基因工程基因工程的載體

（優(yōu)選）基因工程基因工程的載體當(dāng)前1頁(yè)，總共176頁(yè)。Office:Room409ofExperimentBuildingNo.3

:06358230050,

:glzhou@:448953745Instructor:GuoLiZHOUAssociateProfessor,Ph.D.UniversityofLiaocheng,Liaocheng,CHN基因工程的載體第3章

當(dāng)前2頁(yè)，總共176頁(yè)。Generalizedoverviewofcloningstrategies,withfavouredroutesshownbyarrows.333*當(dāng)前3頁(yè)，總共176頁(yè)。CONTENTS質(zhì)粒載體噬菌體載體柯斯質(zhì)粒載體人工染色體載體Specialistpurposevectors4當(dāng)前4頁(yè)，總共176頁(yè)。重點(diǎn)與難點(diǎn)內(nèi)容質(zhì)粒載體的基本特性、圖譜識(shí)別及應(yīng)用噬菌體載體的特性、類型、及應(yīng)用其它類型載體的特性及其應(yīng)用克隆載體與表達(dá)載體組成及區(qū)別5重點(diǎn)各種載體的選擇方法及應(yīng)用難點(diǎn)當(dāng)前5頁(yè)，總共176頁(yè)。

遺傳物質(zhì)

+載體

重組的DNA分子

引入細(xì)胞或生物體內(nèi)

復(fù)制與表達(dá)

穩(wěn)定地遺傳給下代引言6當(dāng)前6頁(yè)，總共176頁(yè)。

1）獨(dú)立的一個(gè)包括啟動(dòng)子（promoter)、編碼區(qū)（encodingregion)和終止子（terminator)的基因，or組成基因的某個(gè)元件，一般是不可以進(jìn)入受體細(xì)胞的；

2）采用理化方法進(jìn)入細(xì)胞后，也不容易在受體細(xì)胞內(nèi)維持。所以，通過(guò)不同途徑能將承載的外源DNA片段帶入受體細(xì)胞，并在其中得以維持的DNA分子稱為基因工程載體。DNA7當(dāng)前7頁(yè)，總共176頁(yè)。載體（vector)是由在細(xì)胞中能夠自主復(fù)制的DNA分子構(gòu)成的一種遺傳成分；基因工程中，攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的工具稱為載體。目的基因能否有效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，并在其中維持高效表達(dá)，在很大程度上決定于載體。載體的概念8當(dāng)前8頁(yè)，總共176頁(yè)。載體的功能運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件載體的功能9當(dāng)前9頁(yè)，總共176頁(yè)。

A、復(fù)制起點(diǎn)：能在受體中復(fù)制；B、篩選標(biāo)記；C、限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)；D、載體的大?。涸瓌t上要求載體越小越好；E、適當(dāng)?shù)目截悢?shù)；F、載體的安全性：質(zhì)粒不能隨便轉(zhuǎn)移;G、外源基因的表達(dá)：?jiǎn)?dòng)子。載體的要求10當(dāng)前10頁(yè)，總共176頁(yè)。按功能分類克隆載體克隆一個(gè)基因或DNA片斷表達(dá)載體用于一個(gè)基因的蛋白表達(dá)整合載體把一個(gè)基因插入到染色體組中按來(lái)源分類質(zhì)粒載體噬菌體載體柯斯質(zhì)粒載體人工染色體載體載體的分類11當(dāng)前11頁(yè)，總共176頁(yè)。載體的種類和特征質(zhì)粒*受體細(xì)胞結(jié)構(gòu)插入片斷舉例

E.coli環(huán)狀＜

8kbpUC18/19,T-載體等

λ噬菌體E.coli線狀9-24kbEMBL系列，λgt系列絲狀噬菌體及噬菌粒E.coli環(huán)狀＜

10kbM13mp系列粘粒載體E.coli環(huán)狀35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBAC(BacterialArtificialChromosome)E.coli環(huán)狀≈300kbPeloBAC系列YAC(YeastArtificialchromosome)酵母細(xì)胞線性染色體100-2000kbMAC(MammalianArtificialChromosome)哺乳類細(xì)胞線性染色體＞

1000kb病毒載體動(dòng)物細(xì)胞環(huán)狀SV40載體，昆蟲(chóng)桿狀病毒載體穿梭載體動(dòng)物細(xì)胞和細(xì)菌環(huán)狀pSVK3質(zhì)粒，PBV,Ti質(zhì)粒12當(dāng)前12頁(yè)，總共176頁(yè)。1.質(zhì)粒載體13*Whatareplasmids?當(dāng)前13頁(yè)，總共176頁(yè)。1.1質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性Plasmidsareextrachromosomageneticelementsthatarenotessentialforbacteriatosurvivebutoftenconferadvantageoustraits(suchasantibioticresistance)onthehostcell.14定義：染色體之外的遺傳物質(zhì),可自主復(fù)制并穩(wěn)定遺傳*Whatareplasmids?當(dāng)前14頁(yè)，總共176頁(yè)。1.1質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性15常見(jiàn)于原核細(xì)菌和真菌中,某些藍(lán)藻、真菌和綠藻中也有發(fā)現(xiàn)*絕大多數(shù)的是DNA（除了酵母的殺傷質(zhì)粒（killerplasmid）是一種RNA質(zhì)粒外）化學(xué)本質(zhì)來(lái)源當(dāng)前15頁(yè)，總共176頁(yè)。1.1質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性16對(duì)細(xì)菌的存活非必須，但常具有某些有利性狀（如抗生素抗性）*絕大多數(shù)為cccDNA（covalentlyclosedcircularDNA，共價(jià)、閉合、環(huán)狀DNA分子），極少的天然質(zhì)粒是線狀的結(jié)構(gòu)性質(zhì)當(dāng)前16頁(yè)，總共176頁(yè)。質(zhì)粒的各種表型質(zhì)粒在原核生物中分布廣泛，大小不一，從1-200kb不等，通常非宿主所必需。常具有各種特殊表型，表中已列出，如抗生素抗性、糖酵解、重金屬抗性、誘導(dǎo)植物腫瘤等等。17當(dāng)前17頁(yè)，總共176頁(yè)。18當(dāng)前18頁(yè)，總共176頁(yè)。Plasmidsarerepliconswhicharestablyinheritedinanextrachromosomalstate.191.2ThreeConformations（三種構(gòu)型）染色體之外的可穩(wěn)定遺傳的復(fù)制子，多數(shù)為環(huán)狀dsDNA分子Q：什么叫復(fù)制子？當(dāng)前19頁(yè)，總共176頁(yè)。雙鏈完整，則為cccDNA(共價(jià)閉合環(huán)狀DNA)雙鏈中只有一條完整，則為開(kāi)環(huán)DNA(OCDNA)Mostplasmidsexistasdouble-strandedcircularDNAmolecules.IfbothstrandsofDNAareintactcirclesthemoleculesaredescribedascovalentlyclosedcirclesorcccDNA.Ifonlyonestrandisintact,thenthemoleculesaredescribedasopencirclesorOCDNA.20當(dāng)前20頁(yè)，總共176頁(yè)。21松弛的cccDNA開(kāi)環(huán)的DNA(ocDNA)超螺旋DNA(scDNA)DNA旋轉(zhuǎn)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶內(nèi)切酶內(nèi)切酶DNA連接酶在天然狀態(tài)下，噬菌體Ф×174RF2的DNA就是開(kāi)環(huán)DNA的形式。當(dāng)前21頁(yè)，總共176頁(yè)。*三種構(gòu)型22當(dāng)前22頁(yè)，總共176頁(yè)。同一質(zhì)粒盡管分子量相同，不同的構(gòu)型電泳遷移率不同：scDNA最快、lDNA次之、ocDNA最慢。開(kāi)環(huán)DNA(ocDNA)多數(shù)是在提取過(guò)程中或其他原因使超螺旋DNA(scDNA)分子上一條鏈被打斷而形成一個(gè)切口，此時(shí)超螺旋DNA松開(kāi)形成開(kāi)環(huán)DNA分子。即使它們?cè)低环肿?，但因其狀態(tài)不同，如L(線狀DNA)，OC，SC的區(qū)別，在凝膠電泳時(shí)的遷移率也不相同。ocDNA在電泳時(shí)通常跑得最慢。*三種構(gòu)型23當(dāng)前23頁(yè)，總共176頁(yè)。1.3分類:結(jié)合型和非結(jié)合型兩種Plasmidscanbecategorizedintooneoftwomajortype–conjugativeornon-conjugative–dependinguponwhetherornottheycarryasetoftransfergenes,calledthetragenes,whichpromotebacterialconjugation.

