基因組學(xué)與系統(tǒng)毒理學(xué)

基因組學(xué)與系統(tǒng)毒理學(xué)第1頁/共27頁1概述毒理基因組學(xué)（toxicogenomics）:是研究基因組如何對化學(xué)毒物發(fā)生反應(yīng)的學(xué)科。毒理基因組學(xué)最初是將基因組學(xué)的理論和技術(shù)應(yīng)用于毒理學(xué)，研究組織細胞特定基因的功能并預(yù)測受試物的毒性。目前研究不僅包括基因組水平的效應(yīng)，還包括基因的DNA表達（轉(zhuǎn)錄組學(xué)）、蛋白質(zhì)產(chǎn)物表達（蛋白質(zhì)組學(xué)）、代謝譜改變（代謝組學(xué)）、遺傳多態(tài)性以及生物信息學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域。毒理基因組學(xué)的基本任務(wù)：是利用人類基因組的資料，幫助篩選和鑒別潛在的環(huán)境毒物，并在基因組水平上闡明毒作用發(fā)生的機制。毒理基因組學(xué)的研究目標：近期是確定某種有害因素的反應(yīng)基因（信號基因）用于毒理學(xué)和相關(guān)疾病的研究，遠期是建立全基因組與蛋白質(zhì)組毒性反應(yīng)知識庫，并在此基礎(chǔ)上開辟以芯片技術(shù)和生物信息技術(shù)為特征的數(shù)字（digitizedtoxicology）毒理學(xué)。第2頁/共27頁2毒理基因組學(xué)研究技術(shù)毒理基因組學(xué)面臨的基本問題一是如何獲取大規(guī)模的生物數(shù)據(jù)，二是如何對所得到的大量信息進行及時而合理的處理。這有賴于下列毒理基因組學(xué)現(xiàn)代研究技術(shù)。2.1基因組學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)2.2蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)2.3代謝組學(xué)技術(shù)2.4生物信息學(xué)第3頁/共27頁2.1基因組學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)2.1.1差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)(DDRT-PCR)2.1.2基因表達序列分析2.1.3微陣列分析2.1.4RNA干涉（RNAinterference,RNAi）技術(shù)2.1.5單核苷酸多態(tài)性檢測第4頁/共27頁2.1.1差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)DDRT-PCR技術(shù)是以分子生物學(xué)上應(yīng)用廣泛的兩種技術(shù)PCR和聚丙烯酰胺凝膠電泳為基礎(chǔ)?；驹恚阂?對細胞/組織的總DNA反轉(zhuǎn)錄而成的cDNA為模板，利用PCR的高效擴增，通過5’端和3’端引物的合理設(shè)計和組合，將細胞/組織中表達的約15000種基因片段直接顯示在DNA測序膠上，從而找出1對細胞/組織中有差異的cDNA片段。優(yōu)點：周期短、功能多、靈敏度高、所需RNA量少和重復(fù)性高。缺點：假陽性率高、凝膠中單條cDNA帶成分不均一、所獲cDNA僅代表mRNA3’UTR（非翻譯區(qū)）、一些低復(fù)制數(shù)mRNA不能有效呈現(xiàn)。第5頁/共27頁2.1.2基因表達序列分析SAGE（serialanalysisofgeneexpression）技術(shù)的主要理論依據(jù)：是來自cDNA3’端特定位置的一段9-11bp長的序列能夠區(qū)分基因組中95%的基因。這段基因特異的序列被稱為標簽。通過對cDNA制備SAGE標簽并將這些標簽串聯(lián)起來，然后對其進行測定，不僅可以顯示各SAGE所代表的基因在特定組織中是否表達，而且還可以根據(jù)各SAGE標簽所出現(xiàn)的頻率作為其所代表的基因表達豐度的指標。