基因克隆工具酶

基因克隆工具酶第1頁/共51頁NMPNTPdNMPdNTP第2頁/共51頁一、限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）發(fā)現(xiàn)：1970年，Smith等人首先從流感嗜血桿菌d株中分離出HindII和HindIII功能：識別雙鏈DNA分子中的特定序列，并切割DNA雙鏈。限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用導(dǎo)致了體外重組DNA技術(shù)的發(fā)展，使人們有可能將很大的DNA分子定向性地切割成較小的DNA片段，然后運用各種技術(shù)手段對其進行分析，從而能對生物體的基因結(jié)構(gòu)、組織表達及進化問題進行深入的研究來源：主要是從原核生物中分離純化得到。到目前為止，已經(jīng)從近300種不同的微生物中分離出約500種限制性核酸內(nèi)切酶1.限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)及其生物功能第3頁/共51頁一、限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）生物學(xué)意義：限制性核酸內(nèi)切酶，可以幫助細菌限制外來DNA的入侵細菌中的防衛(wèi)系統(tǒng)：限制與修飾現(xiàn)象（1）細菌在其感受態(tài)的生理條件下，很容易吸收外源DNA進入體內(nèi)。這種感受態(tài)可以是人為的，也可以是在自然條件下發(fā)生的。如果細菌不加限制地接受所有的外源DNA，細菌本身就會很快發(fā)生遺傳變異甚至死亡。（2）限制性核酸內(nèi)切酶（3）甲基化酶：對該特異位點的腺嘌呤A進行甲基化修飾，被修飾的DNA就不再被相應(yīng)的限制酶切割了。（4）細菌自身的DNA——受到甲基化修飾，得以保存（5）外源入侵的DNA——未來得及甲基化，被降解

1.限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)及其生物功能第4頁/共51頁作為分子克隆宿主菌的大腸桿菌（例如DH5α），必須是（1）rec基因缺陷型的突變體保證必須不與同外來DNA分子發(fā)生遺傳重組（2）限制系統(tǒng)缺陷或限制與修飾系統(tǒng)均缺陷的菌株保證外來DNA分子不會受其限制酶的降解

一、限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）1.限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)及其生物功能第5頁/共51頁2+2+2+一、限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）2.限制性核酸內(nèi)切酶的類型主要特性限制修飾蛋白結(jié)構(gòu)輔助因子識別序列

I型

多功能 異源三聚體ATPMg2+

SAM TGAN8TGCT AACN6GTGC

II型

單功能 同源二聚體

Mg2+旋轉(zhuǎn)對稱序列

III型

雙功能 異源二聚體ATPMg2+

SAM GAGCC CAGCAG切割位點距識別序列1kb處識別序列內(nèi)或附近距識別序列下游隨機性切割特異性切割24-26bp處SAM：S-腺苷蛋氨酸第6頁/共51頁Ⅱ型酶的作用方式在基因工程中具有十分重要的價值，是基因工程中常用的工具酶。Ⅰ型酶、Ⅲ型酶的使用不如Ⅱ型酶方便，切割方式不如Ⅱ型酶那樣令人滿意，在基因克隆中實用價值不大。一、限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）2.限制性核酸內(nèi)切酶的類型第7頁/共51頁屬名種名株名Haemophilusinfluenzaed嗜血流感桿菌d株HindIIIHindIII同一菌株中所含的多個不同的限制性核酸內(nèi)切酶一、限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）3.限制性核酸內(nèi)切酶的命名第8頁/共51頁H：細菌屬名的頭一個字母in：細菌種名的頭兩個字母Hin：表示了該菌的物種名稱，用斜體d：代表該菌菌株名稱III：表示該菌具有幾個不同的限制與修飾體系，Ⅲ表示該酶是屬于第三個限制修飾系統(tǒng)的酶一、限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）3.限制性核酸內(nèi)切酶的命名第9頁/共51頁一、限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）4.II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性EcoRI的切割位點EcoRI的識別序列5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5’(1)識別雙鏈DNA分子中4-8對堿基的特定序列(2)識別序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對稱型回文結(jié)構(gòu)(3)大部分酶的切割位點在識別序列內(nèi)部或兩側(cè)第10頁/共51頁EcoRI等產(chǎn)生的5’粘性末端

5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’ 3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’

EcoRI37℃5‘…G-C-T-G-OH3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-PP-A-A-T-T-C-G-A-G…3’

OH-G-C-T-C…5’

退火4-7℃

OHP5‘…G-C-T-GA-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-AG-C-T-C…5’