根據(jù)是否帶有一套的轉(zhuǎn)移基因（tra）可分為結(jié)合型和非結(jié)合型兩種Tra基因可促使細(xì)菌發(fā)生結(jié)合24當(dāng)前24頁(yè)，總共176頁(yè)。25當(dāng)前25頁(yè)，總共176頁(yè)。TraproteinfromconjugativeplasmidbomsiteMobgenemobmRNAMobproteinopenrecipientcellhelperplasmid即mob基因的產(chǎn)物可打開(kāi)非接合質(zhì)粒的oriT位點(diǎn)，借助接合質(zhì)粒tra基因的產(chǎn)物，使非接合質(zhì)粒被動(dòng)遷移到受體細(xì)胞中，這種現(xiàn)象稱為遷移作用(mobilization)。質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性26當(dāng)前26頁(yè)，總共176頁(yè)。R質(zhì)粒因同時(shí)具有tra和mob，可以進(jìn)行接合和轉(zhuǎn)移ColE1因僅有mob，沒(méi)有tra，所以僅能進(jìn)行轉(zhuǎn)移，而不能接合。它只能通過(guò)F或F類似的質(zhì)粒進(jìn)行接合和轉(zhuǎn)移。27當(dāng)前27頁(yè)，總共176頁(yè)。如果tra和mob都缺失，不能接合，也不能轉(zhuǎn)移。如果缺失了一部分的mob，且缺失的部分僅與轉(zhuǎn)移蛋白的拷貝有關(guān)，可通過(guò)另一組基因nic/bom來(lái)代償。順式作用元件nic/bom不會(huì)與其它質(zhì)粒發(fā)生交換，因此從生物安全的角度看，非接合質(zhì)粒是安全的。這是它作為載體的第一個(gè)有利條件。非接合質(zhì)粒的高拷貝是人工構(gòu)建載體的第二個(gè)有利條件！28當(dāng)前28頁(yè)，總共176頁(yè)。1.3分類:松弛型和嚴(yán)緊型兩種Plasmidscanalsobecategorizedonthebasisoftheirbeingmaintainedasmultiplecopiespercell(relaxedplasmids)orasalimitednumberofcopiespercell(stringentplasmids).質(zhì)?？截悢?shù)：即一個(gè)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒的數(shù)量與染色體數(shù)量之比。每種質(zhì)粒在相應(yīng)的宿主細(xì)胞內(nèi)保持相對(duì)穩(wěn)定的拷貝數(shù)。29還可根據(jù)每個(gè)細(xì)胞中質(zhì)粒拷貝數(shù)的多寡分為兩類：松弛型和嚴(yán)緊型。*當(dāng)前29頁(yè)，總共176頁(yè)。Generally,conjugativeplasmidsareofrelativelyhighmolecularweightandarepresentasonetothreecopiesperchromosome,whereasnon-conjugativeplasmidsareoflowmolecularweightandpresentasmultiplecopiesperchromosome.AnexceptionistheconjugativeplasmidR6K,whichhasamolecularweightof25×106daltonsandismaintainedasarelaxedplasmid.30嚴(yán)緊型質(zhì)粒(stringentplasmids)：alimitednumberofplasmidcopiespercell。接合型質(zhì)粒，分子量大，低拷貝數(shù)，1－3拷貝（質(zhì)粒R6K例外）松弛型質(zhì)粒（relaxedplasmid）：Relaxedplasmidsareplmidswithmultiplecopiespercell。非接合型質(zhì)粒，分子量小，高拷貝數(shù)，10－60拷貝，不會(huì)自行接合轉(zhuǎn)移，較安全當(dāng)前30頁(yè)，總共176頁(yè)。1.4INCOMPATIBILITYOFPLASMIDS

(質(zhì)粒的不相容性)質(zhì)粒的不相容性:在沒(méi)有選擇壓力的情況下，任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能在同一宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的共存的現(xiàn)象。31不相容性質(zhì)粒：不能共存于同一細(xì)胞內(nèi)的不同質(zhì)粒相容性質(zhì)粒：可以共存于同一細(xì)胞內(nèi)的不同質(zhì)粒Plasmidincompatibility

istheinabilityoftwodifferentplasmidstocoexistinthesamecellintheabsenceofselectionpressure.ThetermincompatibilitycanonlybeusedwhenitiscertainthatentryofthesecondplasmidhastakenplaceandthatDNArestrictionisnotinvolved.當(dāng)前31頁(yè)，總共176頁(yè)。MOLECULARMECHANISM

