體細(xì)胞胚胎發(fā)生和人工種子

體細(xì)胞胚胎發(fā)生和人工種子第一頁，共三十九頁，2022年，8月28日教學(xué)目的和要求掌握愈傷組織的發(fā)生方式；掌握人工種子的定義；掌握人工種子的制備。第二頁，共三十九頁，2022年，8月28日第一節(jié)愈傷組織和體細(xì)

胞胚胎發(fā)生第三頁，共三十九頁，2022年，8月28日體細(xì)胞胚胎發(fā)生(Somaticembryogenesis)是指單倍或雙倍的體細(xì)胞或單個(gè)花粉在特定的條件下，未經(jīng)性細(xì)胞融合而通過與合子胚胎發(fā)生類似的途徑，即通過原胚期、球形胚期、心形胚期、魚雷形胚期和子葉期，發(fā)育成新個(gè)體的形態(tài)發(fā)生過程，這種類合子胚結(jié)構(gòu)稱胚狀體或體細(xì)胞胚(Somaticembryo).第四頁，共三十九頁，2022年，8月28日1.非胚性愈傷組織的懸浮細(xì)胞2.胚性愈傷組織的懸浮細(xì)胞3.球形胚4.心形胚5.魚雷胚6.子葉胚7.愈傷組織表面具早期體細(xì)胞胚第五頁，共三十九頁，2022年，8月28日愈傷組織（callus）指從外植體的內(nèi)部或切口表面形成的一團(tuán)沒有分化的均一一致、無序生長的薄壁細(xì)胞團(tuán)。這種組織具有再分化的能力。第六頁，共三十九頁，2022年，8月28日一、愈傷組織的誘導(dǎo)起動(dòng)期分裂期形成期第七頁，共三十九頁，2022年，8月28日起動(dòng)期:植物準(zhǔn)備分裂的時(shí)期；特征：細(xì)胞大小無明顯變化；RNA含量迅速明顯增加；細(xì)胞核變大。第八頁，共三十九頁，2022年，8月28日分裂期：細(xì)胞通過一分為二的方式不斷增生子細(xì)胞的過程。特征：細(xì)胞分裂快、結(jié)構(gòu)疏松、缺少組織結(jié)構(gòu)第九頁，共三十九頁，2022年，8月28日形成期：外植體細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)、分裂形成了無序的愈傷組織的時(shí)期。細(xì)胞特點(diǎn)：細(xì)胞大而不規(guī)則、高度液泡化、無次生細(xì)胞壁和胞間連絲，整個(gè)組織結(jié)構(gòu)比較松散；表面以下5～10個(gè)細(xì)胞是細(xì)胞生長的中心，分生中心的細(xì)胞明顯小些，出現(xiàn)了胞間連絲和果膠質(zhì)，這些中心是愈傷組織的主要生長部位。隨著愈傷組織表層細(xì)胞分裂的減緩和停止，內(nèi)部深處的生長中心細(xì)胞不斷分裂并形成像維管束或類似分生組織的鳥巢狀結(jié)構(gòu)。第十頁，共三十九頁，2022年，8月28日二、愈傷組織器官的發(fā)生不定芽方式胚狀體形成的方式第十一頁，共三十九頁，2022年，8月28日不定芽方式（adventitiousbudtype）是指愈傷組織培養(yǎng)物，通過形成不定芽再生成植株。這是愈傷組織中常見的器官發(fā)生方式。第十二頁，共三十九頁，2022年，8月28日愈傷組織通過不定芽方式再分化形成再生植株的方式主要有四種：1、在愈傷組織上分別形成根或芽器官，即形成無根的芽或無芽的根；2、在愈傷組織上先產(chǎn)生芽，待芽伸長后再在其莖的基部長出根而形成小植株，多數(shù)植物屬于此種方式；3、在愈傷組織上先產(chǎn)生根，再從根基部分化出芽而形成小植株，雙子葉植物多屬此種情況；4、先在愈傷組織的不同部位分別形成根和芽，然后兩者結(jié)合起來形成一株小植株，只有根和芽的維管束是相通的才能得到成活的植株。第十三頁，共三十九頁，2022年，8月28日胚狀體形成（embryoidformation）是指從培養(yǎng)的組織或細(xì)胞中直接或間接形成胚胎的生長方式。直接形成胚胎是指在外植體上直接分化出胚狀體；間接形成胚胎是指在外植體上先分化出胚性愈傷組織，然后由胚性愈傷組織再分化形成胚狀體第十四頁，共三十九頁，2022年，8月28日第十五頁，共三十九頁，2022年，8月28日第二節(jié)人工種子一、人工種子的定義人工種子(artificialseed)：是指通過植物組織培養(yǎng)的方法產(chǎn)生的體細(xì)胞胚包埋在含有營養(yǎng)成分和保護(hù)功能的物質(zhì)中，在適宜條件下可以發(fā)芽成苗的植物幼體。Murashige1978年首次提出人工種子的概念，利用植物組織培養(yǎng)中有體細(xì)胞胚胎發(fā)生的特點(diǎn)，把胚狀體等組織包埋在膠囊內(nèi)形成球狀結(jié)構(gòu)，使其具有種子的機(jī)能并可直接播種于田間。