POH磷酸二酯鍵發(fā)生水解

nick缺口

第11頁/共51頁PstI等產(chǎn)生的3’粘性末端

5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’ 3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’

PstI37℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH3‘…C-G-A-G-P

P-G-G-A-G…3’OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’

退火4-7℃

OHP5‘…G-C-T-C-T-G-C-AG-G-A-G…3’3‘…C-G-A-GA-C-G-T-C-C-T-C…5’

POH磷酸二酯鍵發(fā)生水解

nick缺口

第12頁/共51頁PvuII等產(chǎn)生的平頭末端

5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’ 3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’

PvuII37℃5‘…G-C-T-C-A-G-OH3‘…C-G-A-G-T-C-P

P-C-T-G-G-A-G…3’OH-G-A-C-C-T-C…5’磷酸二酯鍵發(fā)生水解

第13頁/共51頁限制酶的識別序列與DNA的來源無關(guān)，不帶有種的特征，對各種DNA都普遍適用。因此，甲種生物的DNA與乙種生物的DNA用同一種限制酶作用后，所形成的限制片段帶有同樣的末端，能夠通過堿基的互補配對而連接起來。這是重組DNA技術(shù)的重要基礎(chǔ)之一。根據(jù)這一特性，可以將不同來源的DNA重組成一種新的重組體分子。限制酶切割DNA分子形成的短片段可以自發(fā)地重新連接成環(huán)狀，這些環(huán)狀分子經(jīng)過加熱又可以打開成線狀但如果在環(huán)化后加進DNA連接酶，在DNA片段之間的接口處將形成磷酸二酯鍵，這是一種較強的化學(xué)結(jié)合力，形成的環(huán)形DNA將是十分穩(wěn)定的，即使再加熱也很難再成線狀，除非再次受到限制酶的作用。這說明，DNA經(jīng)限制酶切割后再通過連接酶作用，得到的連接DNA是相當穩(wěn)固的，這也是分子克隆技術(shù)的重要前提。第14頁/共51頁Tris-HCl50mMpH7.5MgCl2NaClDTTVolumeTT10mM0-150mM1mM20-100μl37℃左右，1-1.5h（不能過長或過短）0-50mM低鹽酶100mM中鹽酶150mM高鹽酶1U核酸內(nèi)切酶的酶活性：在最佳反應(yīng)條件下反應(yīng)1小時，完全水解1μg

標準DNA所需的酶量（1）大部分II型核酸內(nèi)切酶需要相似的反應(yīng)條件：一、限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）5.II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應(yīng)的操作第15頁/共51頁（2）II型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解：

對鹽濃度要求相同的酶，原則上可以同時酶切，但應(yīng)注意：BamHISmaI5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’5‘…GCTACATG3‘…CGATGTACCTAGGATCCCGGGTTCGCAT…3’ GGCCCAAGCGTA…5’5‘…GCTACATGGATCCC3‘…CGATGTACCTAGGGGGGTTCGCAT…3’ CCCAAGCGTA…5’一、限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）5.II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應(yīng)的操作第16頁/共51頁（3）II型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解：對鹽濃度要求不同的酶，可采取下列方法：使用較貴的酶的鹽濃度，加大便宜酶的用量，同時酶解低鹽酶先切，然后補加鹽，高鹽酶再切一種酶先切，然后更換緩沖液，另一種酶再切0.1倍體積的5MNaAcpH5.42.5倍體積的冰冷乙醇冰浴5分鐘、高速冷凍離心10分鐘、干燥一、限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）5.II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應(yīng)的操作第17頁/共51頁（1）DNA樣品的純度：蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等加大酶的用量，1μg

DNA用10U酶加大反應(yīng)總體積延長反應(yīng)時間一、限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）6.影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素第18頁/共51頁655（2）DNA樣品的甲基化程度：大腸桿菌中的dam甲基化酶在5‘GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影響的酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影響大腸桿菌中的dcm甲基化酶在5‘CCAGG3’或5‘CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影響的酶有EcoRII等哺乳動物中的甲基化酶在5‘CG3’序列中的C5位上引入甲基一、限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）6.影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素第19頁/共51頁（3）核酸內(nèi)切酶的緩沖液性質(zhì)：EcoRI在正常條件下識別并切割5‘GAATTC3’序列，但在甘油濃度超過5%（v/v）時，也可切割5‘PuPuATPyPy3’或者5‘AATT3’一、限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）6.影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強度、極端pH值等，會使一些核酸內(nèi)切酶的識別和切割序列發(fā)生低特異性，即所謂的Staractivity現(xiàn)象第20頁/共51頁二、DNA連接酶（DNAligase）1.DNA連接酶的基本性質(zhì)