（質(zhì)粒不相容性的分子機(jī)制）兩種含有不同復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)各受自己的拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)恒定，因此在經(jīng)過(guò)若干復(fù)制周期和細(xì)胞分裂周期后仍能共處于同一細(xì)胞內(nèi)32兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)受到同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同，其中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的細(xì)胞分裂周期中更具優(yōu)勢(shì)*不相容性相容性當(dāng)前32頁(yè)，總共176頁(yè)。HOSTRANGEOFPLASMIDSThehostrangeofaplasmidisdeterminedbyitsoriregion.PlasmidswhoseoriregionisderivedfromplasmidColE1havearestrictedhostrange:theyonlyreplicateinentericbacteria,suchasE.coli,Salmonella,etc.OtherpromiscuousplasmidshaveabroadhostrangeandtheseincludeRP4andRSF1010.Plasmidswithabroadhostrangeencodemost,ifnotall,oftheproteinsrequiredforreplication.Theymustalsobeabletoexpressthesegenesandthustheirpromotersandribosomebindingsitesmusthaveevolvedsuchthattheycanberecognizedinadiversityofbacterialfamilies.33不同的質(zhì)粒有不同的宿主，但這都取決于質(zhì)粒的復(fù)制起始位點(diǎn)。來(lái)源于ColE1質(zhì)粒的復(fù)制起始位點(diǎn)ori，決定了這種質(zhì)粒的宿主只能是腸道來(lái)源的細(xì)菌。而宿主范圍廣泛的質(zhì)粒，則必須能表達(dá)多種蛋白才能適應(yīng)不同的宿主。*當(dāng)前33頁(yè)，總共176頁(yè)。PROTEINSENCODEDBYPLASMIDSPlasmidsencodeonlyafewoftheproteinsrequiredfortheirownreplicationandinmanycasesencodeonlyoneofthem.Alltheotherproteinsrequiredforreplication,e.g.DNApolymerases,DNAligase,helicases,etc.,areprovidedbythehostcell.Thosereplicationproteinsthatareplasmid-encodedarelocatedveryclosetotheori(originofreplication)sequencesatwhichtheyact.Thus,onlyasmallregionsurroundingtheorisiteisrequiredforreplication.Otherpartsoftheplasmidcanbedeletedandforeignsequencescanbeaddedtotheplasmidandreplicationwillstilloccur.Thisfeatureofplasmidshasgreatlysimplifiedtheconstructionofversatilecloningvectors.34質(zhì)粒本身編碼的蛋白相當(dāng)少，許多與復(fù)制有關(guān)的蛋白都由宿主提供；質(zhì)粒自身編碼的與復(fù)制有關(guān)的蛋白則緊鄰復(fù)制起點(diǎn)ori；由于與質(zhì)粒復(fù)制有關(guān)的序列都在ori附近區(qū)域，其他部位則可刪除或替換成其他基因，這非常有利于克隆載體的構(gòu)建。*當(dāng)前34頁(yè)，總共176頁(yè)。1.6質(zhì)粒載體的選擇Anidealcloningvehiclewouldhavethefollowingfourdesirableproperties（載體應(yīng)具備的基本條件）35Replicationoriginisalsoessential.(復(fù)制起始位點(diǎn))—（質(zhì)粒本身就具備這一特征。）Areasonablyhighcopynumber(高拷貝數(shù)）*lowmolecularweight(低分子量);abilitytoconferreadilyselectablephenotypictraitsonhostcells（篩選標(biāo)記）;singlesitesforalargenumberofrestrictionendonucleases,preferablyingeneswithareadilyscorablephenotype.（大量的內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)；多克隆位點(diǎn)，它們應(yīng)該位于某選擇性標(biāo)志中）當(dāng)前35頁(yè)，總共176頁(yè)。1.6質(zhì)粒載體的選擇36*以增殖外源序列為目的（結(jié)構(gòu)上主要為載體本身必需的序列，分子量較?。┮员磉_(dá)外源序列為目的（結(jié)構(gòu)上多了一些與外源基因轉(zhuǎn)錄、翻譯有關(guān)的序列，分子量較大）克隆載體表達(dá)載體當(dāng)前36頁(yè)，總共176頁(yè)。表達(dá)質(zhì)粒載體是指專用于在宿主細(xì)胞中高水平表達(dá)外源蛋白質(zhì)的質(zhì)粒載體根據(jù)表達(dá)的蛋白是否分泌到細(xì)胞外：非分泌型表達(dá)載體（胞內(nèi)表達(dá)載體）和分泌型表達(dá)載體根據(jù)表達(dá)所用的受體細(xì)胞：原核細(xì)胞表達(dá)載體和真核細(xì)胞表達(dá)載體37當(dāng)前37頁(yè)，總共176頁(yè)。38當(dāng)前38頁(yè)，總共176頁(yè)。表達(dá)載體與克隆載體的區(qū)別強(qiáng)啟動(dòng)子，一個(gè)可誘導(dǎo)的強(qiáng)啟動(dòng)子可使外源基因有效的轉(zhuǎn)錄在啟動(dòng)子下游區(qū)和ATG（起始密碼子）上游區(qū)有一個(gè)好的核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列（SD序列），促進(jìn)蛋白質(zhì)翻譯在外源基因插入序列的下游區(qū)要有一個(gè)強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止序列，保證外源基因的有效轉(zhuǎn)錄和mRNA的穩(wěn)定性39當(dāng)前39頁(yè)，總共176頁(yè)。表達(dá)型載體（expressionvector）

特點(diǎn)基因的啟動(dòng)子序列和終止子序列一般無(wú)檢測(cè)標(biāo)記基因克隆位點(diǎn)是確定的（即位于啟動(dòng)子序列后）重組分子用凝膠電泳檢出（依賴于分子量差異）。結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化單元--宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化表達(dá)單元--外源基因表達(dá)40當(dāng)前40頁(yè)，總共176頁(yè)。表達(dá)型載體（expressionvector）顯然,不同類型載體中所缺少的部分必須由外源基因提供。換言之,被表達(dá)的外源基因一旦確定,表達(dá)載體的類型也就確定了。用途表達(dá)外源基因以產(chǎn)生大量外源基因產(chǎn)物用于構(gòu)建cDNA文庫(kù)41當(dāng)前41頁(yè)，總共176頁(yè)。THEADVANTAGESOFALOWMOLECULARWEIGH

（低分子量的優(yōu)點(diǎn)）Theplasmidismucheasiertohandle,i.e.itismoreresistanttodamagebyshearing,andisreadilyisolatedfromhostcells.（易處理，如抵抗物理剪切力強(qiáng)，易從宿主中分離提?。㎜ow-molecular-weightplasmidsareusuallypresentasmultiplecopies,andthisnotonlyfacilitatestheirisolationbutleadstogenedosageeffectsforallclonedgenes.（多為多拷貝形式，這樣利于提?。￤ithalowmolecularweightthereislesschancethatthevectorwillhavemultiplesubstratesitesforanyrestrictionendonuclease.(分子量低，則內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)少)42轉(zhuǎn)化效率與質(zhì)粒DNA分子大小相關(guān)，小分子量的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化率高；質(zhì)?？寺≥d體分子量小，可承載較大的外源DNA片斷。當(dāng)前42頁(yè)，總共176頁(yè)。多克隆位點(diǎn)（MCS）Polylinkerormultiplecloningsites(MCS)isashortDNAsequence,carryingsitesformanydifferentrestrictionendonulceases.（載體上人工構(gòu)建的。一段短的DNA序列，攜帶有許多不同限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。）43*BycombiningthemwithinanMCS,thesitesaremadecontiguous,sothatanytwositeswithinitcanbecleavedsimultaneouslywithoutexcisingvectorsequences.AnMCSincreasesthenumberofpotentialcloningstrategiesavailablebyextendingtherangeofenzymesthatcanbeusedtogeneratearestrictionfragmentsuitableforcloning.當(dāng)前43頁(yè)，總共176頁(yè)。44Fig.MapofplasmidpUC18.(b)Thepolylinkerregion.Thishasmultiplerestrictionsitesimmediatelydownstreamfromthelacpromoter(Plac).Thein-frameinsertusedtocreatetheMCSishatched.PlasmidpUC19isidenticalwithpUC18apartfromtheorientationofthepolylinkerregion,whichisreversed.Whataremeans?當(dāng)前44頁(yè)，總共176頁(yè)。1.6.1第一個(gè)用于基因克隆的天然質(zhì)粒PSC101野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點(diǎn)少、遺傳標(biāo)記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)進(jìn)行人工構(gòu)建451973年，世界上第一例有目的的重組實(shí)驗(yàn)所采用的質(zhì)粒載體pSC101當(dāng)前45頁(yè)，總共176頁(yè)。天然質(zhì)粒的缺陷？（1）分子量大，拷貝數(shù)低，酶切位點(diǎn)少第一個(gè)用于基因克隆的天然質(zhì)粒pSC101，分子量9.1kb。但只有一個(gè)EcoRI切點(diǎn)充當(dāng)克隆位點(diǎn)，Tetr作為篩選標(biāo)志。（2）篩選標(biāo)志不理想ColE1質(zhì)粒的篩選標(biāo)志是大腸桿菌素E1（colicinE1）。colicinE1能殺死不含ColE1質(zhì)粒的菌，形成“噬菌斑”。唯一的克隆位點(diǎn)EcoRI正好位于這個(gè)基因的內(nèi)部。因此可通過(guò)插入失活篩選。但細(xì)菌群體容易自發(fā)突變出抗colicinE1的細(xì)胞.46當(dāng)前46頁(yè)，總共176頁(yè)。人工改造的克隆載體PBR322及插入失活原理47pBR322是經(jīng)人工改造的一種較為理想的大腸桿菌質(zhì)粒載體，應(yīng)用最為廣泛?，F(xiàn)在已經(jīng)被許多更優(yōu)良的新型克隆載體所替代。分子量在歷次的改造中有一定的變化（4362~4363~4361）“p”表示它是一種質(zhì)粒；

“BR”則是分別取自該質(zhì)粒的兩位主要構(gòu)建者F．Bo1ivar和姓氏的頭一個(gè)字母，

“322”系指實(shí)驗(yàn)室編號(hào)，以與其他質(zhì)粒載體如pBR325，pBR327，pBR328等相區(qū)別。Innamingplasmids,pisusedtodesignateplasmid,andthisisusuallyfollowedbytheinitialsoftheworker(s)whoisolatedorconstructedtheplasmid.