SAGE技術(shù)的前提條件：是genbank中必須有足夠的某一物種的DNA系列信息，尤其是表達系列標簽（expressedsequencetag,EST）的序列資料。第6頁/共27頁2.1.3微陣列分析1DNA微陣列（Microarrayassay）或DNA芯片（DNAchip）技術(shù)研究所使用的基本硬件：是基因微陣列或基因芯片，其上含有成千上萬個寡聚核苷酸片段或cDNA探針（cDNA、EST或基因特異的寡核苷酸）。這些探針按一定順序以矩陣方式排列在載玻片大小的塑料或玻璃板上，在1cm2面積上可有1-10萬個不同的排列，并可有多個拷貝，其敏感性可達1-5個拷貝mRNA/細胞?；虮磉_測定：先將受試動物染毒，其靶器官或細胞與毒物接觸后，發(fā)生反應(yīng)或被活化的基因會產(chǎn)生mRNA。然后將mRNA用核素或熒光素標記，再加入基因芯片。在單個的陣列中加入兩種標記樣品進行雜交，再用圖象分析儀或激光掃描顯微鏡進行檢查和分析。根據(jù)發(fā)生結(jié)合反應(yīng)發(fā)生的情況便可判斷哪些基因發(fā)生了改變。第7頁/共27頁2.1.3微陣列分析2優(yōu)點：靈敏度高，mRNA豐度低至10萬分之一仍能被檢出?？刹捎脦追N不同顏色的熒光染料標記探針，這樣在同一張陣列膜上進行一次雜交實驗就可分析不同樣品間基因表達的差異，因此效率高。缺點：成本較高，需要特殊的信號檢測分析系統(tǒng)（圖象分析儀或激光掃描顯微鏡），玻片上的微陣列不能重復(fù)使用。第8頁/共27頁2.1.4RNA干涉技術(shù)RNAi(RNAinterference)是一種能快速有效地沉寂靶基因的表達，進而從反向角度來闡明基因的功能。原理：是外源性雙鏈RNA導(dǎo)入細胞后，可產(chǎn)生21-23nt（核苷酸，nucleotide）長度的小分子干涉RNA（smallinterferenceRNA,siRNA），引起與其序列同源的特異基因mRNA降解的現(xiàn)象-轉(zhuǎn)錄后的基因沉默（post-transcriptionalgenesilencing,PTGS）實驗步驟：選取目的基因；設(shè)計相應(yīng)的siRNA序列；制備siRNA；siRNA轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞；RNAi效果分析。其中關(guān)鍵是設(shè)計相應(yīng)的siRNA序列。第9頁/共27頁2.1.5單核苷酸多態(tài)性檢測SNPs（singlenucleotidepolymorphisms）指染色體基因組水平上單個核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性。其類型有單堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、插入、缺失等。最普遍的檢測方法：定位的序列標簽位點和表達序列標簽進行測序。第10頁/共27頁2.2蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)雙向凝膠電泳：是將細胞抽提物在電泳過程中，依據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷及分子大小而被分離的技術(shù)。生物質(zhì)譜：是使樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子間質(zhì)荷比（M/Z）的差異來分離并確定相對分子量的技術(shù)。多向蛋白鑒定技術(shù)：是將蛋白質(zhì)酶解后得到多肽混合物，進樣到強陽離子交換色譜柱，直接洗脫后進樣到反向LC色譜柱上，然后進行梯度洗脫，用MS/MS對分離的餾份進行鑒定。同位素親和標簽技術(shù)：是用化學(xué)性質(zhì)相同而質(zhì)量不同的兩種同位素分子，對蛋白樣品的半胱氨酸進行標記，然后對混合的樣品進行質(zhì)譜分析，通過比較質(zhì)譜峰的強弱可對蛋白質(zhì)進行定量比較。分子掃描技術(shù)：是將雙向凝膠轉(zhuǎn)到涂有酶解液的膜上，在轉(zhuǎn)膜的同時進行酶切，再利用質(zhì)譜掃描鑒定。