（1）修復(fù)雙鏈DNA上缺口處的磷酸二酯鍵催化5'-磷酸基團和3'-羥基末端之間形成磷酸二酯鍵

nickOHP5‘…G-C-T-C-T-G-C-AG-G-A-G…3’3‘…C-G-A-GA-C-G-T-C-C-T-C…5’

POHnick

DNA連接酶

5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’ 3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’第21頁/共51頁二、DNA連接酶（DNAligase）

1.DNA連接酶的基本性質(zhì)

（2）修復(fù)與RNA鏈結(jié)合的DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵

5‘…G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G…3’ 3‘…C-G-A-GA-C-G-G-C-C-T-C…5’POHnick

T4-DNA連接酶5‘…G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C…5’第22頁/共51頁二、DNA連接酶（DNAligase）

1.DNA連接酶的基本性質(zhì)

（3）連接多個平頭雙鏈DNA分子：5‘…G-C-T-C-A-G-OH3‘…C-G-A-G-T-C-P

P-C-T-G-G-A-G…3’OH-G-A-C-C-T-C…5’

T4-DNA連接酶5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’第23頁/共51頁二、DNA連接酶（DNAligase）

2.DNA連接酶的反應(yīng)條件Tris-HClMgCl2ATPDTTVolumeTT50-100mMpH7.510mM0.5-1mM5mM10-20μl4-15℃4-16h1UDNA連接酶的酶活性：在最佳反應(yīng)條件下15℃反應(yīng)1小時，完全連接1μgλ-DNA（HindIII片段）所需的酶量第24頁/共51頁二、DNA連接酶（DNAligase）

3.平頭雙鏈DNA片段的連接操作從分子動力學(xué)的角度講，由限制性核酸內(nèi)切酶創(chuàng)造的粘性末端的連接屬于分子內(nèi)部的連接，而平頭末端的連接則屬于分子間的連接，因此后者反應(yīng)速度要慢得多提高平頭末端連接效率的方法包括：加大連接酶用量（10倍大于粘性末端的連接）加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機會加入10%PEG8000，促進大分子之間的有效作用加入單價陽離子（NaCl），最終濃度150-200mM第25頁/共51頁2+三、DNA聚合酶（DNApolymerase）1.大腸桿菌DNA聚合酶I（DNApolI）（1）大腸桿菌DNA聚合酶I的基本性質(zhì)：5’→3’的DNA聚合酶活性

5’→3’的核酸外切酶活性

3’→5’的核酸外切酶活性3‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5‘…C-G-A-G-T-OHDNApolI5‘pppdNMg2+3‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH第26頁/共51頁322+32三、DNA聚合酶（DNApolymerase）1.大腸桿菌DNA聚合酶I（DNApolI）（2）大腸桿菌DNA聚合酶I的基本用途：5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘

DNaseI5‘…G-C-T-CA-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘缺口前移標記法Nicktranslation（切口平移）制備32P標記的探針DNApolIMg2+

5‘dNTP5‘pppdA（α-32P-dATP）5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘第27頁/共51頁三、DNA聚合酶（DNApolymerase）2.大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）（1）Klenow酶的基本性質(zhì)：大腸桿菌DNA聚合酶I經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理，獲得N端三分之二的大肽段，即為Klenow酶Klenow酶仍擁有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性，但失去了5’→3’的核酸外切酶活性第28頁/共51頁三、DNA聚合酶（DNApolymerase）2.大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）（2）Klenow酶的基本用途：補平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5’粘性末端DNA片段的同位素末端標記cDNA第二鏈的合成雙脫氧末端終止法測定DNA序列第29頁/共51頁三、DNA聚合酶（DNApolymerase）

2.大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）5‘…G-C-T-G-OH3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

Klenow5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-OH3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’

OH-G-C-T-C…5’

dATPdTTP

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’OH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’（2）Klenow酶的基本用途1：補平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5’粘性末端第30頁/共51頁32（2）Klenow酶的基本用途2：DNA片段的同位素末端標記5‘…G-C-T-G-OH3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

Klenow5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-OH3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’

OH-G-C-T-C…5’

α-32P-pppdAdTTP

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’OH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’三、DNA聚合酶（DNApolymerase）

2.大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）第31頁/共51頁三、DNA聚合酶（DNApolymerase）3.T4-DNA聚合酶（1）T4-DNA酶的基本特性：5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性在無dNTP時，可以從任何3’-OH端外切在只有一種dNTP時，外切至互補核苷酸暴露時停止在四種dNTP均存在時，聚合活性占主導(dǎo)地位第32頁/共51頁三、DNA聚合酶（DNApolymerase）3.T4-DNA聚合酶5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH3‘…C-G-A-G-P

