基因工程的原理和技術(shù)正式

基因工程的原理和技術(shù)正式第1頁/共45頁要想將某個特定基因與質(zhì)粒相連，需要用幾種限制性核酸內(nèi)切酶？思考題：第2頁/共45頁TGCAACGTACGTGCAT第3頁/共45頁ACGTGCAG標記基因ACGTGCAT外源基因ACGTGCAT重組質(zhì)?；蛑亟MDNA第4頁/共45頁傳統(tǒng)的生產(chǎn)胰島素的方法只能從豬和羊的胰腺中提取,獲得1g胰島素大約需要100Kg的豬胰臟糖尿病治療1978年,科學家在大腸桿菌中成功表達了人胰島素,并于1982年被美國批準上市基因工程的基本原理

讓人們感興趣的基因（目的基因）在宿主細胞中穩(wěn)定和高效表達。第5頁/共45頁第6頁/共45頁基因工程的基本操作程序1、獲得目的基因2、形成重組DNA分子3、將重組DNA分子導(dǎo)入受體細胞4、篩選含有目的基因的受體細胞5、目的基因的表達剪切拼接導(dǎo)入篩選表達第7頁/共45頁目前被較廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、人胰島素基因、人干擾素基因、種子貯藏蛋白基因、植物抗病基因等?；虿僮鞯幕静襟E一、提取目的基因——將需要的基因從供體生物

的細胞內(nèi)提取出來。供體生物細胞取出DNA用限制酶剪去多余部分目的基因限制酶第8頁/共45頁目的基因的序列未知1、從基因文庫中獲取目的基因的序列已知2、利用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)擴增3、人工合成獲取目的基因的常用方法：第9頁/共45頁

1、基因文庫的構(gòu)建——直接分離法（或鳥槍法）該法最大的缺點是帶有很大的盲目性，工作量大，成功率低。且不能將真核生物的基因轉(zhuǎn)移到原核生物中去。第10頁/共45頁2、利用PCR技術(shù)擴增目的基因

聚合酶鏈式反應(yīng)，在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)?？梢垣@得大量的目的基因。PCR擴增儀第11頁/共45頁氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。在酶的作用下，不斷延伸，合成雙鏈DNA。多次循環(huán)，獲得大量雙鏈DNA分子。PCR技術(shù)擴增第12頁/共45頁目的基因的mRNA逆轉(zhuǎn)錄單鏈DNA合成雙鏈DNA（目的基因）蛋白質(zhì)氨基酸序列推測mRNA的核苷酸序列推測結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列化學合成目的基因人工合成法逆轉(zhuǎn)錄法根據(jù)已知氨基酸序列直接合成DNA第13頁/共45頁二、形成重組DNA分子——

核心質(zhì)粒DNA分子限制酶處理兩個切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種一個切口兩個黏性末端第14頁/共45頁目的基因與質(zhì)粒的連接第15頁/共45頁三、將重組DNA分子導(dǎo)入受體細胞（1）常用的受體細胞：有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動植物細胞等。探究：轉(zhuǎn)基因過程中，怎樣選擇受體細胞？

轉(zhuǎn)基因植物——

轉(zhuǎn)基因動物——

轉(zhuǎn)基因微生物——植物體細胞或受精卵受精卵大腸桿菌、枯草桿菌、酵母菌等第16頁/共45頁探究：為什么常用微生物作為受體細胞？

目的基因?qū)胧荏w細胞后，就可以隨著受體細胞的繁殖而復(fù)制，由于細菌繁殖的速度非常快，在很短的時間內(nèi)就能夠獲得大量的目的基因。微生物可通過發(fā)酵大量繁殖。第17頁/共45頁（2）將目的基因?qū)胛⑸锛毎荏w細胞：細菌氯化鈣

細胞壁的通透性增大重組質(zhì)粒進入受體細胞目的基因隨受體細胞的繁殖而復(fù)制第18頁/共45頁將目的基因?qū)胫参锛毎r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法第19頁/共45頁

