SDSAGE電泳的基本原理及濃縮膠濃縮樣品的原理

SDSAGE電泳的基本原理及濃縮膠濃縮樣品的原理SDS－PAGE電泳的基本原理及濃縮膠濃縮樣品的原理SDS(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)是目前最常用的分離蛋白質(zhì)的SDSSDS內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，強(qiáng)還原劑能使半胱氨酸之間的二SDSSDS合，形成帶負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，這種復(fù)合物由于結(jié)合大量的SDS，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)形成僅保持原有分子大小為特征的負(fù)離子團(tuán)塊，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異，由于SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合是按重量成比例的，因此在進(jìn)行電泳時(shí)，蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決于分子大小。當(dāng)分子量子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。量?jī)H僅取決于平衡時(shí)SDS單體的濃度，不是總濃度，而只有在低離子強(qiáng)度的溶液低，常為10-100mM。③二硫鍵是否完全被還原只有二硫鍵被完全還原以后，蛋白質(zhì)分子才能被解聚，SDS才能定量地結(jié)合到亞基上從而給出相對(duì)遷移率和分子質(zhì)醇的濃度常為2-3%。前者有揮發(fā)性，最好使用前加入。SDS緩沖液系統(tǒng)的選擇，Tris-Glycine、Tris-Tricine、Tris-硼酸鹽或者其液都可以使用，但緩沖液的選擇對(duì)蛋白帶的分離和電泳的速度是非常關(guān)鍵的。Tris-甘氨酸系統(tǒng)是目前使用最多的緩沖系統(tǒng)。Tris-甘氨酸系統(tǒng)是目前使用最多的緩沖系統(tǒng)。如果要測(cè)定糖蛋白的分子量，最好采用Tris-硼酸鹽緩沖系統(tǒng)，對(duì)于分積層膠(或稱濃縮膠)的作用原理？Q：SDS－PAGE電泳的基本原理在緩沖系統(tǒng)中的弱酸，如甘氨酸，在時(shí)很少解離，其有效泳動(dòng)速率很低，而氯離子卻有很高的泳動(dòng)速率，蛋白質(zhì)的泳動(dòng)速率介于兩者之間。加上電壓以后，作為先導(dǎo)離子的氯離子和尾隨離子的甘氨酸離子分離開來，并在其后面留下一個(gè)導(dǎo)電性較低的區(qū)帶。由于導(dǎo)電性和電場(chǎng)強(qiáng)度成反比，這一區(qū)帶便獲得較高的電壓梯度，加速甘氨酸離子的泳動(dòng)，使其趕上氯離子，建立起甘氨酸和氯離子的電壓梯度和泳動(dòng)速率乘積相等的穩(wěn)定態(tài)(我不太明白這句話)，使這些帶電顆粒以相同的速度泳動(dòng)，兩種離子之間有明顯的邊界。當(dāng)甘氨酸、氯離子界面通過樣品進(jìn)入濃縮膠時(shí)，在移動(dòng)界面前有一低電壓梯度，界面后有一高電壓梯度。由于在移動(dòng)界面前的蛋白質(zhì)分子泳動(dòng)速率比氯離子低，因此氯離子能迅速越過。移動(dòng)界面后的蛋白質(zhì)處于較高的電壓梯度中，其泳動(dòng)速率比甘氨酸快。因此，移動(dòng)的界面將蛋白質(zhì)分子堆積到一起，形成一條狹窄的區(qū)帶。蛋白質(zhì)在移動(dòng)界面中的濃度作用僅取決于樣品和濃縮膠中Tris-HCl的濃度(為什么)，而與樣品中蛋白質(zhì)的最初濃度無關(guān)。由于濃縮膠為大孔凝膠，故對(duì)蛋白樣品沒有分子篩作用。當(dāng)移動(dòng)的界面到達(dá)濃縮膠和分離膠的界面時(shí)，凝膠的pH明顯增加，導(dǎo)致甘氨酸大量解離。此時(shí)，甘氨酸的有效泳動(dòng)速率H據(jù)其固有的電荷與分子大小進(jìn)行分離。A：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS(十二烷基硫酸鈉)，SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，強(qiáng)還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強(qiáng)還原劑的SDS溶液中，與SDS分子按比例結(jié)合，形成帶負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，這種復(fù)合物由于結(jié)合大量的SDS，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)形成僅保持原有分子大小為特征的負(fù)離子團(tuán)塊，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異，由于SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合是按重量成比例的，因此在進(jìn)行電泳時(shí)，蛋白質(zhì)分子的遷移速k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖，可獲標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。