基因工程基因克隆的工具酶

基因工程基因克隆的工具酶第1頁/共85頁從核酸分子的末端開始，一個核苷酸一個核苷酸地消化降解多核苷酸鏈，叫做核酸外切酶（exonuclease）第2頁/共85頁從核酸分子內部切割磷酸二酯鍵使之斷裂形成小片段，叫做核酸內切酶（endonuclease）第3頁/共85頁第4頁/共85頁1限制性核酸內切酶(restrictionenzyme)

"forthediscoveryofrestrictionenzymesandtheirapplicationtoproblemsofmoleculargenetics"TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1978WernerArberSwitzerland1929~DanielNathansUSA1928~1999HamiltonO.SmithUSA1931~第5頁/共85頁一類能從DNA分子中間水解磷酸二酯鍵,從而切斷雙鏈DNA的核酸水解酶。它們不同于一般的脫氧核糖核酸酶（DNase），它們的切點大多很嚴格，要求專一的核苷酸順序─識別順序。restrictionenzyme限制性核酸酶的發(fā)現(xiàn),為基因結構、DNA堿基順序分析和基因工程的研究開辟了途徑。第6頁/共85頁1.1寄主控制與修飾現(xiàn)象(Restrictionandmodification)Theopposingactivitiesofrestrictionandmodificationarethetwocomponentsofabacterialdefencemechanism.Restriction,orDNAcleavage,isthemeansbywhichthehostbacteriapreventsinfectionbybacterialviruses(bacteriophage).TheDNAoftheincomingphageisrecognisedas"foreign"andcleavedbyarestrictionendonuclease.第7頁/共85頁在Ecoli.K上生長的λ噬體則表示為λ（K）。實驗表明，用這種λ（K）噬菌體感染Ecoli.B，形成噬菌斑的效率就很低因此λ（K）噬菌體受到了B菌體的限制。第8頁/共85頁第9頁/共85頁Modification,DNAmethylation,isthemechanismbywhichthehostbacteriaprotectsitsownDNAfromcleavagebytherestrictionendonuclease.AmodificationmethyltransferasemethylatestheDNAatthesamerecognitionsequencethattherestrictionendonucleaseusestobindtotheDNApriortocleavage.Thisactivitydiscriminates"self"DNAfrom"foreign"DNA.

第10頁/共85頁Invivorestrictionofbacteriophagelambdabytwodifferentrestrictionsystems.

Therestrictionlevelisshownasareductioninthenumberofplaquesproducedbythephage.Thetwoplatesattherightshowasignificantreductioninthenumberofplaquesduetorestrictionactivity.RestrictionModification第11頁/共85頁1.2限制性內切酶的種類Ⅰ型的酶要求DNA分子上有特定的識別順序，但是切點卻不在此識別順序之中，而與之有一定距離。在反應中，要求有ATP和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）。酶由不同的α、β、γ亞基組成。全酶兼有限制性內切酶的活性和甲基化酶的活性。按其性質可分為三大類Ⅲ型的酶與Ⅰ型的酶有相似特征，只是切點距識別順序距離是嚴格的。限制性核酸酶在原核和真核細胞中都有發(fā)現(xiàn)第12頁/共85頁不兼有甲基化酶的活性，細胞內另有獨立的甲基化酶。它切斷DNA時不需ATP，也不需SAM。它的切點是嚴格的，而且就在識別順序之中。Ⅱ型的酶，獨立的限制性核酸內切酶Ⅱ型的酶在蛋白質組成上比Ⅰ型、Ⅲ型要簡單的多，它只有單一的亞基，以二體或四體發(fā)揮作用。第13頁/共85頁第14頁/共85頁1.3限制性核酸內切酶的命名屬名種名株名Haemophilusinfluenzae

d

嗜血流感桿菌d株HindIII

HindIII同一菌株中所含的多個不同的限制性核酸內切酶第15頁/共85頁EcoRⅠ

Escherichiacoli（大腸桿菌）RY13之酶ⅠHindⅢ

Haemophiliusinfluenzae（嗜血流感桿菌）Rd之酶ⅢAluⅠArthrobacterluteus（藤黃節(jié)桿菌）之酶ⅠHaeⅢ

Haemophilusaegyptius（埃及嗜血菌）之酶Ⅲ第16頁/共85頁

在DNA分子雙鏈的特異性識別序列部位，切割DNA分子產(chǎn)生鏈的斷裂2個單鏈斷裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相對的

