基因治療的原理與研究概況

基因治療的原理與研究概況第1頁/共90頁2023/3/142第2頁/共90頁狹義概念將具有正常功能的基因置換或增補患者體內(nèi)有缺陷的基因，從而達到治療疾病的目的。一、基因治療（Genetherapy）概念廣義概念將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，最終達到治療疾病的目的。2023/3/143第3頁/共90頁4基因治療分類體細胞(somaticcell)基因治療生殖細胞(germline)基因治療只限于某一體細胞的基因的改變只限于某個體的當代對缺陷的生殖細胞進行矯正當代及子代2023/3/14第4頁/共90頁5

一、基因治療的策略TheStrategyofGeneTherapy2023/3/14第5頁/共90頁6

（一）基因置換（genereplacement）

定義：指將特定的目的基因?qū)胩囟毎?，通過定位重組，以導入的正?；蛑脫Q基因組內(nèi)原有的缺陷基因。

目的：將缺陷基因的異常序列進行橋正。對缺陷基因的缺陷部位進行精確的原位修復，不涉及基因組的任何改變。2023/3/14第6頁/共90頁7又稱為基因打靶(genetargeting）定點整合的條件:轉(zhuǎn)導基因的載體與染色體上的DNA具有相同的序列。帶有目的基因的載體就能找到同源重組的位點，進行部分基因序列的交換，使基因置換這一治療策略得以實現(xiàn)。基因同源重組技術(shù)2023/3/14第7頁/共90頁8要實現(xiàn)基因置換，需要采用同源重組技術(shù)使相應的正?；蚨ㄏ?qū)胧荏w細胞的基因缺陷部位。定向?qū)氲陌l(fā)生率約1/100萬，采用胚胎干細胞培養(yǎng)的方法，這種同源重組的檢出率最高可達1/10。2023/3/14第8頁/共90頁9（二）基因添加

基因添加或稱基因增補（geneaugmentation）:通過導入外源基因使靶細胞表達其本身不表達的基因。類型:在有缺陷基因的細胞中導入相應的正?；?，而細胞內(nèi)的缺陷基因并未除去，通過導入正常基因的表達產(chǎn)物，補償缺陷基因的功能；向靶細胞中導入靶細胞本來不表達的基因，利用其表達產(chǎn)物達到治療疾病的目的。2023/3/14第9頁/共90頁10（三）基因干預基因干預（geneinterference）:采用特定的方式抑制某個基因的表達，或者通過破壞某個基因的結(jié)構(gòu)而使之不能表達，以達到治療疾病的目的。2023/3/14第10頁/共90頁11（四）自殺基因治療自殺基因治療:惡性腫瘤基因治療的主要方法之一。原理:將“自殺”基因?qū)胨拗骷毎?，這種基因編碼的酶能使無毒性的藥物前體轉(zhuǎn)化為細胞毒性代謝物，誘導靶細胞產(chǎn)生“自殺”效應，從而達到清除腫瘤細胞的目的。2023/3/14第11頁/共90頁12自殺基因的作用機制

2023/3/14第12頁/共90頁13?TK/GCV

單純皰疹病毒（herpssimplexvirus,HSV）Ⅰ型胸苷激酶（thymidinekinase,tk）基因編碼胸苷激酶，特異性地將無毒的核苷類似物丙氧鳥苷（ganciclovir,GCV）轉(zhuǎn)變成毒性GCV三磷酸核苷，后者能抑制DNA聚合酶活性，導致細胞死亡。?CD/5-FC

大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶（cytosinedeaminase,CD）基因，在細胞內(nèi)將無毒性5-氟胞嘧啶（5-FC）轉(zhuǎn)變成毒性產(chǎn)物5-氟尿嘧啶（5-FU）。1.自殺基因系統(tǒng)2023/3/14第13頁/共90頁14

旁觀者效應:“自殺基因”治療不僅使轉(zhuǎn)導了“自殺基因”的腫瘤細胞在用藥后被殺死，而且與其相鄰的未轉(zhuǎn)導“自殺基因”的腫瘤細胞也被殺死。

2.旁觀者效應2023/3/14第14頁/共90頁15（五）基因免疫治療通過將抗癌免疫增強細胞因子或MHC基因?qū)肽[瘤組織，以增強腫瘤微環(huán)境中的抗癌免疫反應。2023/3/14第15頁/共90頁16二、基因轉(zhuǎn)移技術(shù)

TheTechniqueofGeneTransfer2023/3/14第16頁/共90頁17基因治療的兩種途徑載體目的基因invivoexvivo靶細胞2023/3/14第17頁/共90頁18