第十六頁，共三十九頁，2022年，8月28日外形上它就象一顆顆乳白色、半透明、圓粒狀的石榴果實(shí)內(nèi)的小顆粒。第十七頁，共三十九頁，2022年，8月28日二、人工種子的制備農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用的天然種子，一般由種皮、胚乳和胚三部分構(gòu)成。目前，人工種子的制作程序包括：a、體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)及同步化控制b、人造胚乳及人造種皮研制及包埋c、人工種子的貯藏及萌發(fā)important第十八頁，共三十九頁，2022年，8月28日1、高質(zhì)量體細(xì)胞胚發(fā)生系統(tǒng)的建立大量形成高質(zhì)量的體細(xì)胞胚是人工種子制作的前提

╱二倍性

胚狀體

╲單倍性高質(zhì)量的體細(xì)胞胚：體細(xì)胞胚具有發(fā)育成完整小植株的能力，即要求體細(xì)胞胚在解剖結(jié)構(gòu)上具有明顯的胚根、胚芽的雙極性結(jié)構(gòu)。人工種子能否成功的關(guān)鍵。第十九頁，共三十九頁，2022年，8月28日體細(xì)胞胚的發(fā)生方式：胚狀體可由表皮細(xì)胞、愈傷組織、懸浮細(xì)胞、花粉、原生質(zhì)體等發(fā)生：1、來源于外植體的表皮細(xì)胞；2、來源于愈傷組織細(xì)胞；3、懸浮培養(yǎng)中由單細(xì)胞來源的胚狀體4、由花藥花粉培養(yǎng)產(chǎn)生的單倍體胚狀體；5、來源于原生質(zhì)體的胚狀體。第二十頁，共三十九頁，2022年，8月28日2、體細(xì)胞胚胎發(fā)生的同步化控制為得到活力強(qiáng)、萌發(fā)率高的人工種子，制作要求胚狀體的形態(tài)上大小一致、發(fā)育進(jìn)程相似。因此，對體細(xì)胞胚發(fā)生要進(jìn)行同步化控制和純化篩選?？刂婆郀铙w的同步發(fā)育是人工種子的重要條件。A：化學(xué)抑制法－同步脫分化促進(jìn)細(xì)胞的同步分裂

在細(xì)胞培養(yǎng)初期加入DNA合成的抑制劑，使細(xì)胞DNA合成暫時(shí)停止，除去抑制劑后，細(xì)胞同步分裂。B：低溫抑制法

低溫處理導(dǎo)致發(fā)育停止，形成溫度沖擊，處理時(shí)間過后恢復(fù)正常溫度，可使胚性細(xì)胞達(dá)到同步分裂。第二十一頁，共三十九頁，2022年，8月28日C：滲透壓選擇

不同發(fā)育階段的胚有不同的滲透壓要求，調(diào)節(jié)滲透壓可以控制胚的發(fā)育，篩選到較為一致的體細(xì)胞胚。如球形胚的滲透壓17.5％，心形胚的12.5％。D：機(jī)械分離過篩選擇法

胚性細(xì)胞及懸浮液分別用80、53、40、27微米的濾網(wǎng)過濾，可以按體積大小分開。E：在懸浮培養(yǎng)中控制通氣

在培養(yǎng)基中通入乙烯或氮?dú)?，使?xì)胞分裂達(dá)到高峰。第二十二頁，共三十九頁，2022年，8月28日3、人工種皮及人工胚乳研制及包埋（1）人工種皮的研制

