢測(cè)2．2．7．1胞外蛋白酶的檢測(cè)接種待檢測(cè)的菌體于小白蓋瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)，小白蓋瓶?jī)?nèi)提前裝入NYGB培養(yǎng)基，并加入抗生素，小白蓋瓶固定在28。C，200rpm搖床過(guò)夜，再將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD600，通過(guò)計(jì)算，用無(wú)抗生素的培養(yǎng)基調(diào)為OD600=0．1，用移液器吸取2此菌液接種于含1％(WⅣ)的脫脂牛奶，不含抗生素的NYGA平板上，超凈臺(tái)內(nèi)待菌液晾干，在28。C恒溫箱內(nèi)靜置二天，根據(jù)水解圈的有無(wú)或者大小來(lái)判斷胞外蛋白酶產(chǎn)生情況，并且測(cè)量水解圈的直徑(H)和菌落直徑(C)，根據(jù)相對(duì)酶活力計(jì)算公式：相對(duì)酶活力=(H2．C2)／tC2。2．2．7．2胞外淀粉酶的檢測(cè)接種待檢測(cè)的菌體于小白蓋瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)，小白蓋瓶?jī)?nèi)提前裝入NYGB培養(yǎng)基，并加入抗生素，小白蓋瓶固定在28。C，200rpm搖床過(guò)夜，再將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD600，通過(guò)計(jì)算，用無(wú)抗生素的培養(yǎng)基調(diào)為OD600=0．1，用移液器吸取2此萬(wàn)方數(shù)據(jù)菌液點(diǎn)在含0．1％(W～)可溶性淀粉，不含抗生素的NYGA平板上，超凈臺(tái)內(nèi)待菌液菌液點(diǎn)在含0．1％(W～)可溶性淀粉，不含抗生素的NYGA平板上，超凈臺(tái)內(nèi)待菌液晾干，倒置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，用1：100的12／Ⅺ(O．08M12，3．2MKI)溶液染色20min，用自來(lái)水沖掉多余染液，立即用75％的酒精脫色平板，用吸水紙吸掉多余酒精脫色液，根據(jù)水解圈的有無(wú)或者大小來(lái)判斷胞外淀粉酶的產(chǎn)生情況，用尺子精確測(cè)量水解圈的直徑。2．2．7．3胞外纖維素酶的檢測(cè)接種待檢測(cè)的菌體于小白蓋瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)，小白蓋瓶?jī)?nèi)提前裝入NYGB培養(yǎng)基，并加入抗生素，小白蓋瓶固定在28。C，200rpm搖床過(guò)夜，再將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD600，通過(guò)計(jì)算，用無(wú)抗生素的培養(yǎng)基調(diào)為OD600=0．1，用移液器吸取2此菌液點(diǎn)在含0．5％(W／V)的羧甲基纖維素，不含抗生素的NYGA平板上，置于超凈臺(tái)待菌液晾干。在28℃恒溫箱內(nèi)靜置一天，用0．1％的剛果紅溶液染平板約30min，再用1M的NaCl溶液洗脫兩次，每次用時(shí)約20分鐘左右。根據(jù)水解圈的有無(wú)或者直徑大小來(lái)判定纖維素酶的產(chǎn)生情況。用尺子精確測(cè)量水解圈的直徑。2．2．8細(xì)菌游動(dòng)性的檢測(cè)接種待檢測(cè)的菌體于小白蓋瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)，小白蓋瓶?jī)?nèi)提前裝入NYGB培養(yǎng)基，并加入抗生素，小白蓋瓶固定在28℃，200rpm搖床過(guò)夜，再將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液用紫外分光光度計(jì)測(cè)定00600，通過(guò)計(jì)算，用無(wú)抗生素的培養(yǎng)基調(diào)為OD600=0．