基因轉(zhuǎn)移(genetransfer)技術(shù)：

1.病毒介導的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。2.非病毒介導的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。2023/3/14第18頁/共90頁19

1.病毒介導的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)

病毒載體介導的基因轉(zhuǎn)移效率較高，因此它也是使用最多的基因治療載體。據(jù)統(tǒng)計，有72%的臨床實驗計劃和71%的病例使用了病毒載體，其中用得最多的是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。2023/3/14第19頁/共90頁20Retrovirus

（1）逆轉(zhuǎn)錄病毒

2023/3/14第20頁/共90頁212023/3/14第21頁/共90頁22（1）兩端各有一長末端重復序列LTR。

逆轉(zhuǎn)錄病毒前病毒的結(jié)構(gòu)特點

（2）LTR由U3、R和U5三部分組成。（3）病毒有三個結(jié)構(gòu)基因（4）5ˊ端LTR下游有一段病毒包裝所必需的序列（ψ）及剪接供體位點(SD)和剪接受體位點(SA)。

（5）含有負鏈DNA轉(zhuǎn)錄的引物結(jié)合位點(PBS)和正鏈DNA轉(zhuǎn)錄的引物結(jié)合位點(PPT)。

(1)在U3內(nèi)有增強子和啟動子；

(2)U3和U5兩端分別有病毒整合序列(IS)

；(3)在R內(nèi)還有poly(A)加尾信號。

(1)gag基因，編碼核心蛋白和屬特異性抗原；(2)pol基因，編碼逆轉(zhuǎn)錄酶；(3)env基因，編碼病毒外殼或包膜糖蛋白(包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白)。

2023/3/14第22頁/共90頁232023/3/14第23頁/共90頁24逆轉(zhuǎn)錄病毒介導的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)

——由兩部分組成：

(1)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體

(2)輔助細胞株(如PA317)2023/3/14第24頁/共90頁25Retroviralpackagingsystem2023/3/14第25頁/共90頁26

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的特點

①逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜上由env編碼的糖蛋白，能夠被許多哺乳動物細胞膜上的特異性受體識別，從而使逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶的遺傳物質(zhì)高效地進入靶細胞。

②逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)基因gag、env和pol的缺失不影響其他部分的活性。

③前病毒可以高效整合至靶細胞基因組中，有利于外源基因在靶細胞中的永久表達。

④包裝好的假病毒顆粒（攜帶目的基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體）以芽生的方式分泌至輔助細胞培養(yǎng)的上清液中，易于分離制備。

2023/3/14第26頁/共90頁27

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的主要缺點

隨機整合，有插入突變、激活癌基因的潛在危險；逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的容量較小，只能容納7kb以下的外源基因。2023/3/14第27頁/共90頁28

（2）腺病毒(adenovirus，AV)載體

腺病毒是一種大分子(36kb)雙鏈無包膜DNA病毒。它通過受體介導的內(nèi)吞作用進入細胞內(nèi)，然后腺病毒基因組轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，保持在染色體外，不整合進入宿主細胞基因組中。

腺病毒是人類呼吸道感染的病原體，但目前尚未發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生有關(guān)聯(lián)。宿主細胞范圍廣，可感染分裂和非分裂終末分化細胞，如神經(jīng)元等。2023/3/14第28頁/共90頁292023/3/14第29頁/共90頁30腺病毒的優(yōu)點1.基因?qū)胄矢?，對人類安全?.宿主范圍廣；3.基因轉(zhuǎn)導與細胞分裂無關(guān)；4.重組腺病毒可通過口服經(jīng)腸道吸收、或噴霧吸入或氣管內(nèi)滴注；5.腺病毒載體容量較大，可插入7.5kb外源基因；2023/3/14第30頁/共90頁31

腺病毒載體缺點2.宿主的免疫反應導致腺病毒載體表達短暫。3.有兩個環(huán)節(jié)可能產(chǎn)生復制型腺病毒。4.靶向性差。

1.不能整合到靶細胞的基因組DNA中。分裂增殖快的細胞，導入的重組病毒載體，隨分裂而丟失的機會增多，表達時間相對較短。(1)腺病毒產(chǎn)生過程中與293輔助細胞內(nèi)E1區(qū)序列發(fā)生同源重組；(2)腺病毒載體與被治療的患者體內(nèi)已感染的野生型腺病毒，甚至乳頭瘤病毒、巨細胞病毒發(fā)生重組。2023/3/14第31頁/共90頁32