基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將包裹在金屬顆粒表面的表達載體DNA打入受體細胞中，使目的基因與其整合并表達的方法。第20頁/共45頁第21頁/共45頁將目的基因?qū)雱游锛毎@微注射技術(shù)提純基因表達載體體外顯微注射入受精卵受精卵移植第22頁/共45頁1.將目的基因?qū)胫参锛毎r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法2.將目的基因?qū)雱游锛毎@微注射技術(shù)（最多、最有效）3.將目的基因?qū)胛⑸锛毎鸆a2+處理，以增加細菌細胞壁的通透性。第23頁/共45頁探究：如何把導(dǎo)入了目的基因的受體細胞篩選出來？1）原理：2）方法：3）舉例所有受體細胞接種含有四環(huán)素的培養(yǎng)基篩選生活的受體細胞導(dǎo)入重組DNA分子（抗四環(huán)素基因）培養(yǎng)含重組DNA分子的受體細胞四、篩選有目的基因的受體細胞質(zhì)粒上有抗生素的抗性基因利用選擇培養(yǎng)基篩選第24頁/共45頁篩選含有目的基因的受體細胞前三步的處理十分繁鎖，為保證目的基因得到有效利用，通常用大量的受體細胞來接受不多的目的基因。這樣，處理的受體細胞中真正攝入了目的基因的很少，必須將它從中檢測出來。無表達產(chǎn)物無表達產(chǎn)物有表達產(chǎn)物無表達產(chǎn)物細菌的檢測，將每個受體細胞單獨培養(yǎng)形成菌落，檢測菌落中是否有目的基因的表達產(chǎn)物。淘汰無表達產(chǎn)物的菌落，保留有表達產(chǎn)物的進一步培養(yǎng)、研究。第25頁/共45頁多細胞生物的檢測，將每個受體細胞單獨培養(yǎng)并誘導(dǎo)發(fā)育成完整個體，檢測這些個體是否攝入目的基因，攝入的基因是否表達（是否表現(xiàn)出相應(yīng)的性狀）。淘汰無變化的個體，保留有相應(yīng)變化的個體進一步培養(yǎng)、研究。例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達。第26頁/共45頁受體細胞攝入DNA分子后就說明目的基因一定能完成表達嗎？含有目的基因的受體細胞不一定都能表達。(五)目的基因的表達看到目的性狀或分離到目的基因表達產(chǎn)物

外源基因在受體細胞內(nèi)表達的理論基礎(chǔ)基因是控制生物性狀的基本單位生物界共用一套遺傳密碼遺傳信息的傳遞都遵循中心法則的信息流動方向第27頁/共45頁人胰島素原基因在大腸桿菌中只能表達和人胰島素原，要經(jīng)進一步的加工后才能獲得具生物活性的胰島素。第28頁/共45頁甲生物乙生物取出優(yōu)秀基因“剪切”

“拼接”

新類型表達新的生物產(chǎn)品基因敲除技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)生物新類型敲除不利基因新的生物產(chǎn)品第29頁/共45頁能力提升：人的糖蛋白必須經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體進一步加工合成，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可以使人的糖蛋白基因得以表達的受體細胞是（）A大腸桿菌B酵母菌CT4噬菌體D質(zhì)粒DNAB第30頁/共45頁知識延伸——DNA分子雜交技術(shù)