Numbersmaybeusedtoclassifytheparticularisolate.當(dāng)前47頁(yè)，總共176頁(yè)。48ConstructionofpBR322involvedaseriesofmanipulationstogettherightpiecesofDNAtogether,withthefinalresultcontainingDNAfromthreesources.當(dāng)前48頁(yè)，總共176頁(yè)。THEPEDIGREEOFPBR322(PBR322的譜系)491）復(fù)制起始位點(diǎn)：源于ColE1衍生質(zhì)粒pMB1。目前實(shí)驗(yàn)室使用的大腸桿菌質(zhì)粒大多也是由這少數(shù)幾個(gè)野生型質(zhì)粒構(gòu)建的。2）Apr基因：源于pSF2124質(zhì)粒轉(zhuǎn)座子Tn3。3）Tcr基因：源于pSC101質(zhì)粒。當(dāng)前49頁(yè)，總共176頁(yè)。AsummaryoftheoriginsofpBR322.

50當(dāng)前50頁(yè)，總共176頁(yè)。PBR322的篩選方式：

INSERTIONALINACTIVATION（插入失活）其中有7種限制酶：EcoRV,NheI,BamHI,SphI,SalI,XmaIII和NruI，它們的識(shí)別位點(diǎn)是位于四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，另外有2種限制酶：ClaI和HindIII的識(shí)別位點(diǎn)是存在于這個(gè)基因的啟動(dòng)區(qū)內(nèi)，在這9個(gè)限制位點(diǎn)上插入外源DNA都會(huì)導(dǎo)致tetr基因的失活；51還有3種限制酶(ScaI、PvuI和PstI)在氨芐青霉素抗性基因（ampr）內(nèi)具有單一的識(shí)別位點(diǎn)，在這個(gè)位點(diǎn)插入外源DNA則會(huì)導(dǎo)致ampr基因的失活。*這種因DNA插入而導(dǎo)致基因失活的現(xiàn)象，稱之為插入失活效應(yīng)。當(dāng)前51頁(yè)，總共176頁(yè)。52當(dāng)外源DNA片段插入Tcr基因后，導(dǎo)致Tcr基因失活，使質(zhì)粒變成只對(duì)Amp有抗性?；蛘咄庠椿虿迦階mpr基因中，則會(huì)導(dǎo)致Ampr基因失活，這個(gè)質(zhì)粒就變成只對(duì)Tc有抗性。這樣通過(guò)對(duì)抗生素的雙抗或單抗來(lái)篩選是否有外源片段插入。篩選標(biāo)記－插入失活*當(dāng)前52頁(yè)，總共176頁(yè)。1.6.2PUC18/19(ALACselectionplasmid)

（PUC18/19和藍(lán)白斑篩選原理）UniversityofCalifornia的J.Messing和J.Vieria于1978年，在pBR322的基礎(chǔ)上改造而成.53pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC12、pUC13、pUC18、pUC19當(dāng)前53頁(yè)，總共176頁(yè)。StructureofpUC18/19ori：來(lái)自pBR322質(zhì)粒。Amprgene：來(lái)自pBR322質(zhì)粒PromoteroflacZ：來(lái)自大腸桿菌lacZ’gene：大腸桿菌lacZ的-肽鏈序列，是LacZ

的氨基端片段54MCS（mutiplecloningsite,多克隆位點(diǎn)）：10個(gè)連續(xù)的單酶切位點(diǎn)，位于lacZ’基因的5’端。當(dāng)前54頁(yè)，總共176頁(yè)。pUC18/19與pBR322在結(jié)構(gòu)上的主要差別在于：用乳糖操縱子的一個(gè)DNA片段（466bp）替換了pBR322選擇標(biāo)記Tcr

基因——于是篩選原理也不同（藍(lán)白斑篩選）。此DNA片段含有乳糖操縱子的啟動(dòng)子、調(diào)節(jié)因子和β－半乳糖苷酶的α-肽基因。55Q：lac操縱子的結(jié)構(gòu)？當(dāng)前55頁(yè)，總共176頁(yè)。Xgal（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl--D-galactoside）：是-半乳糖苷酶的作用底物，無(wú)色，但酶解后可生成有色物質(zhì)—5-溴-4-氯靛藍(lán)IPTG：誘導(dǎo)物，與LacI的基因產(chǎn)物——阻遏蛋白結(jié)合，使之轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)活性形式而不能與操作子結(jié)合，于是RNA聚合酶就能起始LacZ’基因的轉(zhuǎn)錄（肽）。56當(dāng)前56頁(yè)，總共176頁(yè)。

Blue/White

Screening(藍(lán)白斑篩選)Theactivityoftheenzymeβ-galactosidaseiseasily

monitoredbyincludinginthegrowthmediumthe

chromogenicsubstrate5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside(X-gal).Thiscompoundiscolourless

butoncleavagereleasesablueindolylderivative.Onsolidmedium,coloniesthatareexpressingactive

β-galactosidaseareblueincolourwhilethosewithouttheactivityarewhiteincolour.Thisisoftenreferredtoasblue/whitescreening.SinceXgalisnotaninducerofb-galactosidase,thenon-substrate(gratuitous)inducerisopropyl-β-D-thiogalactoside(IPTG)isalsoaddedtothemedium.57*當(dāng)前57頁(yè)，總共176頁(yè)。藍(lán)白斑篩選原理58插入了外源基因后，由于插入位置是LacZ’基因的5’端，基因結(jié)構(gòu)被破壞，則不能產(chǎn)生肽，于是沒(méi)有活性的-半乳糖甘酶，X-gal也不被水解，底物就仍為白色。重組菌落就是白色，非重組菌就是藍(lán)色?！^藍(lán)白斑篩選。沒(méi)插入外源序列時(shí)，誘導(dǎo)物IPTG與LacI的基因產(chǎn)物——阻遏蛋白結(jié)合，使之轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)活性形式而不能與操作子結(jié)合，

LacZ’基因正常轉(zhuǎn)錄表達(dá)，產(chǎn)生的肽與宿主細(xì)胞產(chǎn)生的-半乳糖甘酶的C端部分互補(bǔ)，形成有活性的四聚體結(jié)構(gòu)的β半乳糖苷酶，可將底物X-gal水解，產(chǎn)生藍(lán)色化合物。載體上：LacZ’基因（carryingtheN-terminal

fragmentofthelacZgene，編碼-半乳糖甘酶的N端部分，肽，146aa）。宿主：lacZ基因缺陷型，只表達(dá)-半乳糖甘酶的C端部分*當(dāng)前58頁(yè)，總共176頁(yè)。-Complementation(—互補(bǔ))pUC質(zhì)粒結(jié)構(gòu)中的lacZ’基因所編碼的—肽鏈（是β-半乳糖苷酶基因的N端末端）可參與-互補(bǔ)作用。這種載體適合于可編碼β—半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細(xì)胞。雖然質(zhì)粒和宿主編碼的片段各自均無(wú)活性，但它們共處一個(gè)細(xì)胞中時(shí)可融為一體，形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。這種使LacZ基因缺失各一部分突變體的互補(bǔ)，叫做α-互補(bǔ)。59*當(dāng)前59頁(yè)，總共176頁(yè)。IPTG誘導(dǎo)的結(jié)果：MCS無(wú)外源基因插入時(shí)，互補(bǔ)，產(chǎn)生藍(lán)色菌斑。（說(shuō)明藍(lán)色代表非重組子）MCS有外源基因插入時(shí)，不互補(bǔ)，產(chǎn)生白色菌斑。（說(shuō)明白色代表重組子）60通過(guò)看培養(yǎng)皿上的菌斑的顏色就能直接知道是否有DNA插入。*溫馨提示：南開(kāi)大學(xué)曾考過(guò)相關(guān)的考研題目！當(dāng)前60頁(yè)，總共176頁(yè)。1.6.3T