（3）腺病毒相關(guān)病毒載體腺病毒相關(guān)病毒(adenovirusassociatedvirus，AAV)是一類單鏈線狀DNA缺陷型病毒。其基因組DNA小于5kb，無包膜，外形為裸露的20面體顆粒。AAV不能獨立復制，只有在輔助病毒（如腺病毒、單純皰疹病毒、痘苗病毒）存在時，才能進行復制和溶細胞性感染，否則只能建立溶源性潛伏感染。AAVVirusParticles2023/3/14第32頁/共90頁33StructureofAAVVirusGenomicDNAREP:病毒復制基因,CAP:編碼衣殼蛋白的基因2023/3/14第33頁/共90頁34AAV的特點●以潛伏感染為主；●病毒基因組與細胞共存；●只要宿主細胞正常，AAV基因表達就處于抑制而維持潛伏狀態(tài)；●若細胞受刺激，表達應激基因，AAV基因表達從而使AAV病毒復制；●產(chǎn)生子代病毒并釋放，又感染新的細胞，建立新的潛伏狀態(tài)。2023/3/14第34頁/共90頁35AAV載體是目前正在研究的一類新型安全載體，它對人類無致病性。AAV可以高效定點整合至人19號染色體的特定區(qū)域19q13.4中，并能較穩(wěn)定地存在。這種靶向定點整合可以避免隨機整合可能帶來的抑癌基因失活和原癌基因激活的潛在危險性，而且外源基因可以持續(xù)穩(wěn)定表達，并可受到周圍基因的調(diào)控，兼具逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺病毒載體兩者的優(yōu)點。

2023/3/14第35頁/共90頁36

AAV載體的缺陷：

AAV載體容量小，目前最多只能容納5kb外源DNA片段；感染效率比逆轉(zhuǎn)錄病毒載體低。在40%-80%的成人中存在過感染，可能會引起免疫排斥。2023/3/14第36頁/共90頁37

2.非病毒載體介導的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)

（1）脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使用方便、成本低廉。

基本原理:利用陽離子脂質(zhì)體單體與DNA混合后，可以自動形成包埋外源DNA的脂質(zhì)體，然后與細胞一起孵育，即可通過細胞內(nèi)吞作用將外源DNA（即目的基因）轉(zhuǎn)移至細胞內(nèi)，并進行表達。

2023/3/14第37頁/共90頁38脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)移示意圖2023/3/14第38頁/共90頁39

（2）受體介導轉(zhuǎn)移技術(shù)

將DNA與細胞或組織親和性的配體偶聯(lián)，可使DNA具有靶向性。這種偶聯(lián)通常通過多聚陽離子（如多聚賴氨酸）來實現(xiàn)。多聚陽離子與配體共價連接后，又通過電荷相互作用與帶負電荷的DNA結(jié)合，將DNA包圍，只留下配體暴露于表面。這樣形成的復合物可被帶有特異性受體的靶細胞吞飲，從而將外源DNA導入靶細胞。2023/3/14第39頁/共90頁40受體介導轉(zhuǎn)移技術(shù)示意圖2023/3/14第40頁/共90頁41

（3）基因直接注射技術(shù)不需要進行基因工程的繁瑣操作，直接將裸露基因DNA注入動物肌肉或某些器官組織內(nèi)。動物實驗表明：接受注射外源DNA的小鼠能夠按其基因編碼合成相應的蛋白質(zhì)，并能維持數(shù)月之久。1.將促進心臟血管生長的基因直接注入實驗鼠的心臟，可使其心臟壁內(nèi)毛細血管增加30%～40%；2.將胰島素基因直接注入鼠骨骼肌細胞，能分泌糖尿病所缺少的胰島素；3.肌內(nèi)注射凝血因子Ⅸ基因，可產(chǎn)生血友病所需的凝血因子等等。2023/3/14第41頁/共90頁42

基因直接注射法的優(yōu)點1.制備具有調(diào)控部件的質(zhì)粒DNA重組體的技術(shù)較容易；2.排除病毒載體可能潛在的致癌性或其他副作用；3.導入的基因不需整合即可表達，避免了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導入整合后，一旦發(fā)生副作用不易中止或逆轉(zhuǎn)的缺點；4.基因直接注射法可反復使用，而病毒載體則可能誘導體內(nèi)免疫應答，致使反復治療效果下降。2023/3/14第42頁/共90頁43三、基因干預

GeneInterference2023/3/14第43頁/共90頁44基因干預的種類：1.反義RNA(antisenseRNA)2.干擾RNA(RNAinterference)3.核酶(ribozyme)2023/3/14第44頁/共90頁45