總的要求是：能保持胚狀體的活力，利于萌發(fā)和貯藏。所選材料要有韌性、耐壓，對胚狀體無毒害，含有胚狀體發(fā)芽生長所需的營養(yǎng)成分或植物激素，還應(yīng)含有殺菌劑以防止播種后土壤微生物的侵染。如海藻酸鈉、明膠、瓊脂糖、淀粉、動(dòng)物膠等。A.材料：膠質(zhì)的化合物薄膜，以便包裹于人工胚乳之外，為種子提供保護(hù)，并防止融于水的營養(yǎng)物質(zhì)向外滲透。第二十三頁，共三十九頁，2022年，8月28日人工種皮需要滿足的條件：1、具有一定的透氣性，不能影響胚狀體的呼吸；2、具有一定的硬度，經(jīng)得起種子儲(chǔ)存和運(yùn)輸中的擠壓和機(jī)械播種中的磨損；3、易于降解；4、含有其他有利于胚狀體存活、生長的成分。第二十四頁，共三十九頁，2022年，8月28日B.

體細(xì)胞胚包裹的材料：凝膠可以使人工種皮具有柔軟性，不僅適于胚狀體的要求，而且具有抗壓性。第二十五頁，共三十九頁，2022年，8月28日C.人造種子的包埋技術(shù)

最佳的包埋材料是海藻酸鈉，包埋方法有干燥包埋法、液膠包埋法和水凝膠法。干燥包埋法：將胚狀體置于23度，相對濕度為79％，黑暗條件下逐漸干燥，然后用聚氧乙烯中包裹貯藏。液膠包埋法：將胚狀體懸浮在一種粘滯的流體膠中，直接播入土壤。水凝膠法：用海藻酸鈣水性膠囊包埋胚狀體，用以生產(chǎn)人工單胚種子稱水凝膠法。第二十六頁，共三十九頁，2022年，8月28日制作過程體細(xì)胞胚與藻酸鈉混合后，滴入到硝酸鈣或CaCl2中，10分鐘后，表面聚合，形成人工種子第二十七頁，共三十九頁，2022年，8月28日人造胚乳即包裹胚狀體的營養(yǎng)基質(zhì)，其外部就是人工種皮。（2）人造胚乳的研制第二十八頁，共三十九頁，2022年，8月28日人工胚乳的成分人工胚乳的主要成分為無機(jī)鹽、碳水化合物、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)。第二十九頁，共三十九頁，2022年，8月28日人工胚乳的制作直接法在凝膠中直接加入大量元素、碳水化合物及防病用抗生素。微型包裹法將碳水化合物和大量元素包裹在微型膠囊內(nèi)，然后再把微型膠囊和種胚一起包裹在海藻酸鈉中。第三十頁，共三十九頁，2022年，8月28日現(xiàn)在已有胡蘿卜、芹菜、柑橘、咖啡、棉花、玉米、水稻、橡膠等幾十種植物的人工種子試種成功，但由于成本較高，中國尚未應(yīng)用于生產(chǎn)。

2、植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用：

第三十一頁，共三十九頁，2022年，8月28日（4）人工種子的轉(zhuǎn)換

轉(zhuǎn)換是指由體細(xì)胞胚發(fā)育成具正常表現(xiàn)型的綠色植株的能力，轉(zhuǎn)換率用來表示不同發(fā)育階段的體細(xì)胞胚發(fā)育為小植株的比率。第三十二頁，共三十九頁，2022年，8月28日二、人工種子的優(yōu)越性與局限性（一）、優(yōu)越性1、通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)的胚狀體具有數(shù)量多，繁殖速度快，結(jié)構(gòu)完整等特點(diǎn)，可短期內(nèi)大量生產(chǎn)優(yōu)良種苗，比莖尖培養(yǎng)繁殖速率還高。2、大量人工種子來源于同一植株的體細(xì)胞，不存在遺傳變異的問題,渴望獲得整齊一致的植物苗，利于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化和機(jī)械化管理。3、為一些不能采用種子繁殖的園藝植物開辟了良好的良種繁育新途徑。第三十三頁，共三十九頁，2022年，8月28日（二）、局限性1、一些具有重要性狀的植物目前發(fā)生體細(xì)胞胚的能力較弱，再生系統(tǒng)尚不健全，難以形成有活力的胚并同步化發(fā)育。2、制作的人工種子成本遠(yuǎn)高于自然種子，無競爭力。3、人工種子的貯藏、運(yùn)輸以及機(jī)械化播種等問題尚未