Vector（T載體和TA克隆原理）現(xiàn)象：普通的Taq酶會(huì)自動(dòng)給PCR產(chǎn)物的3’末端添加一個(gè)A。原理：普通的Taq酶能夠在PCR產(chǎn)物3’末端加上一個(gè)非模板依賴的A，而T載體是一種帶有3’T突出端的線性載體，在連接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR產(chǎn)物直接插入到質(zhì)粒載體MCS中。操作最簡(jiǎn)單，快速和高效，是Taq聚合酶PCR產(chǎn)物的最佳克隆方法由Invitrogen公司（SanDiego，CA）發(fā)展而來(lái)的商業(yè)性試劑盒，用于PCR產(chǎn)物的克隆和測(cè)序。61*當(dāng)前61頁(yè)，總共176頁(yè)。1.6.3T

VECTOR（T載體和TA克隆原理）62*TA克隆的優(yōu)點(diǎn)不需使用含限制酶序列的引物；不需把PCR產(chǎn)物做平端處理；不需在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上加接頭，即可直接進(jìn)行克隆。

當(dāng)前62頁(yè)，總共176頁(yè)。PMD18-T圖譜63當(dāng)前63頁(yè)，總共176頁(yè)。PSK-T載體圖譜pSK-Tvector兩側(cè)的3`端，具有突出的堿基T，可以和PCR產(chǎn)物3’末端的A堿基互補(bǔ)，從而大大提高PCR產(chǎn)物的連接、克隆效率?？赏ㄟ^(guò)α互補(bǔ)的顏色反應(yīng)來(lái)篩選重組子64當(dāng)前64頁(yè)，總共176頁(yè)。PUC18-T克隆載體圖譜65當(dāng)前65頁(yè)，總共176頁(yè)。1.6.4TIPlasmid(TI質(zhì)粒與植物基因工程)Ti（tumor-inducingplasmid）質(zhì)粒：根癌農(nóng)桿菌含有一種內(nèi)源質(zhì)粒，大小因種類而異，在200－250kb之間。當(dāng)農(nóng)桿菌同植物接觸時(shí)，Ti質(zhì)粒中有一段DNA，大約在15kb-30kb，稱為T(mén)-DNA（transferred-DNA），能轉(zhuǎn)移并整合到植物基因組中，刺激植物細(xì)胞不受控制的分裂，形成瘤。66*當(dāng)前66頁(yè)，總共176頁(yè)。1.6.4TIPlasmid(TI質(zhì)粒與植物基因工程)67章魚(yú)堿型胭脂堿型農(nóng)桿堿型農(nóng)桿菌素型琥珀堿型根據(jù)其誘導(dǎo)的植物冠癭瘤中所合成的冠癭堿種類，Ti質(zhì)粒進(jìn)行分類*由于載體上還會(huì)有其他與翻譯有關(guān)的基因構(gòu)建，因此Ti質(zhì)粒是一種表達(dá)載體。當(dāng)前67頁(yè)，總共176頁(yè)。冠癭瘤和根癌農(nóng)桿菌68上：電鏡下的根癌農(nóng)桿菌右：冠癭瘤把瘤組織培養(yǎng)在不加生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基上，能夠無(wú)限制的分裂和生長(zhǎng)。當(dāng)前68頁(yè)，總共176頁(yè)。TI質(zhì)粒分為4個(gè)功能區(qū)：Con區(qū)：與細(xì)菌間接合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因，調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移

Ori區(qū)：Ori區(qū)上的基因調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制。69Vir區(qū)上的基因能激活T-DNA轉(zhuǎn)移，使根癌農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性*從Ti質(zhì)粒上被切割下來(lái)轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的一段DNA，含有編碼植物激素（生長(zhǎng)素）和冠癭堿的基因Vir區(qū)T－DNA區(qū)當(dāng)前69頁(yè)，總共176頁(yè)。章魚(yú)堿型pTiAch5和胭脂堿型pTic58質(zhì)?；驁D70T－DNA區(qū)Vir區(qū)Ori區(qū)Con區(qū)當(dāng)前70頁(yè)，總共176頁(yè)。T-DNACompleteTi-plasmidDNAisnotfoundinplanttumourcellsbutasmall,specificsegmentoftheplasmid,about23kbpinsize,isfoundintegratedintheplantnuclearDNAatanapparentlyrandomsite.ThisDNAsegmentiscalledT-DNA(transferredDNA).Itcarriesgenesthatconferbothunregulatedgrowthandtheabilitytosynthesizeopinesuponthetransformedplanttissue.However,thesegenesarenon-essentialfortransferandcanbereplacedwithforeignDNA.71Ti質(zhì)粒進(jìn)入植物細(xì)胞的只是一小部分，約23kb。能轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞內(nèi)的這一小段DNA片段稱為T(mén)－DNA（transferred-DNA）*當(dāng)前71頁(yè)，總共176頁(yè)。BORDERSEQUENCE(邊界序列)IntheTiplasmiditself,theT-DNAisflankedby25bpimperfectdirectrepeatsknownasbordersequence.T－DNA左右兩端邊界各有一個(gè)25bp長(zhǎng)的正向重復(fù)序列(左邊界(leftborder,LB)，右邊界(rightborder,RB))，在不同Ti質(zhì)粒中高度保守。它在T-DNA的切除及整合過(guò)程具有重要意義。右邊界的存在對(duì)外源基因整合到植物基因組中相當(dāng)重要，但左邊界則非必須。DeletionoftherightborderrepeatabolishesT-DNAtransfer,buttheleft-handbordersurprisinglyappearstobenon-essential.72*當(dāng)前72頁(yè)，總共176頁(yè)。BORDERSEQUENCE(邊界序列)73邊界序列對(duì)T－DNA轉(zhuǎn)移和整合不可缺少；已證實(shí)只要保留兩端邊界序列，雖然中間序列不同程度被外源片斷所替換，仍可轉(zhuǎn)移整合到植物基因組中－Ti質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化的理論依據(jù)。*當(dāng)前73頁(yè)，總共176頁(yè)。TI質(zhì)粒作為轉(zhuǎn)基因載體的缺陷轉(zhuǎn)化后會(huì)產(chǎn)生植物激素，阻礙轉(zhuǎn)化細(xì)胞的再生（因此這部分基因序列要?jiǎng)h除）；冠癭堿合成基因?qū)D(zhuǎn)基因植物意義不大（因此這部分基因序列也要?jiǎng)h除）；Ti質(zhì)粒長(zhǎng)約200-800kb，過(guò)于龐大（因此要?jiǎng)h除部分無(wú)關(guān)緊要的序列）；Ti質(zhì)粒不能在大腸桿菌中復(fù)制（因此要增加大腸桿菌的復(fù)制起始位點(diǎn)）。左右邊界序列要保留。74當(dāng)前74頁(yè)，總共176頁(yè)。75當(dāng)前75頁(yè)，總共176頁(yè)。76當(dāng)前76頁(yè)，總共176頁(yè)。(一）Ti質(zhì)粒的改造-雙元載體系統(tǒng)（binaryvetor）又叫二元載體系統(tǒng)，是指農(nóng)桿菌中用于把T-DNA區(qū)域轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞的雙質(zhì)粒系統(tǒng)。其中一個(gè)質(zhì)粒帶有毒性基因，另一質(zhì)粒帶有改造過(guò)的T-DNA區(qū)域，用于攜帶外源基因。77雙元載體系統(tǒng)當(dāng)前77頁(yè)，總共176頁(yè)。雙元表達(dá)載體系統(tǒng)主要包括兩個(gè)部分一部分為卸甲Ti質(zhì)粒，這類Ti質(zhì)粒由于缺失了T－DNA區(qū)域，完全喪失了致瘤作用，主要是提供Vir基因功能，激活處于反式位置上的T－DNA的轉(zhuǎn)移。另一部份是微型Ti質(zhì)粒(Mini-Tiplasmid)，它在T－DNA左右邊界序列之間提供植株選擇標(biāo)記如NPTII基因以及LacZ基因等。

