基因工程制藥工藝

基因工程制藥工藝第1頁/共31頁第六章基因工程制藥工藝6.1基因工程制藥微生物表達(dá)系統(tǒng)6.2基因工程大腸桿菌的構(gòu)建6.3基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)與控制第2頁/共31頁基因工程藥物的生產(chǎn)分為上游和下游兩個階段：上游階段：實驗室內(nèi)完成克隆目的基因

目的基因的表達(dá)基因工程藥物生產(chǎn)的基本過程下游階段：將實驗室的成果產(chǎn)業(yè)化、商品化工程菌大量培養(yǎng)產(chǎn)品的分離純化和質(zhì)量控制。第3頁/共31頁基因工程藥物研究的技術(shù)路線-上游技術(shù)PCR篩選，酶切確認(rèn)，提取質(zhì)粒測序誘導(dǎo)表達(dá)分離純化目的蛋白目的基因克隆酶切質(zhì)粒提取、酶切轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞連接、轉(zhuǎn)化第4頁/共31頁第5頁/共31頁基因工程藥物涉及的技術(shù)RNA提取及操作,防RNA酶引物設(shè)計cDNA合成PCR質(zhì)粒提取限制性內(nèi)切酶操作DNA連接制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化大腸桿菌無菌操作制備各種培養(yǎng)基12.瓊脂糖電泳13.蛋白質(zhì)純化14.SDS15.微生物發(fā)酵技術(shù)16.動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)17.熟悉DNA分析軟件18.熟悉分子生物學(xué)常用網(wǎng)站第6頁/共31頁基因工程菌概念：以微生物為操作對象，通過基因工程技術(shù)獲得的表達(dá)外源基因，或過量表達(dá)或抑制自身基因的工程生物體。種類：基因工程大腸桿菌和酵母：重組蛋白質(zhì)藥物基因工程技術(shù)改造出發(fā)菌：氨基酸、抗生素、甾體激素、中間體生產(chǎn)第7頁/共31頁6.1.1大腸桿菌系統(tǒng)1、大腸桿菌（Escherichiacoli）形態(tài)特征細(xì)胞：G-，單細(xì)胞，桿狀，鞭毛，無芽孢，一般無莢膜。裂殖。菌落：白色至黃白色，光滑，直徑2~3mm第8頁/共31頁2、生化與遺傳特性能在僅有碳水化合物和氮、磷及微量元素的無機(jī)鹽的極限培養(yǎng)基上生長，發(fā)酵糖，產(chǎn)氣、產(chǎn)酸。繁殖一代約17min基因工程中使用菌株：K-12株的衍生菌株基因組：4.6Mbp，3000多種蛋白質(zhì)染色體DNA為環(huán)狀雙鏈，核外遺傳物質(zhì)為質(zhì)粒第9頁/共31頁3、質(zhì)粒載體復(fù)制子選擇標(biāo)記多克隆位點第10頁/共31頁質(zhì)粒載體的基本特征自主復(fù)制性：復(fù)制子—復(fù)制起始點及控制復(fù)制頻率的調(diào)控元件。質(zhì)粒DNA不依賴于染色體DNA而自主復(fù)制。選擇標(biāo)記：質(zhì)粒編碼的選擇標(biāo)記，產(chǎn)生一種新的表型，用于轉(zhuǎn)化體的篩選。如：抗生素抗性基因，氨芐、四環(huán)素、卡那等。多克隆位點：外源基因插入載體的位置，由多種常見的限制性內(nèi)切酶位點序列構(gòu)成。不相容性：具有相同或相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)及特征的兩種不同質(zhì)粒不能穩(wěn)定地存在于同一宿主細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)移性：通過細(xì)菌接合作用從一個宿主轉(zhuǎn)移到另一個宿主細(xì)胞/菌第11頁/共31頁質(zhì)粒類型嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒：每個細(xì)胞含少數(shù)拷貝質(zhì)粒松弛型質(zhì)粒：每個細(xì)胞含幾十至幾百拷貝質(zhì)?？寺≠|(zhì)粒：用于克隆和擴(kuò)增外源基因測序質(zhì)粒：用于基因測序整合質(zhì)粒：用于外源基因與宿主染色體整合穿梭質(zhì)粒：能在兩種宿主細(xì)胞存在表達(dá)質(zhì)粒：能表達(dá)基因產(chǎn)物第12頁/共31頁表達(dá)載體MCS附近結(jié)構(gòu)啟動子操縱子核糖體結(jié)合位點MCS終止子第13頁/共31頁4、產(chǎn)物表達(dá)形式不溶性蛋白質(zhì)：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成包涵體可溶性蛋白質(zhì)：存在于細(xì)胞質(zhì)周質(zhì)表達(dá)：外源蛋白被運輸分泌到周質(zhì)空間，可溶性胞外表達(dá)：胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)液中第14頁/共31頁5、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的問題缺點:1）缺乏翻譯后修飾，如糖基化

