基因工程-誕生原理技術(shù)應(yīng)用

基因工程—誕生原理技術(shù)應(yīng)用第1頁/共24頁專題一基因工程一、基因工程的定義按照人們的意愿，把一種生物的某種基因提取出來，加以修飾改造，然后放到另一種生物的細(xì)胞里，定向地改造生物的遺傳性狀。供體生物目的基因剪切和拼接，建構(gòu)重組DNA分子受體細(xì)胞也稱基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)第2頁/共24頁二、基因工程的理論依據(jù)DNA是絕大多數(shù)生物的遺傳物質(zhì)，不同生物的DNA的基本單位和結(jié)構(gòu)相同中心法則：DNARNA蛋白質(zhì)復(fù)制轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制基因是遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的基本單位各種生物共用一套遺傳密碼第3頁/共24頁三、DNA重組技術(shù)的基本工具1、限制性核酸內(nèi)切酶——分子手術(shù)刀來源：主要從原核生物中分離提純特點(diǎn)：高度的專一性多樣性識(shí)別并切割特定的某種核苷酸序列已經(jīng)分離出4000種第4頁/共24頁作用：識(shí)別雙鏈DNA分子上某種特定的核苷酸序列，含有4～8個(gè)核苷酸中心軸線兩側(cè)的堿基反向?qū)ΨQ重復(fù)排列如EcoRⅠ酶，從中軸線兩側(cè)切開，如SmaⅠ酶，沿中軸線處切開，平切：錯(cuò)位切：形成平末端形成黏性末端并使每條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開第5頁/共24頁2、DNA連接酶——“分子縫合針”將雙鏈DNA分子的兩個(gè)片段連接起來