1，用移液器吸取2止菌液點(diǎn)在含有0．3％(W～)的瓊脂，不含抗生素的NYGA平板上，在超凈臺(tái)中靜置培養(yǎng)72h，黃單胞菌的鞭毛組織可以使細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，鞭毛運(yùn)動(dòng)的速度與致病力強(qiáng)弱也是相關(guān)的[，s】，也是重要的致病因子，培養(yǎng)三天后觀察菌落的大小，并且測(cè)量菌落的直徑。2．2．9抗逆性的檢測(cè)接種待檢測(cè)的菌體于小白蓋瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)，小白蓋瓶?jī)?nèi)提前裝入NYGB培養(yǎng)基，并加入抗生素，小白蓋瓶固定在28。C，200rpm搖床過(guò)夜，再將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD600，通過(guò)計(jì)算，用無(wú)抗生素的培養(yǎng)基調(diào)為OD600=0．1，用移液器吸取2“1菌液接種在不含抗生素，分別點(diǎn)至含有不同濃度的檢測(cè)滲透壓的NaClNYGA板，檢測(cè)有機(jī)溶劑的酚NYGA平板上和檢測(cè)蛋白質(zhì)變性劑SDSNGYA平板上，28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天后觀察菌落生長(zhǎng)情況。以抗逆因子的最低抑菌濃度表示，觀察菌落的生長(zhǎng)差異萬(wàn)方數(shù)據(jù)情況。2．2．10生長(zhǎng)曲線的測(cè)定情況。2．2．10生長(zhǎng)曲線的測(cè)定2．2．10．1根本培養(yǎng)基(MMX)中生長(zhǎng)曲線的測(cè)定接種待檢測(cè)的菌體于小白蓋瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)，小白蓋瓶?jī)?nèi)提前裝入NYGB培養(yǎng)基，并加入抗生素，小白蓋瓶固定在28。C，200rpm搖床過(guò)夜，再將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD600，離心收集菌體，用MMX培養(yǎng)基調(diào)整菌體濃度為OD600=1．0，按起始濃度為OD600=0．1轉(zhuǎn)接到100ml的MMX培養(yǎng)基，放入28。C，200rpm搖床培養(yǎng)，隔8h取2mL菌液測(cè)定OD600值，到細(xì)菌生長(zhǎng)的平臺(tái)期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。記錄菌液OD600值，繪制生長(zhǎng)曲線。2．2．10．2豐富培養(yǎng)基(NYGB)中生長(zhǎng)曲線的測(cè)定將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD600，離心收集菌體，用MMX培養(yǎng)基調(diào)整菌體濃度為OD600=1．0，按起始濃度為OD600=0．1轉(zhuǎn)接到100ml的MMX培養(yǎng)基，放入28。C，200rpm搖床培養(yǎng)，每4h取2mL菌液測(cè)定OD600值，到細(xì)菌生長(zhǎng)的平臺(tái)期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。記錄菌液OD600值，繪制生長(zhǎng)曲線。2．3分子生物學(xué)操作技術(shù)2．3．1十字花科黑腐病菌基因組DNA提取(1)取過(guò)夜培養(yǎng)的8004菌液1～1．