第11頁/共27頁2.3代謝組學(xué)技術(shù)核磁共振：其可在一次單獨的檢測中獲得生物體液中成百上千的代謝物組分的信息，而無需預(yù)先確定被檢測物質(zhì)的性質(zhì)。包括：氫譜：其可檢測含氫的化合物，但其大分子信號會掩蓋小分子化合物的信號。碳譜：可用于檢測分子量在500D以下的含碳有機化合物的信息。色譜-質(zhì)譜聯(lián)用：包括LC-MS和GC-MS。其速度快、靈敏度高、樣品處理簡單。毛細管電泳：分離樣品速度更快、效率高。第12頁/共27頁2.4生物信息學(xué)生物信息學(xué)：是綜合運用數(shù)學(xué)、計算機科學(xué)和生物學(xué)的各種工具，以核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子數(shù)據(jù)庫作為主要研究對象，對巨量生物學(xué)原始數(shù)據(jù)進行存儲、管理、注釋、加工，使之成為具有明確生物生物學(xué)意義的生物信息。其有三部分組成：生物學(xué)數(shù)據(jù)庫生物信息學(xué)分析方法應(yīng)用軟件第13頁/共27頁生物學(xué)數(shù)據(jù)庫它是按照一定的標準收集和處理生物學(xué)實驗數(shù)據(jù)，并提供相關(guān)的數(shù)據(jù)查詢和處理的服務(wù)。其幾乎覆蓋了生命科學(xué)的各個領(lǐng)域。如只對原始數(shù)據(jù)進行簡單處理和歸類的基本數(shù)據(jù)庫：DNA序列數(shù)據(jù)庫：GenBank,EMBL,DDJB,ESTdb,OMIM,GDB等。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫：SWISS-PROT,PIR,OWL,ISSD等。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫：PROSITE,BLOCKS,PRINTS等。生物大分子的三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫：PDB,NDB,CCSD等。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分類數(shù)據(jù)庫：SCOP,CATH,FSSP等。多個基本數(shù)據(jù)庫的整合并能提供綜合性服務(wù)的二次數(shù)據(jù)庫：UniGene,TransFac,EPD,Prosite,Prints,Pfam,Blocks,Profiles,DSSP,PubMed等。，目前這些數(shù)據(jù)庫均可實現(xiàn)在線免費服務(wù)。第14頁/共27頁生物信息學(xué)分析方法序列比對預(yù)測法：是以核酸和蛋白質(zhì)序列為依據(jù)，比較2個或2個以上核酸或蛋白質(zhì)在堿基、氨基酸水平上的相似性和差異性。結(jié)構(gòu)比對預(yù)測法：是比較兩個或兩個以上蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)（二級和三級結(jié)構(gòu)）的相似性和差異性。功能比對預(yù)測法：是先以蛋白質(zhì)序列為依據(jù)預(yù)測蛋白質(zhì)的物理性質(zhì)（分子量、等電點、親水和疏水性、信號肽和蛋白定位等），再進行蛋白質(zhì)的功能預(yù)測。第15頁/共27頁應(yīng)用軟件其用于管理數(shù)據(jù)庫，使用戶能方便地得到實時、在線的數(shù)據(jù)庫服務(wù)。如：用于核酸和蛋白質(zhì)序列分析的GCG和Staden軟件包；用于大規(guī)模測序的Seguencher；用于快速克隆的VectonNTI；用于比對基因組研究的Alfresco；用于多序列比對的彩色序列編輯器CINEMA。第16頁/共27頁3毒理基因組學(xué)研究內(nèi)容及其應(yīng)用3.1毒作用機制研究3.2化學(xué)物毒性預(yù)測3.3比較毒理學(xué)研究3.4混合物聯(lián)合毒作用研究3.5危險度評定3.6表型錨定3.7信息整合第17頁/共27頁3.1毒作用機制研究傳統(tǒng)采用動物模型進行毒性測試使用動物量大、工作量大、周期長。