雙元載體系統(tǒng)的構(gòu)建的原理是Ti質(zhì)粒上的Vir基因可以反式激活T－DNA的轉(zhuǎn)移。與共整合載體所不同的是，它不依賴兩個(gè)質(zhì)粒之間的同源序列，不需要共整合過(guò)程就能在農(nóng)桿菌內(nèi)獨(dú)立復(fù)制。78當(dāng)前78頁(yè)，總共176頁(yè)。雙元表達(dá)載體系統(tǒng)主要包括兩個(gè)部分79當(dāng)前79頁(yè)，總共176頁(yè)。80當(dāng)前80頁(yè)，總共176頁(yè)。81當(dāng)前81頁(yè)，總共176頁(yè)。（二）TI質(zhì)粒的改造—共整合載體系統(tǒng)指含有目的基因的中間表達(dá)載體與改造后的受體Ti質(zhì)粒通過(guò)同源重組所產(chǎn)生的一種復(fù)合型載體，通常又稱為共整合載體(co-integratedvector)；由于該載體的T-DNA區(qū)與Ti質(zhì)粒Vir區(qū)連鎖，因而又稱為順式載體(cis-vector)。

82共整合載體當(dāng)前82頁(yè)，總共176頁(yè)?；驹怼舱陷d體系統(tǒng)先通過(guò)pBR322插入一段T-DNA區(qū)段構(gòu)建中間載體，克隆目的基因。再將含有中間載體的大腸桿菌與含有Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌進(jìn)行細(xì)胞融合，兩個(gè)質(zhì)粒通過(guò)T-DNA的同源區(qū)段發(fā)生同源重組，最后在農(nóng)桿菌內(nèi)得到Vir共整合的Ｔi質(zhì)粒載體。83當(dāng)前83頁(yè)，總共176頁(yè)。構(gòu)建過(guò)程—共整合載體系統(tǒng)一種在一個(gè)普通大腸桿菌的克隆載體(如pBR322質(zhì)粒)中插入了一段合適的T-DNA片段而構(gòu)成的小型質(zhì)粒。84中間載體當(dāng)前84頁(yè)，總共176頁(yè)。構(gòu)建過(guò)程—共整合載體系統(tǒng)1）中間載體的表達(dá)構(gòu)建在中間載體中加上能在植物細(xì)胞中表達(dá)的各種啟動(dòng)子，可使外源基因在植物細(xì)胞中表達(dá)；當(dāng)啟動(dòng)子與顯性選擇標(biāo)記基因及報(bào)告基因連接，構(gòu)成嵌合基因(chimericgene)時(shí)，這些標(biāo)記基因同樣能表達(dá)，從而可提供用于篩選和鑒定的表型。這類含植物啟動(dòng)子的中間載體稱為中間表達(dá)載體(intermediateexpressionvector)。85當(dāng)前85頁(yè)，總共176頁(yè)。2）植物表達(dá)載體的構(gòu)建中間表達(dá)載體是不能將外源基因轉(zhuǎn)化進(jìn)植物細(xì)胞。因此，必須將中間表達(dá)載體引入到上述已改造的受體Ti質(zhì)粒中，并構(gòu)建成能侵染植物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)化載體(它是由兩種以上質(zhì)粒構(gòu)成的復(fù)合型載體，故稱之為載體系統(tǒng))，才能在植物基因轉(zhuǎn)化中應(yīng)用。86當(dāng)前86頁(yè)，總共176頁(yè)。為利用根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒，發(fā)展了一元載體系統(tǒng)和雙元載體系統(tǒng)。一元載體系統(tǒng)是指首先將目的基因插入到中間表達(dá)載體上，篩選出含有目的基因的重組分子，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌中，重組質(zhì)粒與Ti質(zhì)粒上的同源序列發(fā)生同源重組，將外源基因整合到Ti質(zhì)粒上，用于侵染植物細(xì)胞。T-DNA重組分子就可整合到植物細(xì)胞染色體DNA上。最后利用植物選擇標(biāo)記基因篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞。

87當(dāng)前87頁(yè)，總共176頁(yè)。88當(dāng)前88頁(yè)，總共176頁(yè)。89當(dāng)前89頁(yè)，總共176頁(yè)。90當(dāng)前90頁(yè)，總共176頁(yè)。植物表達(dá)載體PCAMBIA1300圖譜91質(zhì)粒載體左邊界右邊界植物標(biāo)記基因，MCS質(zhì)粒載體卡那霉素抗性基因潮霉素抗性基因來(lái)源于CaMV的啟動(dòng)子左邊界右邊界在大腸桿菌中的復(fù)制起點(diǎn)當(dāng)前91頁(yè)，總共176頁(yè)。右邊界左邊界大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)Gus基因（報(bào)告基因）92當(dāng)前92頁(yè)，總共176頁(yè)。CAMV35S啟動(dòng)子是植物基因工程中常用來(lái)構(gòu)建表達(dá)載體的一個(gè)啟動(dòng)子序列來(lái)自花椰菜花葉病毒，由于啟動(dòng)整個(gè)CaMV基因組的一小段重疊序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的沉降系數(shù)為35S，故將編碼該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的啟動(dòng)子稱之為35S啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子包括TATA盒、CAAT盒、倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列和增強(qiáng)子核心序列（GTGG/TTTG）。CaMV35S啟動(dòng)子加上來(lái)自AMV（苜?；ㄈ~病毒）的一段44bp的引導(dǎo)序列，可使其表達(dá)強(qiáng)度增加5倍（44bp序列是翻譯增強(qiáng)序列）。將加倍的CaMV35S啟動(dòng)子與AMV引導(dǎo)序列結(jié)合構(gòu)成一個(gè)復(fù)合串聯(lián)啟動(dòng)子，比未修飾的啟動(dòng)子表達(dá)增強(qiáng)20倍。93當(dāng)前93頁(yè)，總共176頁(yè)。其他類型的啟動(dòng)子馬鈴薯塊莖特異蛋白基因啟動(dòng)子小麥胚乳特異表達(dá)的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因（ADPG-lucosepyrphosphorylase)啟動(dòng)子番茄果實(shí)成熟特異性表達(dá)的多聚半乳糖醛酸酶基因(polygalacturnase)啟動(dòng)子花粉特異表達(dá)基因啟動(dòng)子（lat52）木質(zhì)部特異表達(dá)的苯丙氨酸脂肪酶基因(pal)啟動(dòng)子94當(dāng)前94頁(yè)，總共176頁(yè)。報(bào)告基因是標(biāo)記基因的一種。通常其編碼產(chǎn)物能夠被快速地測(cè)定，常用來(lái)判斷外源基因是否已經(jīng)成功地導(dǎo)入寄主細(xì)胞（器官或組織）并檢測(cè)其表達(dá)活性的一類特殊用途的基因，不需要依賴外界的壓力。常見(jiàn)的有：1、綠色熒光蛋白基因（GFP，greenfluorescenceprotein）2、β-葡萄糖苷酸酶基因（GUS基因，β-D-glucuronidase）3、熒光素酶基因（LUC，fireflyluciferase）4、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（CAT基因）95*當(dāng)前95頁(yè)，總共176頁(yè)。報(bào)告基因必須具備的條件有：(1)已被克隆和全序列已測(cè)定;

(2)表達(dá)產(chǎn)物在受體細(xì)胞中不存在，即無(wú)背景，在被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中無(wú)相似的內(nèi)源性表達(dá)產(chǎn)物;

(3)

報(bào)告基因編碼的產(chǎn)物的檢測(cè)應(yīng)該快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高而且重現(xiàn)性好，表達(dá)產(chǎn)物能進(jìn)行定量測(cè)定；(4)

細(xì)胞內(nèi)其它的基因產(chǎn)物不會(huì)干擾報(bào)告基因產(chǎn)物的檢測(cè)