5mL參加到離心管中；(2)10000rpm離心30s-1min，棄去上清液，收集菌體；(3)加600此裂解緩沖液，用微量移液器快速輕柔地吹打混勻；(4)加300gL5MNaCI，上下顛倒，使溶液充分混勻，12000rpm，室溫離心15min；(5)吸取750p1上清液到一個(gè)新的EP管，參加等體積酚／氯仿溶液，顛倒混勻，12000rpm，4。C離心10min，溶液分層，吸取600“1上層澄清溶液至新的離心管；(6)重復(fù)(5)步驟一次，吸取400gl上層溶液至新的離心管。(7)參加兩倍體積無(wú)水乙醇，冰上靜止30分鐘以上，12，000rpm離心15min，棄上清液；萬(wàn)方數(shù)據(jù)(8)DNA沉淀用75％7,醇洗兩次，室溫靜置枯燥(8)DNA沉淀用75％7,醇洗兩次，室溫靜置枯燥，溶于50此1×TE中，電泳檢測(cè)后，．20。C冰箱保存?zhèn)溆谩?．3．2細(xì)菌質(zhì)粒的提取(1)取過(guò)夜培養(yǎng)的8004菌液1～1．5mL參加到離心管中；(2)10，000rpm離心30s-1min，棄去上清液，收集菌體；(3)參加150gL溶液I，混勻；(4)參加300laL溶液II，輕輕顛倒混勻，室溫靜置不超過(guò)5min；(5)參加150此預(yù)冷的溶液III，混勻，室溫靜置10rain；(6)12，000rpm，4"C，離心10min；(7)吸取500gL上清液至新的無(wú)菌離心管，參加等體積苯酚／氯仿溶液，12，000rpm離心10min；(8)吸取400gL上清液到新的無(wú)菌離心管，參加等體積氯仿，12，000rpm離心10min；(9)吸取300gL上清液到新的無(wú)菌離心管，參加兩倍體積的無(wú)水乙醇，冰上放置30min以上；(10)12，000rpm，15min；(11)用75％的乙醇洗DNA沉淀兩遍，室溫靜置枯燥后溶于30—50gLI×TE或ddH20；(12)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后保存于．20"C冰箱。2．3．3DNA的分子生物學(xué)操作2．3．3．1DNA的純化本研究用到的純化DNA的方法有試劑盒純化法和酚／氯仿提取法。PCR產(chǎn)物與酶切產(chǎn)物通?？梢杂梅樱确绿崛》?，向DNA溶液中參加相同體積的酚／氯仿溶液，12000rpm，4。C離心15min，取上層清液參加新的離心管中，然后參加兩倍體積的無(wú)水乙醇，冰上放置30min以上，離心15min后棄去上清液，用75％的乙醇洗DNA沉淀兩遍，倒扣吸水紙上，盡量去除75％7,醇液體，室溫下晾干，將沉淀溶于50gLddH20，保存在．20。C冰箱。萬(wàn)方數(shù)據(jù)需要膠回收的DNA片段，通常使用DNA膠回收純化試劑盒，具體步驟參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。需要膠回收的DNA片段，通常使用DNA膠回收純化試劑盒，具體步驟參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。2．3．3．2DNA的酶切DNA的酶切反響選用的內(nèi)切酶為Promega公司的，根據(jù)相應(yīng)的酶切緩中液，反響體積一般為20～100“L，通常酶的效力為1u的酶可以完全酶切1pg的DNA，質(zhì)粒一般在37。C條件下酶切4-6小時(shí)，總DNA一般在37。C條件下酶切過(guò)夜，再在65。C水浴15分鐘或苯酚／氯仿抽提終止酶切反響。在離心管中依次參加以下試劑：DNA片段 10此酶切buffer 5“LBSA 0．5UL限制性?xún)?nèi)切酶 0．5止ddH20定容 50uL2．3．3．3DNA的連接連接反響體積一般為5～20此，載體與外源的DNA分子數(shù)之比為1：3至1：6，反響體系的DNA通常為100-20塑高甏掣×黼Ⅱ警)=插入片斷(餾ng。對(duì)于不同的長(zhǎng)度的質(zhì)粒于外源，可根據(jù)公式：載體的大小(肋) 1 。