采用基因組技術(shù)，實現(xiàn)了高通量篩選。闡明毒作用機制和預(yù)測新化學(xué)物毒性的關(guān)鍵在于識別毒物所特有的分子標志或指紋基因。單基因?qū)Σ煌疚锏姆磻?yīng)往往具有交叉性，不具備單獨作為指紋基因的特異性。只用采用多個變量（如多個基因），分析其綜合變化情況（如基因組表達譜），才可能反映出特征性的改變。第18頁/共27頁3.2化學(xué)物毒性預(yù)測基因組表達譜可用于預(yù)測新化學(xué)物可能具有的毒效應(yīng)。根據(jù)研究目的可分別設(shè)計識別化學(xué)物的毒性、毒作用途徑或靶器官的陣列：選定已知毒物（如重金屬）作為標準參照物；選定參照物已知或可能作用的靶基因作為陣列目標基因；在特定組織或細胞中，用暴露與參照物靶基因的表達譜與受試物表達譜進行比較，預(yù)測其毒作用類型；應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)分類方法如聚類分析、自組圖分析發(fā)現(xiàn)兩類毒物間基因表達模式的差異。第19頁/共27頁3.3比較毒理學(xué)研究由于遺傳背景、生化途徑、受體親和力等互不相同，同一毒物在不同物種間的毒性效應(yīng)存在較大差異。因此，將動物實驗結(jié)果合理地外推到人是個復(fù)雜的問題。要解決這一問題的關(guān)鍵是尋找能夠在不同物種間進行毒性比較的生物學(xué)標志—“橋梁生物標志”。采用高通量的DNA微陣列技術(shù)，可從大量甚至全部基因分子中篩選出適當?shù)摹皹蛄荷飿酥尽?，用于比較化學(xué)物毒作用的種屬差異，從而更加準確地將動物實驗結(jié)果外推到人。比較不同物種間基因表達譜的相似程度，有助于選擇與人類反應(yīng)最接近的實驗動物，從而使毒理學(xué)研究的結(jié)果更接近人類的實際情況。第20頁/共27頁3.4混合物聯(lián)合毒作用研究混合物聯(lián)合毒作用因相互間在代謝動力學(xué)和效應(yīng)動力學(xué)方面存在復(fù)雜的相互作用。聯(lián)合作用用化學(xué)物單獨的作用外推顯然是不科學(xué)的。傳統(tǒng)實驗方法需要消耗大量的動物，周期長，成本高。微陣列技術(shù)對未知毒作用的混合物，通過檢測基因表達圖譜和數(shù)據(jù)庫檢索，可預(yù)測混合物毒作用方式及有害健康效應(yīng)。在已經(jīng)明確毒效應(yīng)的動物模型上，將混合物染毒后的基因表達譜與每一單個化學(xué)物染毒后的基因表達譜進行比較，分析不同化學(xué)物間可能的相互作用。第21頁/共27頁3.5危險度評定任一次單化學(xué)物的暴露都可能引起成千上萬個基因的反應(yīng)，而人類是暴露在一個多元的環(huán)境中，反應(yīng)更加復(fù)雜。故傳統(tǒng)對化學(xué)物的暴露評價需要很長時間的研究和標準的制訂。目前采用的暴露生物標志多為血液或組織中的毒物或其代謝產(chǎn)物、DNA加合物、組織病理學(xué)及生化方面的改變，其數(shù)量有限且多不具備足夠的靈敏和特異。通過微陣列技術(shù)測定的基因表達譜的改變，可能成為新型的靈敏生物標志。芯片技術(shù)可是遺傳多態(tài)性的檢測和基因分型變得簡單快捷?？蓭椭U明個體對不同環(huán)境因素的易感機制，篩選和確定易感人群，為進一步的流行病學(xué)調(diào)查和針對性預(yù)防提供依據(jù)。第22頁/共27頁3.6表型錨定表型錨定：是將特定的基因圖譜改變與特定劑量或時間條件下的毒性損害相聯(lián)系的過程。錨定的條件：因影響因素和反應(yīng)的復(fù)雜性，需要將毒理基因組學(xué)與計算機科學(xué)相結(jié)合。注意：基因組、蛋白質(zhì)組、轉(zhuǎn)錄組和代謝組的狀態(tài)是一個動態(tài)的過程，即受到時間、飲食、運動、病理生理和遺傳背景等因素的影響。第23頁/共27頁3.7信息整合信息整合的目的是將基因組學(xué)數(shù)據(jù)實現(xiàn)可比和共享。其包括三層含義：對經(jīng)暴露后一