（一）反義RNA1.反義RNA與基因表達調(diào)控利用反義RNA對體外培養(yǎng)的細胞進行基因表達調(diào)控，通常采用的方法有兩種：（1）體外合成反義RNA，直接作用于培養(yǎng)細胞，細胞吸收RNA后，發(fā)揮作用。（2）構(gòu)建能轉(zhuǎn)錄反義RNA的重組質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細胞，轉(zhuǎn)錄出反義RNA而發(fā)揮作用。2023/3/14第45頁/共90頁46

反義RNA的關(guān)鍵技術(shù)問題：?反義RNA進入靶細胞前的降解問題?專一性轉(zhuǎn)移問題：

2023/3/14第46頁/共90頁472.受體介導反義RNA技轉(zhuǎn)移術(shù)

①受體介導的RNA轉(zhuǎn)移十分專一，而且效率高；②被轉(zhuǎn)移的RNA是被保護的，與周圍環(huán)境之間存在多聚賴氨酸的保護層,可以抵抗環(huán)境中的核酸酶的降解作用。

將脫唾液酸血清類粘蛋白（ASGP）與多聚賴氨酸（PL）共價連接，得到ASGP-PL復合物，成為運載核酸的工具。ASGP-PL反義RNA復合物可以專一性地被肝細胞表面的ASGP受體所識別，并吞噬到肝細胞中，反義RNA進入肝細胞后，可被逐漸釋放出來發(fā)揮作用。

借助受體介導DNA轉(zhuǎn)移方法把DNA換成反義RNA，就可以實現(xiàn)受體介導的反義RNA的轉(zhuǎn)移。2023/3/14第47頁/共90頁48

3.反義RNA的應用前景

受體介導的反義RNA基因治療有其自身的優(yōu)點，而在一定程度上補充了轉(zhuǎn)基因治療的不足。

（l）安全性高（2）反義RNA設計和制備方便

（3）具有劑量調(diào)節(jié)效應

（4）能直接作用于一些RNA病毒反義RNA只作用于特異的mRNA分子，不改變所調(diào)節(jié)基因的結(jié)構(gòu)。反義RNA分子無論怎樣修飾，最終將在細胞內(nèi)部被降解，不留“殘渣”。

在治療RNA病毒感染性疾病時，受體介導的反義RNA基因治療比一般的DNA基因治療有更大的優(yōu)勢。利用反義RNA可以直接作用于病毒RNA，阻斷RNA病毒的繁殖。2023/3/14第48頁/共90頁49（二）干擾RNA

實驗結(jié)果顯示，有義鏈RNA（senseRNA）或反義鏈RNA（antisenseRNA）均能抑制線蟲基因的表達，雙鏈RNA比單鏈RNA更為有效。將特異的雙鏈RNA注入線蟲體內(nèi)可抑制有同源序列的基因的表達。得到的結(jié)果是有義鏈RNA和反義鏈RNA都同樣阻斷基因表達途徑。這與傳統(tǒng)上對反義RNA技術(shù)的解釋正好相反。而且其抑制基因表達的效率比反義RNA至少高2個數(shù)量級。1.RNA干擾現(xiàn)象

RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是一種由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象。在此過程中，與雙鏈RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，從而抑制該基因的表達。對RNA干擾的認識來源于用線蟲（C.elegans）和果蠅所進行的實驗。2023/3/14第49頁/共90頁50

2.RNA干擾的機制

RNA干擾過程主要有2個步驟：

（1）小干擾性RNA（siRNA）（2）siRNA與細胞內(nèi)的某些酶和蛋白質(zhì)形成復合體，稱為RNA誘導的沉默復合體（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)。該復合體可識別與siRNA有同源序列的mRNA，并在特異的位點將該mRNA切斷。長雙鏈RNA被細胞內(nèi)的雙鏈RNA特異性核酸酶Dicer切成21-23個堿基對的短雙鏈RNA，稱為小干擾性RNA（smallinterferingRNA，siRNA）。2023/3/14第50頁/共90頁51

1.體外化學合成;

2.用質(zhì)粒載體或病毒載體可在細胞內(nèi)穩(wěn)定地生成。siRNA的產(chǎn)生2023/3/14第51頁/共90頁523.RNA干擾的應用前景RNA干擾研究目前已經(jīng)在功能基因組學研究、微生物學研究、基因治療和信號轉(zhuǎn)導等廣泛領(lǐng)域取得了令人矚目的進展，使其在醫(yī)學、生物學領(lǐng)域的應用有著廣闊的前景。2023/3/14第52頁/共90頁53（1）研究基因功能的新工具