斷裂的結果形成的DNA片段，也往往具有互補的單鏈延伸末端

1.4

II型限制性核酸內切酶的基本特性第17頁/共85頁識別雙鏈DNA分子中4-8對堿基的特定序列大部分酶的切割位點在識別序列內部或兩側識別切割序列呈典型的旋轉對稱型回文結構EcoRI的切割位點EcoRI的識別序列5′…GCTGAATTCGAG…3′3′…CGACTTAAGCTC…5′對稱軸Cleavagesites第18頁/共85頁EcoRI等產(chǎn)生的5′粘性末端EcoRⅠ37℃第19頁/共85頁PstI等產(chǎn)生的3′粘性末端5′…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3′3′…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5′PstI37℃5′…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3′3‘…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’第20頁/共85頁PvuII等產(chǎn)生的平頭末端5′…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3′3′…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5′PvuII37℃5′…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3′3′…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5′第21頁/共85頁1.5同裂酶和同尾酶同裂酶(isochizomer):也叫同切點酶，異源同工酶，這類酶識別相同的序列，但是切割點不一定在同一點上。同尾酶(isocaudamer)：是一類來源不同中，識別序列也不同，但對DNA切割所產(chǎn)生的粘性末端相同的一類酶。第22頁/共85頁Sau3AⅠ和BamHⅠ同尾酶所形成的雜種位點對Sau3AⅠ敏感，但不是BamHⅠ的識別位點識別雜種位點(hybridsite):雜種位點一般不能被原來的任何一種同尾酶所識別。由一對同尾酶所產(chǎn)生的粘性末端共價結合形成的位點。不過也有例外：BamHⅠ

來自BacillusamyloliquefaciensH解淀粉芽孢桿菌Sau3AⅠ

來自Staphylococcusaureus3A(J.S.Sussenbach)金黃色葡萄球菌第23頁/共85頁第24頁/共85頁1.6

限制片段末端的連接作用由限制酶產(chǎn)生的具粘性末端的DNA片段間的連接作用有兩種不同的類型不同的DNA片段通過互補的粘性末端之間的堿基配對而彼此連接起來①分子間的連接：AATTC------G3′G------CTTAA5′5′AATTC------G3′G------CTTAA5′AATTC------G3′G------CTTAAAATTC------G3′G------CTTAA5′T4ligase第25頁/共85頁由同一片段的2個互補末端之間的堿基配對而形成的環(huán)形分子。②分子內的連接：T4ligase第26頁/共85頁1.7大部分II型核酸內切酶需要相似的反應條件Tris-HCl50mMpH7.5MgCl210mMNaCl0-150mMDTT1mMVolume20-100μlTep.andTime37℃,1-1.5hr0-50mM低鹽酶100mM中鹽酶150mM高鹽酶1U核酸內切酶的酶活性：在最佳反應條件下反應1小時，完全水解1μg標準DNA所需的酶量第27頁/共85頁1.8影響核酸內切限制酶活性的因素①

DNA的純度蛋白質、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等加大酶的用量，1mgDNA用10U酶加大反應總體積延長反應時間第28頁/共85頁②

DNA樣品的甲基化程度大腸桿菌中的dam甲基化酶在5′GATC3′序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影響的酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影響大腸桿菌中的dcm甲基化酶在5′CCAGG3′或5′CCTGG3′序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影響的酶有EcoRII等哺乳動物中的甲基化酶在5′CG3′序列中的C5位上引入甲基第29頁/共85頁③酶切消化反應溫度不同酶之間所需最適反應溫度不同，且彼此間有相當大的變動范圍。大多數(shù)酶標準反應溫度都是37℃。例外：SmaⅠ25℃ApaⅠ30℃MaeⅠ45℃TaqⅠ65℃第30頁/共85頁④

DNA的分子結構

DNA分子的不同構型對核酸內切限制酶的活性也有很大的影響。某些核酸內切限制酶切割超盤旋的質粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化線性DNA的高出許多倍，最高的可達20倍。此外，還有一些核酸內切限制酶，切割它們自己的處于不同部位的限制位點，其效率亦有明顯的差別。第31頁/共85頁⑤核酸內切限制酶的緩沖液核酸內切酶的標準緩沖液的組份包括：氯化鎂、氯化納或氯化鉀、Tris-HCl，?-巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白（BSA）等。酶活性的正常發(fā)揮，是絕對地需要二價的陽離子，通常是Mg2+。不正確的NaCl或Mg2+濃度，不僅會降低限制酶的活性，而且還可能導致識別序列特異性的改變。第32頁/共85頁緩沖液Tris-HCl的作用在于使反應混合物的pH恒定在酶活性所要求的最佳數(shù)值的范圍之內。對絕大多數(shù)限制酶來說，在pH=7.4的條件下，其功能最佳。巰基試劑對于保持某些核酸內切限制酶的穩(wěn)定性是有用的，而且還可保護其免于失活。但它同樣也可能有利于潛在污染雜質的穩(wěn)定性第33頁/共85頁有一部分核酸內切限制酶對于鈉離子或鉀離子濃度變化反應十分敏感而另一部分核酸內切限制酶則可適應較廣的離子強度的變化幅度BSA的作用酶保護劑，在反應中保證酶具有最佳的活性第34頁/共85頁高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強度、極端pH值等，會使一些核酸內切酶的識別和切割序列發(fā)生低特異性，即所謂的星號活性（Staractivity）現(xiàn)象EcoRI在正常條件下識別并切割5′GAATTC3′序列，但在甘油濃度超過5%（v/v）時，也可切割5′PuPuATPyPy3′或者5′AATT3′第35頁/共85頁不同的酶生產(chǎn)廠家適合各種不同反應的緩沖液TakaraNEBLTI(Gibcol-BRL)PromegaRocheMBI華美第36頁/共85頁Takara美國總部：Beverly,MA第37頁/共85頁緩沖液成份(1x)：NEBuffer1(黃色)：