96當(dāng)前96頁(yè)，總共176頁(yè)。JELLYFISHAEQUOREAVICTORIA:ONEOFTHEOLDESTSPECIESONTHEEARTH97當(dāng)前97頁(yè)，總共176頁(yè)。綠色熒光蛋白（GFP）GFP的首個(gè)重大改變是錢(qián)永健在1995年完成。GFP的單點(diǎn)突變（S65T）顯著提高了GFP的光譜性質(zhì)，熒光強(qiáng)度和光穩(wěn)定性也大大增強(qiáng)。突變后的GFP激發(fā)峰轉(zhuǎn)移至488nm，而發(fā)射峰仍保持在509nm，這和常用的FITC濾光片匹配，提高了GFP的應(yīng)用潛力。98Heim,R.,Cubitt,A.B.,&TsienR.Y.Improvedgreenfluorescence.Nature.1995Feb23;373(6516):663-4.*當(dāng)前98頁(yè)，總共176頁(yè)。99GFP標(biāo)記的微管表達(dá)綠色熒光蛋白的線蟲(chóng)當(dāng)前99頁(yè)，總共176頁(yè)。GUS基因GUS基因就是β-葡萄糖苷酸酶基因。該基因產(chǎn)物為β-葡萄糖苷酸酶，是一種水解酶，相當(dāng)穩(wěn)定而不易降解。測(cè)定方法非常簡(jiǎn)單，且可使用底物

在原位顯現(xiàn)出酶的活性，以肉眼即可檢測(cè)其產(chǎn)物，非常方便。常用的組織化學(xué)方法檢測(cè)GUS基因的表達(dá)：以無(wú)色的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸（X-Gluc）作為反應(yīng)底物，將被檢材料用含有底物的緩沖液浸泡。若該組織細(xì)胞含有g(shù)us基因且有表達(dá)，在適宜的條件下，該酶就可將X-Gluc水解生成藍(lán)色產(chǎn)物。這是由其初始產(chǎn)物經(jīng)氧化二聚作用形成的靛藍(lán)染料，它使具Gus活性的部位呈現(xiàn)藍(lán)色，用肉眼或在顯微鏡下可看到，且在一定程度下根據(jù)染色深淺可反映出Gus活性。因此利用該方法可觀察到外源基因在特定器官、組織、甚至單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況.100*當(dāng)前100頁(yè)，總共176頁(yè)。用GUS活性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因擬南芥A：組成型啟動(dòng)子CaMV35S的轉(zhuǎn)基因擬南芥

B：根特異性啟動(dòng)子PsMTA的轉(zhuǎn)基因擬南芥

101當(dāng)前101頁(yè)，總共176頁(yè)。轉(zhuǎn)基因煙草萌發(fā)花粉的GUS組織化學(xué)染色CK-102當(dāng)前102頁(yè)，總共176頁(yè)。GUS基因組織化學(xué)染色35S-莖橫切CK-莖橫切103當(dāng)前103頁(yè)，總共176頁(yè)。選擇基因（篩選標(biāo)記基因）也是標(biāo)記基因的一種。選擇基因（又稱選擇標(biāo)記基因或篩選標(biāo)記基因），其編碼產(chǎn)物可使抗生素或除草劑失活。這種基因在執(zhí)行其選擇功能時(shí)，通常存在檢測(cè)慢（蛋白酶作用需要時(shí)間）、依賴外界篩選壓力（如抗生素、除草劑）等缺陷。主要是各種抗生素抗性基因、使除草劑失活的基因104*當(dāng)前104頁(yè)，總共176頁(yè)。其他載體穿梭質(zhì)粒載體（shuttleplasmidvecotr）人工構(gòu)建的、具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記、因此可以在兩種不同的寄主細(xì)胞中復(fù)制和存活的質(zhì)粒載體。105大腸桿菌枯草桿菌穿梭載體大腸桿菌釀酒酵母穿梭載體大腸桿菌動(dòng)物細(xì)胞穿梭載體當(dāng)前105頁(yè)，總共176頁(yè)。2.噬菌體載體2.1λvector2.2M13vector106當(dāng)前106頁(yè)，總共176頁(yè)。2.1λVECTOR（

λ

載體）TheDNAofphageλ,intheforminwhichitisisolatedfromthephageparticle,isalinearduplexmoleculeofabout48.5kbp.線性雙鏈DNA分子，長(zhǎng)度為48.5kb(48502bp);蛋白質(zhì)外殼1982年由Sanger等完成測(cè)序107高效率高特異性侵染宿主細(xì)胞(這種高感染性能使外源基因高效導(dǎo)入受體細(xì)胞)自主復(fù)制繁殖性能使外源基因在宿主細(xì)胞中高效擴(kuò)增噬菌體或病毒的DNA能被開(kāi)發(fā)成為基因工程的有用載體，因?yàn)楫?dāng)前107頁(yè)，總共176頁(yè)。2.1.1COSSITE(COS位點(diǎn),科斯位點(diǎn))Ateachendofphageλareshortsingle-stranded5’projectionsof12nucleotides,whicharecomplementaryinsequenceandbywhichtheDNAadoptsacircularstructurewhenitisinjectedintoitshostcell,i.e.λDNAnaturallyhascohesivetermini,whichassociatetoformthecossite.在λDNA分子兩端各有12nt的單鏈5’粘性末端，且兩者的核苷酸序列互補(bǔ)，當(dāng)λ噬菌體進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞后，其DNA可迅速通過(guò)粘性末端互補(bǔ)配對(duì)而成雙鏈環(huán)狀DNA分子，這種由噬菌體粘性末端結(jié)合形成的雙鏈區(qū)域稱為cos位點(diǎn)（cohesiveendsite）108*當(dāng)前108頁(yè)，總共176頁(yè)。109當(dāng)前109頁(yè)，總共176頁(yè)。2.1.2LIFECYCLEOFPHAGEλcos連接成環(huán)后，噬菌體與宿主細(xì)胞進(jìn)行位點(diǎn)特異性重組，將自身基因組重組到宿主染色體中，隨宿主染色體的復(fù)制而復(fù)制；110*cos連接成環(huán)后DNA雙向復(fù)制，復(fù)制到后期變成滾環(huán)復(fù)制形式大量增殖DNA，頭部蛋白大量表達(dá)，同時(shí)將DNA切割成一個(gè)個(gè)單獨(dú)λ基因組后包裝進(jìn)成熟的噬菌體頭部，尾部蛋白加到頭部形成成熟的噬菌體，最后裂解宿主細(xì)胞。溶菌周期溶源周期當(dāng)前110頁(yè)，總共176頁(yè)。Replicationofphage-λDNAinlyticandlysogeniccycles.111當(dāng)前111頁(yè)，總共176頁(yè)。112當(dāng)前112頁(yè)，總共176頁(yè)。天然的它作為載體的兩個(gè)難題，怎么辦呢？113當(dāng)前113頁(yè)，總共176頁(yè)。2.1.3GENOMEOFPHAGEλ