I 載體 J ～V’6(1)在離心管中依次參加以下試劑：載體 100ng外源片段 17ng10×Buffer 1“LT4DNA連接酶 O．1～1兒加ddH20至終體積 10此(2)室溫下連接1．3h或4℃連接過(guò)夜。(3)轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞，檢測(cè)連接反響效率。2．3．3．4DNA的電泳(1)凝膠的制備：檢測(cè)不同大小的DNA片段，采用不同濃度的凝膠，一般DNA22萬(wàn)方數(shù)據(jù)片段越小，所需的瓊脂濃度越大(見(jiàn)表2．4)。先做好制膠模具，在天平上稱(chēng)取適量瓊片段越小，所需的瓊脂濃度越大(見(jiàn)表2．4)。先做好制膠模具，在天平上稱(chēng)取適量瓊脂糖，參加100mL0．5xTBE緩沖液，微波爐加熱2min左右，冷卻至適宜的溫度，倒入制膠盒中，冷卻約30min左右，從兩側(cè)輕輕地拔出樣孔梳，假設(shè)不及時(shí)用先將膠放如O．5xTBE的盛膠盒，假設(shè)及時(shí)用可以把凝膠放入電泳槽。表2．4凝膠的制備條件Table2．4Thegelconcentrationusedinthisstu#瓊脂糖凝膠濃度(％)DNA分子的別離范圍(kb)0．3 5．600．6 1．200．7 O．8．100．9 O．5—71．2 0．4．61．5 O．2．3(2)上樣電泳：將與上樣緩沖液混合后的DNA樣品參加加樣孔中，100V，電泳約30min，停止電泳。(3)凝膠成像：用伯樂(lè)凝膠成像系統(tǒng)觀察、照相。2_3．3．5DNA的測(cè)序提取待測(cè)菌株質(zhì)粒，質(zhì)粒質(zhì)量、濃度要到達(dá)生物公司測(cè)序要求，質(zhì)?？梢匀苡赿dH20中，送去上海生物工程有限責(zé)任公司商業(yè)測(cè)序。培養(yǎng)基中參加適量的抗生素，接種待檢測(cè)菌體，過(guò)夜培養(yǎng)，取新鮮菌液，參加等體積的50％甘油，混勻，送測(cè)序公司測(cè)序。2．3．4聚合酶鏈?zhǔn)椒错?PCR)2．3．4．1引物的制備本研究主要是用VectorNTI10．0軟件設(shè)計(jì)引物，引物長(zhǎng)度通常為18bp-一30bp，引物的退火溫度一般在60℃左右。引物的特異性要高。根據(jù)需要可以在引物的5’端添加限制性酶切位點(diǎn)序列和保護(hù)堿基序列。引物序列送至生物公司合成，用滅菌超純水將引物溶解為101．tM的濃度，．20。C冰箱存放備用。本研究所使用的引物見(jiàn)表2．5。23萬(wàn)方數(shù)據(jù)表2．5本工作使用的引物Table表2．5本工作使用的引物Table2-5Primersusedinthisstudy注：斜體表示限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)。2．3．4．2PCR反響PCR反響體系(20¨L)：24萬(wàn)方數(shù)據(jù)110xBuffer 2rtLdNTP(2．5mM) 21．tLPrimer-F(10gM) 0．5laLPrimer-R(10gM) 0．5gLTaq聚合酶 0．5gLddH20 13．5gLDNA模板 1¨L反響總體積 20ULPCR反響條件為：PCR反響一般由變性，退火，延伸構(gòu)成一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。步驟l 95℃ 5min／15min步驟2 }7 95℃ 30S55～65℃ 30S72℃ 30s~5min循環(huán)30～35次步驟3 72℃ 10min步驟4 4℃ 59min2．3．5RNA的分子生物學(xué)操作2．3．5．1細(xì)菌總RNA的提取本研究提取8004的總RNA使用的是SVtotalRNAIsolationSystemKit試劑盒，操作流程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。具體操作步驟如下：(1)取1mL的新鮮菌液(OD600=0．