由于RNA干擾技術(shù)具有高度的序列專一性和有效的干擾能力，可以使特定基因沉默或功能喪失，因此可以作為功能基因組學的一種強有力的研究工具。

RNA干擾技術(shù)能夠在哺乳動物中抑制特定基因的表達，建立多種表型；抑制基因表達的時間可以控制在發(fā)育的任何階段，產(chǎn)生類似基因敲除的效應。

2023/3/14第53頁/共90頁54

（2）腫瘤的基因治療

傳統(tǒng)反義RNA技術(shù)誘發(fā)的單一癌基因的阻斷，不可能完全抑制或逆轉(zhuǎn)腫瘤的生長，而RNA干擾技術(shù)可以利用同一基因家族的多個基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性，設計針對這一區(qū)段序列的雙鏈RNA分子，只使用一種雙鏈RNA即可以產(chǎn)生多個基因同時剔除的表型，也可以同時使用多種雙鏈RNA而將多個序列不相關(guān)的基因同時剔除。RNA干擾技術(shù)可用于治療有異常基因表達的惡性腫瘤。

K-RAS蛋白為腫瘤發(fā)生所必需，bcr/ab1融合基因與人白血病有關(guān)，用RNA干擾技術(shù)可以阻礙K-RAS蛋白的表達從而抑制腫瘤發(fā)生，或殺死有bcr/ab1的人白血病細胞系。通過RNA干擾抑制某些內(nèi)源性基因的表達，能促進白血病細胞系的細胞凋亡或增加其對化療藥物的反應性。

應用RNA干擾技術(shù)成功地阻斷了MCF-7乳腺癌細胞中一種異常表達的與細胞增殖分化相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子基因Sp1的功能。2023/3/14第54頁/共90頁55

（3）病毒性疾病的基因治療

RNA干擾可以被看成是一種與免疫系統(tǒng)類似的防御機制。用siRNA抑制人類免疫缺陷病毒（HIV）某些基因的表達，如P24、Vif、nef、tat或rev，阻礙HIV在細胞內(nèi)復制。用RNA干擾技術(shù)抑制HIV的受體（CD4）或輔助受體（CXCR4或CCR5）在細胞內(nèi)表達，可阻礙HIV感染細胞。也可通過RNA干擾抑制其他病毒在細胞內(nèi)復制，如脊髓灰質(zhì)炎病毒、人乳頭狀瘤病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒等。2023/3/14第55頁/共90頁56

siRNA在病毒感染的早期階段能有效地抑制病毒的復制，病毒感染能被針對病毒基因和相關(guān)宿主基因的siRNA所阻斷，RNA干擾技術(shù)將成為一種有效的抗病毒治療手段。這對于許多嚴重的病毒性疾病的防治具有十分重大的意義。2023/3/14第56頁/共90頁57（三）核酶(ribozyme)

天然核酶多為單一的RNA分子，具有自我剪切作用。但核酶也可以由兩個RNA分子組成。在基因治療時，利用核酶分子結(jié)合到靶RNA分子中適當?shù)泥徫唬纬慑N頭核酶結(jié)構(gòu)，將靶RNA分子切斷，通過破壞靶RNA分子達到治療疾病（如清除病毒基因組RNA）的目的。只要兩個RNA分子通過互補序列相結(jié)合，形成錘頭狀的二級結(jié)構(gòu)（3個螺旋區(qū)），并能組成核酶的核心序列（13個或11個保守核苷酸序列），就可在錘頭右上方產(chǎn)生剪切反應。2023/3/14第57頁/共90頁58

1.核酶的設計核酶是通過靶RNA分子與核酶分子共同組成酶活性結(jié)構(gòu)域，要從靶分子和核酶分子兩個方面來設計核酶。

（1）選擇合適的靶部位，該部位具有核酶切割位點，能與核酶分子結(jié)合并組成酶活性結(jié)構(gòu)域。（2）核酶的基本組成：用于基因治療的核酶分子由三個部分組成，中間是保守序列（能夠組成酶活性結(jié)構(gòu)域），兩端是引導序列。在基因治療中，主要是根據(jù)治療的靶基因序列的特點，設計和合成特定的核酶。設計的基本原則是核酶分子與靶部位結(jié)合后能形成酶活性結(jié)構(gòu)域。