——通過形成磷酸二酯鍵E.coliDNA連接酶：連接黏性末端T4DNA連接酶：連接黏性末端或平末端DNA連接酶與DNA聚合酶功能的區(qū)別：DNA連接酶催化兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵而連接起來DNA聚合酶催化游離的脫氧核苷酸與DNA片段之間形成磷酸二酯鍵而連接起來第6頁/共24頁3、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車”作用：將目的基因（外源基因）送入受體細(xì)胞條件：有一個(gè)或多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)在受體細(xì)胞中能自我復(fù)制，或者能整合到染色體DNA上，隨染色體DNA同步復(fù)制帶有標(biāo)記基因，便于甄別和篩選安全，對(duì)受體細(xì)胞無害大小合適，方便操作種類：質(zhì)粒（經(jīng)人工改造，常用）、λ噬菌體衍生物、動(dòng)植物病毒、農(nóng)桿菌等第7頁/共24頁四、基因工程的基本操作程序1、目的基因的獲?、艔幕蚪M文庫中獲取目的基因?qū)⒛成锏幕蚪M進(jìn)行切割，獲得一批長度為15—20kb的DNA片段將上述DNA片段分別與運(yùn)載體結(jié)合，再分別導(dǎo)入受體菌群體的各細(xì)胞中儲(chǔ)存、復(fù)制需要時(shí)通過一定方法從基因組文庫中獲取目的基因——構(gòu)建成該生物的基因組文庫限制酶第8頁/共24頁⑵利用反轉(zhuǎn)錄法獲取目的基因單鏈DNA（cDNA）提取某生物細(xì)胞中的mRNA反轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶雙鏈DNA受體菌細(xì)胞中儲(chǔ)存、復(fù)制，建構(gòu)cDNA文庫PCR技術(shù)擴(kuò)增獲取目的基因一定方法導(dǎo)入RNA—DNA雜交分子RNA酶降解RNA鏈第9頁/共24頁⑶直接提取后利用PCR技術(shù)擴(kuò)增而獲取目的基因以探針從生物細(xì)胞中提取目的基因利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因⑷人工合成目的基因DNA合成儀合成雙鏈DNA（目的基因）堿基序列已知測定某蛋白質(zhì)中氨基酸的排列順序利用密碼子表推測mRNA中堿基排列順序DNA反義鏈的堿基排列順序利用堿基互補(bǔ)配對(duì)原則推測化學(xué)合成第10頁/共24頁真核生物的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)外顯子內(nèi)含子初級(jí)mRNA翻譯蛋白質(zhì)啟動(dòng)子終止子轉(zhuǎn)錄加工成熟mRNA第11頁/共24頁P(yáng)CR技術(shù)（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）——人工擴(kuò)增DNA技術(shù)引物原理：DNA的半保留復(fù)制反應(yīng)系統(tǒng)：微量DNA樣品DNA聚合酶4種游離的脫氧核糖核苷酸——模板——dATP、dTTP、dGTP、dCTP——人工合成的含有20個(gè)堿基的核苷酸序列（過量）（過量）第12頁/共24頁退火（55～60℃）,與引物互補(bǔ)在適宜溫度下（70～75℃）形成DNA新鏈反應(yīng)過程樣本DNADNA聚合酶引物提高溫度（90～95℃）,DNA變性循環(huán)進(jìn)行DNA數(shù)量呈指數(shù)方式增加第13頁/共24頁P(yáng)CR技術(shù)與體內(nèi)DNA復(fù)制的區(qū)別：1.PCR不需要DNA解旋酶；體內(nèi)DNA復(fù)制需要；2.PCR需要耐熱的DNA聚合酶（常用TaqDNA聚合酶），而生物體內(nèi)的聚合酶在高溫時(shí)會(huì)變性；3.PCR一般可以經(jīng)歷三十多次循環(huán)，短時(shí)間內(nèi)形成大量DNA片段；而生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要生物體自身的復(fù)制，形成整個(gè)DNA分子。第14頁/共24頁2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建一個(gè)基因表達(dá)載體包括：啟動(dòng)子目的基因終止子標(biāo)記基因其他——RNA聚合酶的識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄——使受體生物表現(xiàn)出更符合人類需求的性狀——結(jié)束轉(zhuǎn)錄——鑒別篩選出含目的基因的受體細(xì)胞使目的基因穩(wěn)定存在并遺傳使目的基因表達(dá)和發(fā)揮作用如復(fù)制原點(diǎn)、運(yùn)載體上原有的基因（最核心步驟）第15頁/共24頁3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（1）將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌提取Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建表達(dá)載體感染雙子葉植物目的基因整合目的基因插入受體細(xì)胞染色體DNA裸子植物目的基因隨染色體DNA復(fù)制并表達(dá)常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入第16頁/共24頁基因槍法（適用于單子葉植物）花粉管法柱頭子房壁胚珠萌發(fā)的花粉?；ǚ酃芫寺鸭?xì)胞極核目的基因簡便經(jīng)濟(jì)第17頁/共24頁（2）將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞——顯微注射技術(shù)提純表達(dá)載體顯微注射儀注射受體動(dòng)物受精卵移植雌性動(dòng)物輸卵管或子宮內(nèi)發(fā)育具有新性狀的動(dòng)物（轉(zhuǎn)基因動(dòng)物）第18頁/共24頁（3）將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞常態(tài)細(xì)菌Ca2+處理感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體DNA細(xì)菌吸收被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌（含目的基因）混合第19頁/共24頁4、目的基因的檢測與鑒定以被標(biāo)記的目的基因作探針，與轉(zhuǎn)基因生物基因組DNA雜交，觀察是否出現(xiàn)雜交帶以被標(biāo)記的目的基因作探針，與轉(zhuǎn)基因生物提取出的mRNA雜交，觀察是否出現(xiàn)雜交帶檢測轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA——分子雜交技術(shù)——分子雜交技術(shù)第20頁/共24頁檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)目的基因表達(dá)的蛋白質(zhì)（抗原）刺激產(chǎn)生相應(yīng)抗體從轉(zhuǎn)基因生物體內(nèi)提取蛋白質(zhì)抗原—抗體雜交觀察是否出現(xiàn)雜交帶檢測轉(zhuǎn)基因生物的性狀——抗原—抗體雜交技術(shù)觀察或測定是否出現(xiàn)目的基因所決定的性狀抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等第21頁/共24頁人胰島細(xì)胞胰島素mRNABC①②③④⑤胰島素是治療糖尿病的重要藥物。下圖是利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)人胰島素時(shí)擴(kuò)增目的基因的過程。請(qǐng)據(jù)圖回答。（1）人體內(nèi)能產(chǎn)生胰島素mRNA的細(xì)胞是

細(xì)胞，不能利用人的皮膚細(xì)胞來完成①過程的理由是

，檢測胰島素mRNA常用的技術(shù)是

。（2）與④相比，②不同的堿基配對(duì)方式是

。（3）若胰島素mRNA中鳥嘌呤、胞嘧啶和腺嘌呤分別占?jí)A基總數(shù)的32%、26%和19%，則B中含有腺嘌呤

%。胰島B

胰島素基因在皮膚細(xì)胞中不能表達(dá)分子雜交技術(shù)U－A21第22頁/共24頁（4）若C為具有生物活性的人胰島素基因，要使其在大腸桿菌體內(nèi)成功表達(dá)，還要進(jìn)行的操作步驟依次是：

，