Q：配膠緩沖液系統(tǒng)對(duì)電泳的影響spH環(huán)境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場(chǎng)的作用下，泳動(dòng)效率低；而CL離子卻很高，兩者之間形成導(dǎo)電性較低的區(qū)帶，蛋白分子就介于二者之間泳動(dòng)。由于導(dǎo)電性與電場(chǎng)強(qiáng)度成反比，這一區(qū)帶便形成了較高的電壓剃度，壓著蛋白質(zhì)分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后，由于膠中pH的增加，呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動(dòng)速率增加，直接緊隨氯離子之后，同時(shí)由于分離膠孔徑的縮小，在電場(chǎng)的作用下，蛋白分子根據(jù)其固有的帶電性和分子大小進(jìn)行分離。所以，pH對(duì)整個(gè)反應(yīng)體系的影響是至關(guān)重要的，實(shí)驗(yàn)中在排除其他因素之后仍不能很好解決問題的情況，應(yīng)首要考慮該因素。Q：樣品如何處理ASDS非還原SDS處來分離。一般電泳均按這種方式處理，樣品稀釋適當(dāng)濃度，加入上樣Buffer，離n固的保護(hù)SH基團(tuán)，得到較窄的譜帶；另碘乙酸胺可捕集過量的DTT，而防止銀染lul30min。3min，未加還原劑，因而蛋白折疊未被破壞，不可作為測(cè)定分子量來使用。Q：SDS電泳凝膠中各主要成分的作用A:聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺與為蛋白質(zhì)電泳提供載體，其凝固的好壞直接關(guān)系到電泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境密切相關(guān)；制膠緩沖液：濃縮膠選擇，分離膠選擇，選擇tris－HCL系統(tǒng)，具體作用后面介TEMED與AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；十二烷基硫酸鈉(SDS)：陽離子去污劑，作用有四：去蛋白質(zhì)電荷、解離蛋白質(zhì)之間的氫鍵、取消蛋白分子內(nèi)的疏水作用、去多肽折疊。A：1、聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝膠的分辨率。建議做法：待凝膠在室溫凝凝2、一般常用的有氨基黑、考馬斯亮藍(lán)、銀染色三種染料，不同染料又各自不同的染色方法，具體可參照郭堯君編著的《蛋白質(zhì)電泳技術(shù)手冊(cè)》P82-103。A：主要是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現(xiàn)于較厚的凝膠中。處理辦法：待其充分凝固再作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Q：“皺眉”(兩邊向下中間鼓起)形帶原因A：主要出現(xiàn)在蛋白質(zhì)垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。Q：為什么帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象A：主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過大引起的。處理辦法：加樣前離心；選擇適當(dāng)?shù)臉悠肪彌_液，加適量樣品促溶劑；電泳緩沖液時(shí)間過長(zhǎng)，重新配制；降低凝膠濃度。Q：為什么帶出現(xiàn)紋理現(xiàn)象A：主要是樣品不溶性顆粒引起的。處理辦法：加樣前離心；加適量樣品促溶劑。Q：什么是“鬼帶”，如何處理A：“鬼帶”就是在跑大分子構(gòu)象復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子時(shí)，常會(huì)出現(xiàn)在泳道頂端(有時(shí)在濃縮膠中)的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過程中被氧化而失去活性，致使原來被解離的蛋白質(zhì)分子重新折疊結(jié)合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標(biāo)條帶大，有時(shí)不能進(jìn)入分離膠。但它卻于目標(biāo)條帶有相同的免疫學(xué)活性，在WB反應(yīng)中可見其能與目標(biāo)條帶對(duì)應(yīng)的抗體AQ：為什么溴酚藍(lán)不能起到指示作用A：我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中常會(huì)遇到溴酚藍(lán)已跑出板底，但蛋白質(zhì)卻還未跑下來的現(xiàn)象。主要與緩沖液和分離膠的濃度有關(guān)。Q：為什么電泳的條帶很粗A：電泳中條帶很粗是常見的事，主要是未濃縮好的原因。處理辦法：適當(dāng)增加濃縮膠的長(zhǎng)度；保證濃縮膠貯液的pH正確()；適當(dāng)降Q：為什么電泳