10mMBisTris丙烷-HCl,10mMMgCl2,1mMDTT(pH7.025°C)。NEBuffer2(藍色)：10mMTris-HCl,10mMMgCl2,50mMNaCl,1mMDTT(pH7.925°C)。NEBuffer3(紅色)：50mMTris-HCl,10mMMgCl2,100mMNaCl,1mMDTT(pH7.925°C)。NEBuffer4(綠色)：20mMTris-Ac,10mMMg（Ac）2,50mMKAc,1mMDTT(pH7.925°C)。NEB緩沖液第38頁/共85頁NEB稀釋緩沖液成份：

稀釋液A：

50mMKCl,10mMTris-HCl,0.1mMEDTA,1mMDTT,200μg/mlBSA和50%甘油(pH7.425°C)。

稀釋液B：

300mMNaCl,10mMTris-HCl,0.1mMEDTA,1mMDTT,500μg/mlBSA和50%甘(pH7.425°C)。

稀釋液C：

250mMNaCl,10mMTris-HCl,0.1mMEDTA,1mMDTT,0.15%TritonX-100,200μg/mlBSA和50%甘油(pH7.425°C)。第39頁/共85頁第40頁/共85頁第41頁/共85頁ATP依賴的DNA連接酶NAD＋依賴的DNA連接酶大多數(shù)原核生物DNA連接酶真核生物和病毒DNA連接酶，如T4DNA連接酶、真核生物DNA連接酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ2

DNA連接酶第42頁/共85頁DNA連接酶（ligase）：在一條DNA鏈的3′末端具有一個游離的羥基（-OH），和在另一條DNA鏈的5′-末端具有一個磷酸基團（-P）的情況下，能夠催化在2條DNA鏈之間形成的磷酸二酯鍵第43頁/共85頁第44頁/共85頁用于共價連接DNA限制片段的連接酶有兩種不同的來源由Ecoli染色體編碼的DNA連接酶由EcoliT4噬菌體DNA編碼的T4DNA連接酶用NAD+作能源輔助因子ATP作能源輔助因子第45頁/共85頁第46頁/共85頁第47頁/共85頁DNA連接酶的反應條件Tris-HCl50-100mMpH7.5MgCl210mMATP0.5-1mMDTT5mMVolume10-20μlTep.andTime4-15℃,4-16hr1UDNA連接酶的酶活性：在最佳反應條件下15℃反應1小時，完全連接1μgλDNA（HindIII片段）所需的酶量第48頁/共85頁平末端DNA片段的連接操作從分子動力學的角度講，由限制性核酸內切酶創(chuàng)造的粘性末端的連接屬于分子內部的連接，而平末端的連接則屬于分子間的連接，因此后者反應速度要慢得多提高平末端連接效率的方法包括：加大連接酶用量（10倍大于粘性末端的連接）加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機會加入10%PEG8000，促進大分子之間的有效作用加入單價陽離子（NaCl），最終濃度150-200mM第49頁/共85頁常用的平末端DNA片段連接法，主要有同聚物加尾法、銜接物連接法及接頭連接法

同聚物加尾法

第50頁/共85頁銜接物連接法銜接物（linker），是指用化學方法合成的一段由10～12個核苷酸組成、具有一個或數(shù)個限制酶識別位點的平末端的雙鏈寡核苷酸短片段。第51頁/共85頁DNA接頭，是一類人工合成的一頭具某種限制酶粘性末端另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片段。第52頁/共85頁3

DNA聚合酶分子生物學研究工作中經(jīng)常使用的DNA聚合酶第53頁/共85頁功能：對復制中的錯誤進行校讀，對復制和修復中出現(xiàn)的空隙進行填補。DNA-polⅠ（109kD）第54頁/共85頁323個氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