2023/3/14第58頁/共90頁59核酶的作用機制

2023/3/14第59頁/共90頁60

2.核酶的應用

與一般的反義RNA相比，核酶具有較穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，不易受到RNA酶的攻擊。更重要的是，核酶在切斷mRNA后，又可從雜交鏈上解脫下來，重新結(jié)合和切割其它的mRNA分子。

2023/3/14第60頁/共90頁61四、治療基因的受控表達

RegulatedExpressionofTherapeuticGene2023/3/14第61頁/共90頁62時間:要實現(xiàn)治療基因的受控表達，必須建立完善的基因表達調(diào)控體系?；蛘{(diào)控策略大致有以下幾種：基因內(nèi)部調(diào)節(jié)機制、基因外部調(diào)節(jié)機制、利用病灶微環(huán)境使治療基因特異性表達以及治療基因的誘導表達等。

治療基因的受控表達包括控制治療基因表達的時間、空間和水平三個方面。

空間:表達水平：希望治療基因能在一個適當?shù)乃奖磉_。

1.控制治療的基因在患者需要實施治療時才表達，而平時不需要進行治療時則處于關(guān)閉狀態(tài)；2.根據(jù)不同疾病的治療要求，控制治療基因持續(xù)表達的時間跨度。是指為了提高基因治療的專一性和安全性，嚴格限制治療基因只在靶細胞中表達，避免治療基因指導合成的蛋白質(zhì)干擾非靶細胞的正常生活，產(chǎn)生毒副作用。2023/3/14第62頁/共90頁63（一）基因內(nèi)部的調(diào)節(jié)機制?使用正常細胞的組織特異性啟動子、增強子元件?使用病變細胞的組織特異性啟動子、增強子元件2023/3/14第63頁/共90頁64

1.使用正常細胞的組織特異性啟動子、增強子元件

例如，酪氨酸酶是皮膚細胞和黑色素瘤細胞產(chǎn)生色素途徑中的一種酶，可利用其啟動子驅(qū)動治療基因只在黑色素瘤細胞中表達，而不在正常的周邊細胞中表達。不同類型的正常細胞或組織中往往存在某些特有的蛋白質(zhì)，它們的基因表達調(diào)控元件可用于驅(qū)動治療基因的特異性表達，從而起到治療作用。前列腺特異性抗原(PSA)是參與精液凝塊中蛋白質(zhì)降解、使精液液化的一種絲氨酸蛋白酶。它主要在前列腺中產(chǎn)生，而在前列腺癌細胞中含量很高，可以利用PSA基因調(diào)控元件驅(qū)動治療基因在PSA陽性的前列腺癌細胞中表達而發(fā)揮作用，而其在PSA陰性細胞和非前列腺癌細胞中不能使治療基因表達。2023/3/14第64頁/共90頁65

2.使用病變細胞的組織特異性啟動子、增強子元件

某些病變的細胞或組織產(chǎn)生一些特殊的蛋白質(zhì)，其基因表達調(diào)節(jié)元件也可以用來控制治療基因的特異性表達。甲胎蛋白(AFP)基因正常情況下只在胚胎肝細胞中表達，不在成年肝臟細胞中表達。肝細胞腺癌細胞中AFP基因異常激活，因此可利用該基因啟動子驅(qū)動治療基因(如自殺基因)在癌細胞中表達，使癌細胞經(jīng)給藥后被殺死。癌胚抗原(CEA)是膜糖蛋白家族的成員，在許多腺癌細胞中表達很高，采用其啟動子可以使治療基因只在CEA陽性的癌細胞中表達，而不會在陰性細胞中表達。2023/3/14第65頁/共90頁66（二）基因外部的調(diào)節(jié)機制

除利用基因內(nèi)部的調(diào)節(jié)機制以外，還可通過施加外部刺激，促進治療基因在特定細胞或組織中表達。采用熱休克蛋白基因的表達調(diào)控元件來啟動治療基因，可以通過對病灶局部進行熱處理，達到使治療基因特異性表達的目的。

Egr-1基因是一種編碼鋅指轉(zhuǎn)錄因子的早期基因，包括電離輻射和細胞因子等在內(nèi)的多種外部刺激都可以誘導其表達，將其調(diào)控序列啟動的治療基因(如腫瘤壞死因子基因)導入腫瘤組織，可在電離輻射等作用下，使治療基因獲得暫時性的局部表達，殺死腫瘤細胞。組織纖溶酶原激活物(t-PA)作為溶解血栓的藥劑，在中風和心肌梗死等疾病治療中起著重要的作用。t-PA的活性在輻射后增加50倍，表明其基因表達調(diào)控元件中存在受輻射誘導的調(diào)控元件，故可利用其調(diào)控元件啟動治療基因的表達，增強放療效果。2023/3/14第66頁/共90頁67（三）利用病灶微環(huán)境使治療基因特異性表達

