基因工程研究策略和實踐

基因工程研究策略和實踐第1頁/共62頁基因決定性狀青霉素能產生青霉菌家蠶能吐出蠶絲為人類利用第2頁/共62頁定向改造基因的設想1.能否讓細菌“吐出”蠶絲？2.能否讓微生物產生人胰島素、干擾素等昂貴藥物？經過多年的努力，科學家于20世紀70年代創(chuàng)立了可以定向改造生物DNA的技術-基因工程第3頁/共62頁基因工程的概念將獲取的目的基因片段在體外與載體DNA通過人工剪切、連接構成DNA重組體，將其導入受體細胞并使之無性繁殖（稱之為“克隆”）和表達，這種有目的的應用分子克隆技術,人為的改造基因、改變生物的遺傳性狀的系列過程,總稱為基因工程?；蚬こ虅e名DNA重組技術操作環(huán)境生物體外操作對象基因操作水平DNA水平基本過程剪切→拼接→導入→表達結果人類需要的基因產物第4頁/共62頁基因工程過程示意圖①從細胞中分離出DNA①②③④⑤⑥②限制酶截取DNA片斷③提取大腸桿菌中的質粒④DNA重組⑤用重組質粒轉化大腸桿菌⑥培養(yǎng)大腸桿菌克隆大量基因/使其表達③③第5頁/共62頁基因工程的研究策略一、目的基因的分離(donorDNA)二、載體DNA及其改造(VectorDNA)三、體外DNA重組(DNArecombination)四、重組DNA的轉化(Transformation)五、重組體的篩選鑒定與克隆擴增

(identification&cloneamplification)六、目的DNA在受體細胞中的表達(geneexpression)第6頁/共62頁一、目的基因的分離從cDNA文庫中分離目的基因從基因組DNA文庫中分離目的基因PCR擴增目的基因片段化學方法人工合成基因第7頁/共62頁mRNA

cDNA

雙鏈cDNA

重組DNA分子

cDNA文庫

逆轉錄酶載體受體菌復制1.從cDNA文庫中分離目的基因逆轉錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT第8頁/共62頁cDNA文庫僅包含正在表達的基因不同物種、不同組織的cDNA文庫不相同基因總量少，易篩選第9頁/共62頁組織或細胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉化菌限制性內切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉化細胞內由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合2.從基因組DNA文庫獲取目的基因第10頁/共62頁包含所有遺傳信息構建難度大（單拷貝基因、長片段基因）篩選難度大用于研究基因在基因組中的情況第11頁/共62頁3、PCR擴增目的基因片段適用于克隆序列清楚的基因以基因組DNA為模板，直接進行PCR擴增較難多采用以mRNA為模板的RT-PCR法PCR擴增儀第12頁/共62頁4.化學合成法獲取較短的目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列第13頁/共62頁二、載體DNA載體(Vector)載體是目的基因的運載工具，其作用是將目的基因帶入受體細胞中，并使目的基因擴增和表達。常用載體

質粒病毒載體噬菌體

粘性質粒/粘粒

第14頁/共62頁載體的選擇標準有復制起點，能自主復制；具有篩選標記，便于重組體的篩選和鑒定；具有一種或多種限制性內切酶的單一切割位點，并在位點中插入外源基因后，不影響其復制功能；分子量小，以容納較大的外源DNA。表達型載體還應具有與宿主細胞相適應的啟動子、增強子、加尾信號等基因表達元件。第15頁/共62頁克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴增而特意設計的載體稱為克隆載體。表達載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉錄翻譯成多肽鏈而特意設計的載體稱為表達載體。載體的分類-按作用分第16頁/共62頁穿梭載體(shuttIevector)

又稱雙功能載體(bifunctionalvector)。能在兩種不同的生物體內復制和往來穿梭的載體。其可同時具有細菌質粒的復制原點和真核生物可識別的病毒復制原點或酵母菌的自主復制序列（ARS），它即能在原核細胞中擴增又能在真核細胞中復制和表達。主要用于原核細胞與真核細胞之間進行基因轉移，通常是將載體和待克隆的真核生物DNA片段先在細菌中克隆，再轉移到真核細胞中表達，并可提高外源基因的表達效率。如pKSV一10、pJDB219載體等。第17頁/共62頁載體的分類-按來源分

質粒(plasmidvector)

病毒(virusvector)

噬菌體(phagevector)

粘性質粒/粘粒(cosmidvector)

第18頁/共62頁1.質粒載體:

(1)分子量較小，在細菌中有較多的拷貝數(shù)。(2)松馳型。(3)具有一個以上的標志，便于篩選。(4)具有數(shù)個或一個單一的酶切點。天然的質粒不能具備以上所有條件，所以實際應用的都是人工構建的質粒，其中最常用的是pBR322,pUC19.，第19頁/共62頁常用的質粒載體pBR322pUC118/119第20頁/共62頁2．病毒載體（1）整合型載體：外源基因通過這種病毒載體與宿主細胞的染色體整合，外源基因隨宿主細胞基因組的復制而擴增。（2）游離型載體：能夠以病毒顆粒的形式在宿主內自行復制或在輔助病毒存在下進行復制。如：腺病毒。第21頁/共62頁3.λ噬菌體載體

現(xiàn)用的λ噬菌體載體都是在野生型基礎上改造而成的。改建之后的常用載體有兩類：①插入型載體，具有一個可供外源DNA插入的克隆位點，只能插入較小的外源DNA片段(＜10kb)。如λgt10、λgt11；②替換型載體，具有成對的克隆位點，在兩個位點之間的λDNA區(qū)段可被外源插入的DNA片段取代，能插入較大的外源DNA片段(20-24kb左右)。如charon4、charon10。第22頁/共62頁4.Cosmid質粒

由λDNAcos區(qū)與質粒重組建造而成。在宿主細胞中可以作為正常噬菌體進行復制，但不表達噬菌體的任何功能。分子量小（約4—6kb），可容納大至40-50kb的外源DNA片段。適用于構建真核細胞的基因文庫。如cosmidpHC79第23頁/共62頁三、體外DNA重組概念：

不同來源的DNA片段共價連接、通過重新組合構成了具有兩個DNA分子遺傳信息的新重組體DNA分子的過程。分類：粘末端連接平齊末端連接法同聚物核苷酸末端法人工接頭連接T-A克隆第24頁/共62頁限制性內切酶―“分子剪刀”Ⅱ型限制性內切酶，能專一地識別DNA分子上特定的堿基序列并將DNA切斷的內切酶。識別序列的特點；(I)專一；(2)常由4–6個堿基組成；(3)具有回文序列經切割可以生成平頭末端或粘性末端?？梢援a生相同粘性末端的不同的限制酶稱作同尾酶。第25頁/共62頁第26頁/共62頁DNA連接酶―“分子針線”連接雙鏈DNA分子中相鄰3’-OH和5’-磷酸基之間的磷酸二酯鍵的形成。最常用的是T4連接酶，可以連接粘性末端和平頭末端。第27頁/共62頁1.粘末端連接（a）目的基因和載體用同一種限制酶切割后連接。載體易自身環(huán)化。用堿性磷酸酶(能除掉DNA-5’端P基團，使5’端帶一OH)處理載體，可防止載體自身環(huán)化。

（b）目的基因和載體用兩種產生粘末端的限制酶切割后連接，可控制目的基因的插入方向(定向克隆)第28頁/共62頁BamHⅠ切割反應

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點連接第29頁/共62頁不同限制酶切位點的連接EcoRⅠ切割位點Bg

lⅡ切割位點+EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體第30頁/共62頁2.平齊末端連接優(yōu)點：可連接任何一對DNA可恢復一個酶切位點或產生一個新酶切位點缺點：連接率低要求連接酶及底物濃度高GAAＴＴＣＣＴＴＡＡＧGAAＴＴＣ第31頁/共62頁

3.同聚物核苷酸末端法

在DNA或RNA分子末端的一段同聚物核苷酸延伸。應用末端轉移酶在DNA片段3′末端制備粘末端。避免自身環(huán)化互補序列較長時（>4bp)，不需連接酶第32頁/共62頁

第33頁/共62頁4.T-A克隆T-vector兩條鏈的5’端含有一個游離的TPCR過程中增加延伸時間，Taq酶可在產物的3’端多加一個A第34頁/共62頁受體菌條件安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)

導入方式轉化(transformation)轉染(transfection)感染(infection)四、重組DNA的轉化第35頁/共62頁1.基本概念轉化（transformation）：把以質粒為載體構建的重組DNA，在一定條件下引入受體細胞的過程。轉染（transfection）：以噬菌體或病毒構建的重組DNA引入受體細胞的過程。感染（infection）：病毒或重組病毒DNA進入細胞的過程。轉化子：又稱工程菌，即接受了重組DNA的受體菌。第36頁/共62頁2.受體細胞感受態(tài)感受態(tài)(competent)