6)，13，000rpm，離心1min，徹底棄去上清；(2)參加100laL無(wú)核酶水重懸菌體，參加1“L新鮮配制的溶菌酶(40mg／m1)，輕柔地混勻，室溫放置3．5min；(3)參加75gLBufferRLA(RLA)；(4)參加350gLBufferRDA，顛倒混勻；(5)參加200gL95％乙醇到裂解液中，用移液器吸打3．4次混勻，將混合液轉(zhuǎn)移到吸附柱內(nèi)，12，000rpm離心1min；25萬(wàn)方數(shù)據(jù)(6)倒掉收集管內(nèi)濾液，將吸附柱放回收集管內(nèi)。加600(6)倒掉收集管內(nèi)濾液，將吸附柱放回收集管內(nèi)。加600gLBufferRWA到吸附柱中，12，000rpm離心1min；(7)倒掉收集管內(nèi)濾液，將吸附柱放回收集管內(nèi)，將50¨L新鮮配制的DNase混合液(40gLYellowCoreBuffer，5uL0．09MMnCl2，5gLDNaseI按順序混合)直接小心地參加到吸附柱內(nèi)膜上，并且確認(rèn)整個(gè)膜都被DNase混合液全部覆蓋；(8)37。C孵育15min，立即參加200gLDNaseStopSolution(DSA)到吸附柱中，12，000rpm離心1min；(9)倒掉收集管內(nèi)濾液，將吸附柱放回收集管內(nèi)，參加600gLBufferRWA到吸附柱中，12，000rpm離心1min；(10)倒掉收集管內(nèi)濾液，將吸附柱放回收集管內(nèi)。加250laLBufferRWA到吸附柱中，13，000rpm離心2min，以除去殘留的液體；(11)將吸附柱轉(zhuǎn)移到新的離心管內(nèi)，參加100gl無(wú)核酶水，室溫放置1min，13，000rpm離心1min，棄純化柱，離心管內(nèi)的總RNA貯存于．80。C冰箱保存。2．3．5．2總RNA的消化處理本實(shí)驗(yàn)選用Promega公司的RQDNaseI處理，按下邊的反響體系依次參加樣品：總RNA 40uLRQDNaseI 2止Buffer 5“LRNaseinhibitor 1pLH20(DEPC處理) 2p,L(1)用微量移液器輕輕吸打混勻，37℃孵育1h：(2)短暫離心3-5S，加等體積酚／氯仿(pH4．5)，顛倒混勻，12，000rpm4℃離心15min：(3)收集上層水相于另一無(wú)菌的新的離心管中，參加1／10體積的新鮮配制的pH=5．2的3MNaAc，再參加兩倍體積的無(wú)水乙醇，靜止置于．80℃冰箱30min以上：(4)12，000rpm4。C離心15min，盡量棄掉殘留液體；(5)用70％的乙醇洗RNA沉淀兩遍，在通風(fēng)櫥中枯燥20min；(6)沉淀溶解在20止滅菌的、無(wú)核酸酶的水中，貯存于．80。C冰箱備用。(7)檢測(cè)總RNA中的DNA是否消化完全，以16SrRNA內(nèi)部片段引物進(jìn)行常規(guī)萬(wàn)方數(shù)據(jù)PCR，如仍殘留DNA成份需進(jìn)行進(jìn)一步DNase消化處理。2．3．5．3PCR，如仍殘留DNA成份需進(jìn)行進(jìn)一步DNase消化處理。2．3．5．3cDNA的合成本研究cDNA的合成是使用RevertAidTM第一鏈合成試劑盒完成，具體操作步驟如下，(1)取無(wú)菌離心管置于冰上，按如下順序參加試劑：TotalRNA 0．1-5嵋randomhexamerprimer(0．2“∥p．L)1此RNA．freewater定容體積為12“L輕輕混勻，瞬時(shí)離心；(2)75℃溫育5min，迅速置于冰上；(3)按順序參加以下組分：5xreactionbuffer 4ULRiboLockTMRibonucleaseInhibitor(20U／pL) 1“L10mMdNTPmix 2“L輕輕混勻并短暫離心；(4)25℃孵育5min；(5)參加1此RevertAidTMM-MuLVReverseTranscriptase(200u／}tL)：(6)短暫離心，25℃孵育10min；(7