病灶微環(huán)境與正常時往往不同，因此可利用這些變化控制治療基因的表達。

例如，在腫瘤病灶處，常常出現(xiàn)葡萄糖缺乏等情況，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白GRP78/Bip的含量也隨之增加，使癌細胞能夠抵御應激。當采用這種基因的啟動子來控制治療基因時，可以使治療基因在腫瘤細胞中表達，使腫瘤組織壞死。

腫瘤細胞生長速度快于形成血管的內(nèi)皮細胞，造成供血不足，因此在腫瘤內(nèi)部形成酸性、缺氧和營養(yǎng)缺乏的區(qū)域。缺氧條件可以通過缺氧誘導因子(HIF-1)和缺氧響應元件(HRE)相互作用，調(diào)節(jié)一些基因的表達；如果采用缺氧響應元件(HRE)來控制治療基因的表達，即可實現(xiàn)治療基因只在缺氧的腫瘤組織中表達，而在正常組織中不表達。

機體發(fā)炎時所可產(chǎn)生的許多急性期蛋白，其基因的啟動子可以控制發(fā)炎條件下治療基因的表達；而一旦炎癥消失，治療基因的表達也隨之終止。2023/3/14第67頁/共90頁68（四）治療基因的誘導表達

采用組織特異性啟動子控制治療基因的表達，可能造成這些基因在靶細胞中表達，不再受外界控制。為了避免這種情況發(fā)生，研究人員正在開發(fā)和完善一些可誘導性基因表達系統(tǒng)。這種系統(tǒng)的必要成分：一種是轉(zhuǎn)錄激活劑，它只在誘導藥物存在時才能與DNA結(jié)合；另一種則是特異性基因表達調(diào)控元件，僅對這種轉(zhuǎn)錄激活劑有所響應。

2023/3/14第68頁/共90頁69四環(huán)素抗性操縱子系統(tǒng)原理四環(huán)素抗性基因的轉(zhuǎn)錄受Tet阻遏蛋白的負調(diào)控。無四環(huán)素存在時，阻遏蛋白與四環(huán)素抗性操縱子序列結(jié)合阻斷四環(huán)素抗性基因的表達；四環(huán)素存在時，阻遏蛋白與四環(huán)素具有極高的親和性，造成阻遏蛋白對四環(huán)素抗性操縱子阻遏解除，使四環(huán)素抗性基因的轉(zhuǎn)錄得以進行。。

2023/3/14第69頁/共90頁702023/3/14第70頁/共90頁71五、基因治療的應用研究TheApplicationofGeneTherapy2023/3/14第71頁/共90頁72

世界上第一個正式被批準用于基因治療的病例是先天性腺苷脫氨酶（ADA）缺乏癥。1990年9月美國Blaese博士成功地將正常的人的ADA基因植入ADA缺乏癥病人的淋巴結(jié)內(nèi)，完成世界上首例基因治療試驗。2023/3/14第72頁/共90頁73（一）遺傳病的基因治療研究

已知人類有4000多種遺傳病，在人群中的發(fā)病率約為40％～50％。但真正了解病因，能進行產(chǎn)前診斷的僅限于那些為數(shù)不多的常見遺傳病。

1.在DNA水平明確其發(fā)病原因及機制；2.必須是單基因遺傳病，而且屬隱性遺傳；3.該基因的表達不需要精確調(diào)控；4.該基因能在一種便于臨床操作的組織細胞(如皮膚細胞，骨髓細胞等)中表達并發(fā)揮其生理作用；5.該遺傳病不經(jīng)治療將有嚴重后果(如不治療難以存活等)?？晒┻x擇并符合上述4條以上要求的不過只有30余種遺傳病。遺傳病基因治療必須符合以下要求：2023/3/14第73頁/共90頁741．腺苷脫氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)缺乏癥2．珠蛋白生成障礙性貧血和血紅蛋白病3．血友病和其他血漿蛋白缺乏癥4．苯丙酮酸尿癥和其他先天性代謝缺陷病5．萊-納(Lesch-Nyhan)綜合征6．家族性高膽固醇血癥7．囊性纖維化病2023/3/14第74頁/共90頁75（二）惡性腫瘤基因治療研究