：細胞最易攝取和“容忍”外來DNA的生理狀態(tài)。致敏：誘導細胞進入感受態(tài)的操作。第37頁/共62頁３．轉化動物細胞常用的方法

1.磷酸鈣共沉淀法；2.DEAE-葡聚糖或聚陽離子促進吸收法；3.脂質體轉染法；4.電穿孔法；5.病毒轉染法；6.顯微注射法。

第38頁/共62頁五、重組體篩選、鑒定與克隆擴增第39頁/共62頁平板篩選插入失活插入表達電泳篩選PCR篩選核酸雜交DNA測序免疫學檢測法1.常用篩選/鑒定陽性重組體的方法初步篩選精確鑒定表型鑒定第40頁/共62頁1.平板篩選法（1）插入失活（insertionalinactivation)：在載體某個基因序列的限制性內切酶位點上插入外源DNA后，使該基因失去活性，從而不能表達其相應的功能。常以此現(xiàn)象作為標記，篩選被這種重組體轉化的細胞。第41頁/共62頁第42頁/共62頁(插入失活法)抗藥性標記選擇1.

Amps

Tets

（轉化失?。?.

Ampr

Tetr

（轉化成功，但僅轉入載體，無重組）3.Ampr

Tets

（轉化、重組均成功）第43頁/共62頁（2）插入表達（insertionalexpression)

載體設計時，在篩選標志基因前連接一段負調控序列（抑制作用），當目的基因在此插入時，使其對下游的抑制作用喪失，從而下游的篩選標志得到表達。第44頁/共62頁CI為負控制序列（抑制Ter表達）當DNA插入使CI失活Ter表達，由此作為陽性克隆的篩選。第45頁/共62頁

2.酶切-電泳法篩選

經初篩鑒定有重組子的菌落，小量培養(yǎng)后再抽提出重組質?；蛑亟M噬菌體DNA,用相應的內切酶切割，電泳后根據(jù)DNA分子大小不同，鑒別真正重組體DNA，排除假陽性和載體自我連接載體雙重體。該法不能鑒別插入片段大小相似的非目的基因片段的假陽性。第46頁/共62頁

聯(lián)合酶切鑒定同源末端連接重組子中

DNA插入片段的方向ＢＢ第47頁/共62頁3.PCR法篩選

提取重組質粒DNA，用已知的特異引物擴增，擴增產物進行凝膠電泳檢測有無相應電泳帶。第48頁/共62頁4.核酸分子雜交（hybridization）兩條不同來源的含有互補核苷酸序列的單鏈核酸分子，通過堿基配對規(guī)律形成一個新的穩(wěn)定的雙鏈核酸分子的過程菌落原位雜交（HybridizationinSitu）（以細菌為受體細胞）使用與目的DNA互補的探針鑒別陽性轉化菌第49頁/共62頁菌落原位雜交法篩選復印至硝酸纖維素膜上用NaOH菌體裂解DNA變性雜交放射自顯影32P-cDNA與放射性cDNA雜交的菌落的斑點細菌菌落單鏈DNA結合到膜上第50頁/共62頁5.DNA測序測序：確定DNA鏈上確切的堿基順序方法：對初步篩選的陽性重組子，擴增后抽提質粒，酶切回收片斷，進行DNA測序確認。

6.免疫學檢測法鑒定表達產物

依據(jù)抗原、抗體特異性結合反應的原理，以單克隆抗體對表達產物進行特異性檢測。第51頁/共62頁六、目的DNA在受體細胞中的表達第52頁/共62頁

基因工程表達系統(tǒng)大腸桿菌系統(tǒng)枯草桿菌系統(tǒng)酵母細胞系統(tǒng)昆蟲細胞系統(tǒng)哺乳動物細胞系統(tǒng)原核表達系統(tǒng)真核表達系統(tǒng)第53頁/共62頁基因工程操作的主要步驟載體質粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNAcDNA人工合成PCR產物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉化體外包裝，轉染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交第54頁/共62頁重組DNA技術操作過程可形象歸納為小結分分離目的基因切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體轉轉入受體菌篩篩選重組體第55頁/共62頁基因工程的實踐1.利用重組酵母生產乙肝疫苗

乙肝病毒在體外細胞培養(yǎng)基中并不能生長，因此第一代的乙肝疫苗是從病毒攜帶者的肝細胞質膜上提取出來的。雖然這種質膜來源的疫苗具有較高的免疫原性，但其大規(guī)模生產受到病毒表面抗原來源的限制，而且提取物需要高度純化，純化