605個氨基酸DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠ第55頁/共85頁Klenow片段的用途：Klenow片段是實驗室合成DNA，進行分子生物學研究中常用的工具酶。

a補齊DNA3′隱縮未端b標記DNA片段未端ccDNA合成第二鏈dDNA測序第56頁/共85頁DNA分子的單鏈缺口上，DNA聚合酶Ⅰ的5′→3′核酸外切酶活性和聚合作用可以同時發(fā)生。當外切酶活性從缺口的5′端移去一個5′核苷酸之后，聚合作用就會在缺口的3′端補上一個新的核苷酸。5′端的核苷酸不斷地被移去，3′端的核苷酸又按序地增補，于是缺口便沿著DNA分子合成的方向移動。這種移動特稱為缺口轉移（nicktranslation）

第57頁/共85頁T4-DNA聚合酶T4-DNA酶的基本特性：5′→3′的DNA聚合酶活性和3′→5′的核酸外切酶活性在無dNTP時，可以從任何3‘-OH端外切在只有一種dNTP時，外切至互補核苷酸暴露時停止在四種dNTP均存在時，聚合活性占主導地位第58頁/共85頁T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸內切酶產(chǎn)生的3′粘性末端5′…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3′3′…C-G-A-G-P

HO-A-C-G-T-C-C-T-C…5′T4-DNA聚合酶5′…G-C-T-C-OH

P-G-G-A-G…3′3′…C-G-A-G-P

HO-C-C-T-C…5′注意：該酶也能降解雙鏈DNA，只是其活性比單鏈降解活性低很多第59頁/共85頁T4-DNA聚合酶的基本用途：DNA片段的同位素末端標記5′G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3′3′C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5′T4-DNApol5′G-C-T-C-A-G-C-T-G-OHHO-T-C-G-A-C-C-T-C-A5′T4-DNApol5′G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T-OH3′3′HO-C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5′32P-dNTP第60頁/共85頁第61頁/共85頁第62頁/共85頁第63頁/共85頁4依賴于RNA的DNA聚合酶（反轉錄酶）反轉錄酶的基本特性：以RNA為模板聚合cDNA鏈3′AAAAAAAAAAAAAA5′mRNA5′TTTTTTTTTTTToligo(dT)12-18反轉錄酶Mg2+

dNTP3′AAAAAAAAAAAAAA5′mRNA5′TTTTTTTTTTTTTTTT3′cDNA第64頁/共85頁反轉錄酶的基本特性：雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈3′5′mRNA5′3′cDNA3′5′mRNA5′3′cDNA反轉錄酶5′3′cDNA反轉錄酶第65頁/共85頁5核酸酶5.1核酸外切酶VII（ExoVII）大腸桿菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+3′5′5′3′3′5′5′3′ExoVIIExoVIIExoVII第66頁/共85頁大腸桿菌核酸外切酶Ⅶ包括兩個亞基組成單位，它們分別為xseA和xseB基因的編碼產(chǎn)物。它能夠從5′-末端或3′-末端降解DNA分子，產(chǎn)生出寡核苷酸短片段。第67頁/共85頁5.2核酸外切酶III（ExoIII）3′5′5′3′ExoⅢMg2+

dNTP5′3′3′5′核酸外切酶Ⅲ，系由大腸桿菌xthA基因編碼的單體蛋白質。第68頁/共85頁核酸外切酶Ⅲ的主要活性是，按3′→5′的方向催化雙鏈DNA自3′-OH末端釋放5′-單核苷酸通過其3′→5′活性使雙鏈DNA分子產(chǎn)生出單鏈區(qū)第69頁/共85頁5.3

λ核酸外切酶（λexo）λ核酸外切酶最初是從感染了λ噬菌體的大腸桿菌細胞中純化出來的。這種酶催化雙鏈DNA分子自5′-P末端進行逐步的加工和水解，釋放出5′單核苷酸，但它不能降解5′-OH末端第70頁/共85頁將雙鏈DNA轉變成單鏈的DNA，供雙脫氧法進行DNA序列分析使用從雙鏈DNA中移去5′突出末端，以便用末端轉移酶進行加尾λ核酸外切酶的用途第71頁/共85頁5單鏈核酸內切酶5.1

S1核酸酶

S1核酸酶，是一種高度單鏈特異的核酸內切酶，在最適的酶催反應條件下，降解單鏈DNA的速率要比雙鏈DNA的快75000倍需要低水平的Zn2+離子，最適pH值4.0～4.3第72頁/共85頁催化RNA和單鏈DNA分子降解成為5′單核苷酸。S1核酸酶的主要功能同時它也能作用于雙鏈核酸分子的單鏈區(qū)，并從此處切斷核酸分子。第73頁/共85頁Bal31核酸酶既具有單鏈特異