（1）通過基因置換和基因補充，導入多種抑癌基因以抑制癌癥的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移；腫瘤發(fā)生是一個極為復雜的過程，許多基因的突變會導致腫瘤的發(fā)生。（2）抑制癌基因的活性，通過干擾癌基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，發(fā)揮抑癌作用；（3）增強腫瘤細胞的免疫原性，通過對腫瘤組織進行細胞因子修飾，刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生對腫瘤細胞的溶解和排斥反應；（4）通過導入“自殺基因”殺傷癌細胞。2023/3/14第75頁/共90頁76

1.腫瘤基因治療的基本策略

從實際應用于臨床治療的角度來看，腫瘤基因治療的策略包括：(1)直接殺傷腫瘤細胞或抑制其生長。(2)增強機體免疫系統(tǒng)，間接殺傷或抑制腫瘤細胞。(3)改善腫瘤常規(guī)治療方法，提高療效。2023/3/14第76頁/共90頁77

2.腫瘤基因治療的常用方法

?基因干預技術(shù)：通過基因干預，使得腫瘤細胞過度表達的癌基因得到抑制，從而降低其惡性表型。

?自殺基因治療—分子化療：直接殺死腫瘤細胞。

?腫瘤的免疫基因治療：以激發(fā)機體腫瘤免疫效應或提高免疫效應細胞功能。

?提高化療效果的輔助基因治療：藥物增敏基因治療；耐藥基因治療。

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3.自殺基因治療：自殺基因治療是目前腫瘤基因治療領(lǐng)域中的研究熱點之一。

基本原理：向腫瘤細胞內(nèi)導入某些真核細胞中不存在的酶基因（自殺基因），這些基因表達的特異性酶可以催化對真核細胞無毒或低毒的藥物前體，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂幸种坪怂岷铣尚目勾x藥物，進而選擇性地將轉(zhuǎn)染了該基因的腫瘤細胞“自殺”。這些基因也相應地被稱為“自殺基因”。2023/3/14第78頁/共90頁79自殺基因治療的前提條件是“自殺基因”的表達必須局限于腫瘤細胞中，而不傷及正常細胞。

①利用免疫脂質(zhì)體、受體介導等技術(shù)進行定向基因轉(zhuǎn)移。②利用病毒載體進行基因轉(zhuǎn)移。③腫瘤特異性基因轉(zhuǎn)錄。④腫瘤內(nèi)直接注射。

自殺基因轉(zhuǎn)移常用方法2023/3/14第79頁/共90頁80

4.腫瘤的免疫基因治療激發(fā)機體腫瘤免疫效應或提高免疫效應細胞功能為目的的一種腫瘤基因治療方法。主要包括細胞因子（或受體）基因治療和抗原抗體基因治療兩大類。2023/3/14第80頁/共90頁815.提高化療效果的輔助基因治療：

臨床上對腫瘤患者進行化療時，通常面臨兩大難題：（1）是患者機體內(nèi)的腫瘤細胞對化療藥物的敏感程度存在差異，特別是某些經(jīng)過多次化療的患者，其體內(nèi)的腫瘤細胞已經(jīng)產(chǎn)生了多藥耐藥性，對多種化療藥物產(chǎn)生交差耐受，最終導致化療失敗。（2）是大劑量的化療可能導致患者的正常細胞，特別是骨髓造血細胞的功能受到抑制。

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(1)藥物增敏基因治療：

將雞鈣調(diào)素（calmodulin,CaM）基因?qū)胄∈笕橄侔┘毎闏127，結(jié)果僅需低劑量的長春新堿或長春花堿即可明顯抑制該細胞株的生長。對其作用原理進行研究后發(fā)現(xiàn)，CaM基因的表達產(chǎn)物作為細胞內(nèi)信號傳導系統(tǒng)的重要物質(zhì)，明顯增加了腫瘤細胞對長春新堿或長春花堿的吸收量而相應減少了排出量，從而提高了腫瘤細胞內(nèi)化療藥物濃度，導致腫瘤細胞死亡。為了使化療藥物能夠最大程度地殺死腫瘤細胞，可以考慮將某些藥物增敏基因?qū)肽[瘤細胞，特別是對化療藥物原本不敏感的腫瘤細胞，使其對抗腫瘤藥物的敏感性大大增加，從而達到增強化療效果的目的。

2023/3/14第82頁/共90頁83

(2)耐藥基因治療：在解決化療所致骨髓細胞造血功能受到嚴重抑制的問題方面，通過向腫瘤患者的骨髓細胞導入某種耐藥基因，如mdr-1基因等，以增強骨髓細胞的抗藥性，以便耐受大劑量的化療藥物，以達到徹底殺滅腫瘤細胞的目的。腫瘤細胞耐藥性