T4-DNA聚合酶

5‘…G-C-T-C-OH

3‘…C-G-A-G-P

P-G-G-A-G…3’

HO-A-C-G-T-C-C-T-C…5’

P-G-G-A-G…3’HO-C-C-T-C…5’注意：該酶也能降解雙鏈DNA，只是其活性比單鏈降解活性低很多（2）T4-DNA聚合酶的基本用途1：切平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的3’粘性末端第33頁/共51頁2+32（2）T4-DNA聚合酶的基本用途2：DNA片段的同位素末端標記

5‘G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’ 3‘C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘

T4-DNApol

5‘G-C-T-CA-G-C-T-G-OH HO-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘T4-DNApolMg2+

5’pppdN5’pppdA（α-32P-dATP）5‘G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3‘C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘三、DNA聚合酶（DNApolymerase）3.T4-DNA聚合酶第34頁/共51頁2+三、DNA聚合酶（DNApolymerase）4.依賴于RNA的DNA聚合酶（反轉(zhuǎn)錄酶）

3’AAAAAAAAAAAAAA5’TTTTTTTTTTTToligo(dT)12-185’mRNA

反轉(zhuǎn)錄酶3’AAAAAAAAAAAAAA5’TTTTTTTTTTTTTTMg2+

dNTP5’mRNA3’cDNA（1）反轉(zhuǎn)錄酶的基本特性：以RNA為模板合成cDNA鏈第35頁/共51頁（2）反轉(zhuǎn)錄酶的基本特性：雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈5’3’3’3’5’反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶3’RNA3’RNA5’DNA5’DNA5’DNA三、DNA聚合酶（DNApolymerase）4.依賴于RNA的DNA聚合酶（反轉(zhuǎn)錄酶）

第36頁/共51頁2+四、核酸酶（nuclease）1.單鏈核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）

5’3’5’3’ExoVII3’5’3’5’大腸桿菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+第37頁/共51頁2+四、核酸酶（nuclease）2.雙鏈核酸外切酶：核酸外切酶III（ExoIII）

大腸桿菌的核酸外切酶III特異性地從3’端外切5’3’5’ExoVII3’Mg2+

3’3’5’5’第38頁/共51頁2+四、核酸酶（nuclease）2.雙鏈核酸外切酶：λ核酸外切酶（λExo）

λ核酸外切酶特異性地從5’

端外切5’3’3’

λExo5’Mg2+

5’3’5’3’第39頁/共51頁2+四、核酸酶（nuclease）3.單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶（1）S1核酸酶的基本特性：來自米曲霉（Aspergillusoryzae）降解單鏈DNA的速度比降解雙鏈DNA快75000倍Zn2+必需最適pH范圍為4.0-4.3需要NaCl10-300mM降解單鏈DNA的速度比降解單鏈RNA快7倍第40頁/共51頁2+

（2）S1核酸酶的基本反應(yīng)：內(nèi)切單鏈DNA或RNA

5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T…3’

S15‘…G-C-T-C-A-G-C-T-C

Zn2+T-T-G-A-G-G-A-G-T…3’5‘…G-C-T-CA-G-C-T-CT-T-G-A-GG-A-G-T…3’5’dNMPs或5’NMPs四、核酸酶（nuclease）3.單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶第41頁/共51頁S1Zn2+2+

（2）S1核酸酶的基本反應(yīng)：內(nèi)切帶缺口或缺刻的雙鏈DNA或RNA

nick5‘…G-C-T-C-A-GC-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’5‘…G-C-T-C-A-G3‘…C-G-A-G-T-CT-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C

A-C-C-T-C-A…5‘gapA-C-C-T-C-A…5‘四、核酸酶（nuclease）3.單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶第42頁/共51頁

（3）S1核酸酶的重要用途：在DNA上定位RNA（S1mapping）

DNAEcoRI雜交

S1mRNA四、核酸酶（nuclease）3.單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶第43頁/共51頁

4.單鏈內(nèi)切、雙鏈外切的核酸酶：Bal31核酸酶 （1）Bal31核酸酶的基本特性：來自艾氏交替單胞菌（A.espejiana）ssDNAorRNACa2+Ca2+Ca2+5’dNMPs或5’NMPs四、核酸酶（nuclease）第44頁/共51頁A

4.單鏈內(nèi)切雙鏈外切的核酸酶：Bal31核酸酶 （2）Bal31核酸酶的基本用途：誘發(fā)DNA突變

C

環(huán)化