2）常形成包涵體，復(fù)性效果差

3）蛋白質(zhì)易被降解

4）內(nèi)毒素難以除盡，產(chǎn)生熱源

5）N端增加的蛋氨酸容易引起免疫反應(yīng)優(yōu)點:1）簡單，經(jīng)濟(jì)，快速

2）適合于制備抗體，供下游研究第15頁/共31頁6、應(yīng)用大量外源基因能超量的表達(dá)，18種藥物上市多肽類：2種（甲狀旁腺激素1-34、利尿鈉肽）激素：胰島素及2種突變體、8種生長素（1種PEG化）細(xì)胞因子類：5種干擾素α（1種PEG化）、干擾素β和γ，2種G-CSF（1種PEG化）、白介素-2、白介素-11、白介素-1拮抗劑溶栓酶類：rPA（reteplase，瑞替普酶）白喉毒素-1L2融合蛋白、OspA脂蛋白（疫苗）等第16頁/共31頁6.1.2酵母表達(dá)系統(tǒng)1、形態(tài)特征細(xì)胞：單細(xì)胞真核生物，球形，橢圓形，卵形繁殖：芽殖、裂殖，在特定條件下才產(chǎn)生子囊孢子菌落：乳白色，有光澤，邊沿整齊第17頁/共31頁2、生長與遺傳特征兩個性別不同的單倍體細(xì)胞結(jié)合形成二倍體結(jié)合子或營養(yǎng)細(xì)胞，進(jìn)行芽殖。能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖等。生長繁殖迅速，倍增期約2h釀酒酵母有17條染色體1996年完成其全基因組測序，遺傳背景相對清楚基因組：120.68Mbp，5887個ORF，編碼約6000個基因第18頁/共31頁表達(dá)載體—穿梭載體含有復(fù)制起始序列或整合序列、選擇標(biāo)記以及由啟動子、終止子和信號肽序列構(gòu)成的表達(dá)盒序列。四種類型

YIp酵母整合載體

YCp酵母著絲粒載體

YRp酵母復(fù)制載體

YEp酵母附加載體第19頁/共31頁YIp酵母整合載體：選擇標(biāo)記和MCS，無自主復(fù)制序列，有整合序列。同源重組整合到酵母染色體，隨同染色體一起復(fù)制和遺傳。

YCp酵母著絲粒載體：著絲粒序列和自主復(fù)制序列。可自主復(fù)制，拷貝數(shù)很低，無選擇性，極易丟失，主要用于文庫構(gòu)建和基因克隆。

YRp酵母復(fù)制載體：酵母基因組DNA復(fù)制序列，可獨立自主復(fù)制，轉(zhuǎn)化效率高。但存在分配不均一性，母細(xì)胞中遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于子細(xì)胞中。無選擇壓，容易丟失。常用于試驗研究，很難工業(yè)化應(yīng)用。

YEp酵母附加載體：復(fù)制子，可自主復(fù)制，高拷貝，轉(zhuǎn)化頻率高。改造后，無需選擇壓就能高拷貝穩(wěn)定分配，在大規(guī)模無選擇培養(yǎng)中是非常有用的，用于過量表達(dá)外援基因。第20頁/共31頁3、優(yōu)點與不足載體：安全、無毒營養(yǎng)缺陷選擇外來質(zhì)粒培養(yǎng)條件簡單，大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)成熟亞細(xì)胞器分化，進(jìn)行蛋白質(zhì)的翻譯后正確修飾和加工，并具有良好的蛋白質(zhì)分泌能力缺點：釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，制約了高密度發(fā)酵修飾的蛋白質(zhì)糖基化側(cè)鏈過長，會引起副作用第21頁/共31頁4、應(yīng)用1981年，Nature，Hitzeman等在酵母中表達(dá)人干擾素激素類：67種人胰島素及1種突變體，尿酸水解酶和水蛭素細(xì)胞因子：GM-CSF和血小板衍生生長因子多肽類：高血糖素2種乙肝疫苗等第22頁/共31頁5、畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)Saccharomycescerevisiae過去常用畢赤酵母

Pichiapastoris現(xiàn)在多用第23頁/共31頁Pichiapastoris

表達(dá)系統(tǒng)

Pichiapastoris

是甲醇利用型酵母,可以用甲醇作為唯一的碳源；易操作，培養(yǎng)容易；表達(dá)量高,可達(dá)培養(yǎng)液中10g/L；可以有真核生物的翻譯后修飾，如糖基化；避免了釀酒酵母的過糖基化問題。第24頁/共31頁畢赤酵母具有高等真核表達(dá)系統(tǒng)的許多優(yōu)點：1.蛋白加工、折疊、翻譯后修飾等。2.操作時與E.coli及釀酒酵母同樣簡單。它比桿狀病毒或哺乳動物組織培養(yǎng)等其它真核表達(dá)系統(tǒng)更快捷、簡單、廉價，且表達(dá)水平更高。3.同為酵母，畢赤酵母具有與釀酒酵母相似的分子及遺傳操作優(yōu)點，且它的外源蛋白表達(dá)水平是后者的十倍以至百倍。

這些使得畢赤酵母成為非常有用的蛋白表達(dá)系統(tǒng)。

第25頁/共31頁畢赤酵母系統(tǒng)的注意事項嚴(yán)格無菌操作，防止污染；可以鏡檢溫度≤30C轉(zhuǎn)化PCR檢測5.

誘導(dǎo)時間第26頁/共31頁蛋白質(zhì)糖基化蛋白質(zhì)的糖基化是真核生物的一種常見的翻譯后修飾方式；糖基化影響蛋白折疊、定位、轉(zhuǎn)運、生物活性、可溶性、抗原性、半衰期。第27頁/共31頁酵母蛋白糖基化釀酒酵母與畢赤酵母大多數(shù)為N-連接糖基化高甘露糖型；然而畢赤酵母中蛋白轉(zhuǎn)錄后所增加的寡糖鏈長度（平均每個支鏈8~14個甘露糖殘基）比釀酒酵母中的（50~150個甘露糖殘基）短得多；釀酒酵母核心寡糖有末端α-1,3聚糖連接頭，而畢赤酵母則沒有