114當(dāng)前114頁(yè)，總共176頁(yè)。115左臂：從A到J長(zhǎng)約20kb，編碼構(gòu)成頭部、尾部、尾絲對(duì)組裝完整噬菌體所需要的蛋白質(zhì)。要保留中段(J-N)：長(zhǎng)約20kb，是λDNA整合和切出，溶原生長(zhǎng)所需的序列，但非裂解生長(zhǎng)所必需?？蓜h除右臂(N-R)：長(zhǎng)約10kb，與調(diào)控、DNA合成、免疫、后期功能控制、宿主細(xì)胞裂解有關(guān)。要保留當(dāng)前115頁(yè)，總共176頁(yè)。天然的它作為載體的兩個(gè)難題，解決啦！116利用λ噬菌體作載體，主要是將外源基因替代或插入中段序列，使其隨左右臂一起包裝成噬菌體，去感染大腸桿菌，并隨噬菌體的裂解（溶菌）繁殖而繁殖。設(shè)計(jì)去除λDNA上的多余序列和一些限制性酶切點(diǎn)：因?yàn)棣薉NA較大，序列中的限制性酶切點(diǎn)過(guò)多，妨礙其應(yīng)用。Thetechniqueofmutagenesisinvitromaybeusedtomodifyremainingsitesthatarenotrequired.當(dāng)前116頁(yè)，總共176頁(yè)。

phageλcanaccommodateonlyabout5%morethanitsnormalcomplementofDNA.λ噬菌體頭部外殼蛋白質(zhì)容納DNA的能力是有一定限度的。上限：正常野生型DNA總量的105％左右，下限：正常野生型DNA總量的75％。117*2.1.4Capacityofλvector（λ噬菌體的容量）λ噬菌體的容量范圍：75%~105%當(dāng)前117頁(yè)，總共176頁(yè)。按野生型λDNA分子長(zhǎng)度為48.5kb計(jì)算，λ噬菌體的包裝上限是51kb。編碼必要基因的DNA區(qū)段占28kb，因此λ載體克隆外源DNA的理論極限值應(yīng)是23kb。這比質(zhì)粒載體能插入的DNA長(zhǎng)得多；而且包裝的λ噬菌體感染大腸桿菌要比質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌的效率高得多，所以λ噬菌體載體常用于構(gòu)建cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)。但λ噬菌體載體的克隆操作要比質(zhì)粒載體復(fù)雜。118*2.1.4Capacityofλvector（λ噬菌體的容量）理論上的極限值可達(dá)23kb，但事實(shí)上較為有效的克隆范圍僅為15kb左右。但在一般的情況下，15kb左右大小的DNA片段已足夠容納一個(gè)完整的基因及其兩端的側(cè)翼序列。當(dāng)前118頁(yè)，總共176頁(yè)。2.1.5TYPEOFλVECTOR119只具有一個(gè)限制酶位點(diǎn)，可便于外源DNA插入的稱為插入型載體，i.e.λgt10，λgt11插入型載體（insertionalvectors）置換型載體（replacementvector）含有二個(gè)限制酶切點(diǎn)，在兩個(gè)位點(diǎn)之間的DNA區(qū)段可以被外源DNA片段所取代，i.e.λEMBL3、λEMBL4）MostofthesevectorswereconstructedforusewithEcoRI,BamHIorHindIII,buttheirapplicationcouldbeextendedtootherendonucleasesbytheuseoflinkermolecules.*當(dāng)前119頁(yè)，總共176頁(yè)。Inλgt10(43.3kb)thisgeneratesleftandright‘a(chǎn)rms’of32.7and10.6kb,respectively,whichcanintheoryacceptinsertDNAfragmentsuptoapproximately7.6kbinlength.插入型載體:

λgt10andCharon16A120當(dāng)前120頁(yè)，總共176頁(yè)。EMBL4(41.9kb)hasacentral13.2kbstufferfragmentflankedbyinvertedpolylinkersequencescontainingsitesfortherestrictionenzymesEcoRI,BamHI,andSalI.TwoSalI

sitesarealsopresentinthestufferfragment.置換型載體:EMBL4andCharon40121當(dāng)前121頁(yè)，總共176頁(yè)。2.2M13VECTOR（

M13噬菌體載體）122M13、f1和fd，是一類絲狀大腸桿菌噬菌體，它們都含有長(zhǎng)度為6.4kb、彼此具有很高同源性的單鏈環(huán)狀DNA分子。由外殼包裝蛋白和正鏈DNA(+ssDNA)組成。感染宿主后不裂解宿主細(xì)胞，而是從感染的細(xì)胞中分泌出噬菌體顆粒，宿主細(xì)胞仍能繼續(xù)生長(zhǎng)和分裂。當(dāng)前122頁(yè)，總共176頁(yè)。LIFECYCLEOFM13LifecycleandDNAreplicationofphageM13.123M13吸附并通過(guò)大腸桿菌的雄性鞭毛內(nèi)孔注入其+ssDNA，以+ssDNA為模板合成-DNA，形成dsDNA（RFDNA）；再以-DNA為模板滾環(huán)復(fù)制，拷貝數(shù)100-200時(shí)復(fù)制停止；編碼基因表達(dá)出蛋白質(zhì)，包裝正鏈并分泌至體外；雖然不導(dǎo)致溶菌，但使菌斑混濁（細(xì)菌生長(zhǎng)變慢，約為正常的1/2—3/4）當(dāng)前123頁(yè)，總共176頁(yè)。ADVANTAGESOFM13VECTOR單鏈DNA的酶切和連接是比較困難的，因此M13噬菌體在用作載體時(shí)是利用其雙鏈狀態(tài)的RFDNA（replicativeformDNA）。RFDNA很容易從感染細(xì)胞中純化出來(lái)，可以象質(zhì)粒一樣進(jìn)行操作，并可通過(guò)轉(zhuǎn)化方法再次導(dǎo)入細(xì)胞。124當(dāng)前124頁(yè)，總共176頁(yè)。ADVANTAGESOFM13VECTORRFcanbepuri?edandmanipulatedinvitrojustlikeaplasmid（在體外易于象質(zhì)粒一樣進(jìn)行純化和操作）bothRFandssDNAwilltransfectcompetentE.colicellstoyieldeitherplaquesorinfectedcolonies(篩選方便，可感染感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞。被M13噬菌體感染的受體細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，形成混濁斑，易于辨認(rèn)挑選。而且重組分子越大，混濁斑的混濁度亦越大)itisveryeasytodeterminetheorientationofaninsert.（很容易測(cè)定外源DNA片段的插入方向（因此被用于測(cè)序））Insummary,asvectors,?lamentousphagespossessalltheadvantagesofplasmidswhileproducingparticlescontainingsingle-strandedDNAinaneasilyobtainableform.（總之，M13擁有所有質(zhì)粒的好處，同時(shí)又能以一種很容易獲得的形式產(chǎn)生包含ssDNA的顆粒）125但M13--DNA載體的最大缺陷是裝載量小，只有1.5kb當(dāng)前125頁(yè)，總共176頁(yè)。APPLICATIONOFM13VECTOR可產(chǎn)生大量純化的含外源DNA片斷的單鏈DNA分子。Sequencingbytheoriginaldideoxymethodrequiredsingle-strandedDNA（測(cè)序）oligonucleotide-directedmutagenesis（寡核苷酸定點(diǎn)突變）probepreparation（制備探針）126從細(xì)菌中釋放出來(lái)的噬菌體顆粒只含單鏈DNA，因此可用來(lái)作為對(duì)DNA測(cè)序的模板；另外，可很方便地用來(lái)產(chǎn)生單鏈的DNA探針。*M13載體發(fā)展出來(lái)，用于測(cè)序。當(dāng)前126頁(yè)，總共176頁(yè)。3.COSMID

CLONINGVECTOR（柯斯質(zhì)粒載體）PlasmidshavebeenconstructedwhichcontainafragmentofλDNAincludingthecossite.Theseplasmidshavebeentermedcosmidsandcanbeusedasgene-cloningvectorsinconjunctionwiththeinvitropackagingsystem.127*“cosmid”一詞是由英文“cossite-carryingplasmid”縮寫(xiě)而成的，其原意是指攜帶有λ噬菌體cos位點(diǎn)的質(zhì)粒。CosmidQ：還記得什么是cos位點(diǎn)嗎？當(dāng)前127頁(yè)，總共176頁(yè)。128*1978年，發(fā)展出的柯斯質(zhì)粒載體滿足了人們對(duì)克隆大片段序列（超過(guò)30-40kb）的需要。由質(zhì)粒和含有cos位點(diǎn)的λDNA片段組裝的一類新型克隆載體。實(shí)際上是質(zhì)粒的衍生物，是帶有cos序列的質(zhì)粒。Cosmid克隆載體當(dāng)前128頁(yè)，總共176頁(yè)。129*如果將λ噬菌體的左臂、右臂和中段都去除，僅保留λDNA兩端不少于