該方法是根據(jù)堿基互補配對原則，把互補的雙鏈DNA解開，把單股的DNA小片段用同位素、熒光分子或化學發(fā)光催化劑等進行標記，之后同被檢測的DNA中的同源互補序列雜交，從而檢出所要查明的DNA或基因。第31頁/共45頁基因探針（DNA探針）與目的基因雜交，有無雜交帶第32頁/共45頁基因工程的基本操作程序目的基因的獲取形成重組DNA分子；將目的基因?qū)胧荏w細胞篩選含有目的基因的受體細胞和目的基因表達1、從基因文庫中獲取目的基因2、利用PCR技術(shù)擴增目的基因3、化學方法人工合成農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、顯微注射法、Ca2+處理法DNA分子雜交技術(shù)、抗原—抗體雜交技術(shù)分子檢測外的個體水平鑒定四、本節(jié)小結(jié)：第33頁/共45頁例如：將每個受體細胞單獨培養(yǎng)形成菌落，檢測菌落中是否有目的基因的表達產(chǎn)物。淘汰無表達產(chǎn)物的菌落，保留有表達產(chǎn)物的進一步培養(yǎng)、研究。無表達產(chǎn)物無表達產(chǎn)物有表達產(chǎn)物無表達產(chǎn)物第34頁/共45頁1、用基因工程技術(shù)可使大腸桿菌合成人的蛋白質(zhì)。下列敘述不正確的是A．常用相同的限制性內(nèi)切酶處理的基因和質(zhì)粒B．DNA連接酶和RNA聚合酶是構(gòu)建重組質(zhì)粒必需的工具酶C．可用含抗生素的培養(yǎng)基檢測大腸桿菌中是否導(dǎo)入了重組質(zhì)粒D．導(dǎo)入大腸桿菌的目的基因不一定能成功表達B鞏固練習第35頁/共45頁2下列屬于獲取目的基因的方法的是()①利用mRNA反轉(zhuǎn)錄形成 ②從基因組文庫中提?、蹚氖荏w細胞中提取 ④利用PCR技術(shù)⑤利用DNA轉(zhuǎn)錄 ⑥人工合成A．①②③⑤B．①②⑤⑥ C．①②③④ D．①②④⑥D(zhuǎn)第36頁/共45頁3基因工程又叫基因拼接技術(shù)。

(1)在該技術(shù)中，用人工合成方法獲得目的基因的途徑之一是：以目的基因轉(zhuǎn)錄的

為模板，

成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成

。

(2)基因工程中常用的受體細胞有細菌、真菌、

。

(3)假設(shè)以大腸桿菌質(zhì)粒作為運載體，并以同一種限制性內(nèi)切酶切割運載體與目的基因，將切割后的運載體與目的基因片段混合，并加入DNA連接酶。連接產(chǎn)物至少有

種環(huán)狀DNA分子，它們分別是

。信使RNA

逆轉(zhuǎn)錄

雙鏈DNA(目的基因)動植物細胞

3

運載體自連的、目的基因片段自連的、運載體與目的基因片段相連的環(huán)狀DNA分子第37頁/共45頁4如何利用目的基因，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得抗寒能力提高的香蕉植株？在運用轉(zhuǎn)基因香蕉的過程中，在生態(tài)安全方面可能會出現(xiàn)什么問題？（列舉兩點）將目的基因插人土壤農(nóng)桿菌的質(zhì)粒，構(gòu)建表達載體，通過農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化導(dǎo)人香蕉受體細胞，成功轉(zhuǎn)化的香蕉細胞通過組織培養(yǎng)形成植株。生態(tài)安全問題包括：①外源基因擴散到其他物種（外源基因漂移）；②轉(zhuǎn)基因植株擴散影響生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能；③轉(zhuǎn)基因植株擴散對生物多樣性的影響；④轉(zhuǎn)基因植物殘體或分泌物對環(huán)境的影響。第38頁/共45頁剪切拼接導(dǎo)入表達（一）獲得目的基因（二）形成重組DNA分子（三）將重組DNA分子導(dǎo)入受體細胞(四)篩選含有目的基因的受體細胞(五)目的基因的表達

四、基因工程的基本操作步驟第39頁/共45頁步驟一獲得目的基因人工合成利用PCR技術(shù)擴增已知序列：從基因文庫獲得未知序列：(DNAlibrary)聚合酶鏈式反應(yīng)(PolymeraseChainReaction)化學合成第40頁/共45頁鳥槍法供體細胞DNA限制酶許多DNA片段載入運載體導(dǎo)入受體細胞擴增產(chǎn)生特定性狀分離目的基因從基因文庫獲得第41頁/共45頁PCR技術(shù)原理：前提：條件方式DNA復(fù)制一段已知目的基因的核苷酸序列：以_____方式擴增，即____（n為擴增循環(huán)的次數(shù)）指數(shù)2n模板DNA、兩個DNA引物、四種脫氧核苷酸、熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）第42頁/共45頁

過程變性、退火、延伸三步曲變性：加熱至90～95℃雙鏈DNA解鏈成為單鏈D