RNA提取結(jié)果分析課件

RNA提取結(jié)果分析

2006.04.28100mg小鼠肝臟組織，液氮中研磨，組織碎末立即倒入3ml裂解液內(nèi)。加入苯酚后離心，分三管收集上層水相，TE稀釋40倍測OD。共收集1.5ml。異丙醇沉淀后，可以看見大量白色沉淀，三管合并，600ul裂解液溶解沉淀，TE稀釋160倍測OD。此步共收集600ul。5ul裂解液對(duì)OD260有非常大的影響，RNA溶于水會(huì)導(dǎo)致OD260/280降低。產(chǎn)率不高的原因：1.研磨組織時(shí)有損失。2.兩次異丙醇沉淀會(huì)有大量損失。3.乙醇洗滌時(shí)為避免長時(shí)間干燥，吸的很干。沒有計(jì)算出回收率，改進(jìn)辦法：實(shí)驗(yàn)過程中測OD做控制時(shí)，使用5ul裂解液＋195ulTE調(diào)零。1％瓊脂糖凝膠，舊的緩沖液。1.道：5ul1號(hào)管＋15ulDEP水。2.道：5ul1號(hào)管＋15ulDEP水，70℃孵育1h。3道：5ul1號(hào)管＋20ulDEP水，37℃孵育1h。加入25ul氯仿，漩渦振蕩10s，1000g離心3min，吸取上層水相電泳。4道：5ul1號(hào)管＋15ulDEP水＋5ulRNA酶，37℃孵育1h。加入25ul氯仿，漩渦振蕩10s，1000g離心3min，吸取上層水相電泳。5.道：5ul4號(hào)管＋15ulDEP水。6道：5ul1號(hào)管＋20ulDEP水，37℃孵育1h。加入25ul氯仿，漩渦振蕩10s，1000g離心3min，吸取上層水相電泳。7道：5ul1號(hào)管＋15ulDEP水＋5ulRNA酶，37℃孵育1h。加入25ul氯仿，漩渦振蕩10s，1000g離心3min，吸取上層水相電。電泳結(jié)果說明：1.RNA酶有作用，代表提出的是RNA。2.37℃孵育，氯仿抽提，振蕩對(duì)電泳結(jié)果沒有影響，但RNA有損失。RNA的消失是酶作用的，而與操作無關(guān)。3.第2道目的在于確認(rèn)RNA溶液是否有殘留的RNA酶。結(jié)果說明70℃孵育對(duì)結(jié)果有影響，RNA有降解。酶解后進(jìn)行電泳證明確實(shí)提出了RNA，但是電泳條代還是不正常，RNA分子量偏?。ㄔ阡宸铀{(lán)附近）。兩種可能，RNA在提取過程中斷裂和出現(xiàn)降解。5ul提取的RNA，1％瓊脂糖凝膠，新電泳緩沖液。與前幾次的電泳結(jié)果一樣，還是看不到28S、18S兩條帶。1.換了一種裂解液，但電泳結(jié)果還是很像，說明問題不出在裂解這一步。2.提取時(shí)間大大縮短，但電泳結(jié)果還是很像，說明長提取時(shí)間對(duì)結(jié)果沒有影響。3.分析用到的有機(jī)溶劑，異丙醇和氯仿是在有裂解液的體系里沉淀RNA的，即使有RNA酶污染也不會(huì)降解RNA，異丙醇和氯仿污染可以被排除。剩下的就是乙醇了，兩種方法里，加入乙醇操作的時(shí)間是相同的，如果乙醇有RNA酶污染，兩種方法提取時(shí)RNA被裂解的效率是相同的，可以合理解釋兩次的電泳結(jié)果很類似。4.70℃保溫實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，RNA溶液中殘留的RNA酶能把稍高分子量的RNA降解，以至于條代集中在膠