免疫化學(xué)技術(shù)

免疫化學(xué)技術(shù)第一頁，共七十五頁，2022年，8月28日免疫標(biāo)記技術(shù)放射物標(biāo)記技術(shù)酶標(biāo)技術(shù)免疫熒光技術(shù)其他標(biāo)記技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)酶免疫組化技術(shù)雙抗體夾心法競爭法雙抗原夾心法間接法雙位一點法第二頁，共七十五頁，2022年，8月28日什么是酶聯(lián)免疫分析技術(shù)

ELISA的基本原理和方法ELISA的種類和變化ELISA的特點

ELISA的應(yīng)用實例第三頁，共七十五頁，2022年，8月28日一、基本原理

是利用抗原抗體進(jìn)行的檢測技術(shù)。即利用制備好的特異抗原或抗體作為試劑，以檢測標(biāo)本中的相應(yīng)抗體或抗原。在這種測定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）②酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）③酶作用的底物（顯色劑）第四頁，共七十五頁，2022年，8月28日ELISA原理使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)第五頁，共七十五頁，2022年，8月28日

其所生成的顏色深淺與欲測的抗原（抗體）含量成正比。

這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計（酶標(biāo)儀）加以測定。

其方法簡單，方便訊速，特異性強。第六頁，共七十五頁，2022年，8月28日二、酶及其底物酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原,半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。是ELISA成敗的關(guān)鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應(yīng)，還具有酶促反應(yīng)，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物，將得到不同的顏色反應(yīng).第七頁，共七十五頁，2022年，8月28日酶底物顯色反應(yīng)

測定波長

辣根過氧化物酶鄰苯二胺

四甲替聯(lián)苯胺

氨基水楊酸

鄰聯(lián)苯甲胺

2,2‘-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽

橘紅色

黃色

棕色

蘭色

藍(lán)綠色492460449

425

642

堿性磷酸酯酶

4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽黃色

紅色400

500葡萄糖氧化酶

ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭黃色

深藍(lán)色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶

甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)熒光

黃色

360,450

420

第八頁，共七十五頁，2022年，8月28日ELISA的種類和變化

（一）雙抗體夾心法（二）間接法（三）競爭法（四）雙位點一步法（五）捕獲法測IgM抗體（六）應(yīng)用親和素和生物素的ELISA

第九頁，共七十五頁，2022年，8月28日（一）雙抗體夾心法此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原第十頁，共七十五頁，2022年，8月28日第十一頁，共七十五頁，2022年，8月28日雙抗體夾心法（HBsAg、HBeAg等）示意圖固相載體抗體抗原酶抗體酶標(biāo)記抗體1.將抗體包被在固相載體上。2.如樣品中含有抗原，則結(jié)合為抗原抗體復(fù)合物。3.再加入酶標(biāo)記抗體，則結(jié)合為抗體-抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物。4.酶催化底物并顯色。第十二頁，共七十五頁，2022年，8月28日獲得待分析物的未標(biāo)定抗體將特異性抗體與固相載體連接形成固相抗體洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)加入封閉蛋白溶液以封閉載體表面殘留的蛋白結(jié)合位點洗滌并除去未結(jié)合的封閉蛋白加受檢標(biāo)本（抗原）形成固相抗體－抗原復(fù)合物洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)加酶標(biāo)抗體生成抗體—待測抗原—酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體加底物進(jìn)行酶催化反應(yīng)根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量測定第十三頁，共七十五頁，2022年，8月28日雙抗體夾心法測抗原此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。第十四頁，共七十五頁，2022年，8月28日（1）雙抗體夾心法測定抗原A.

將抗體吸附于固相表面;B.

加抗原，形成抗原-抗體復(fù)合物;C.

加酶標(biāo)抗體;E.加底物。底物的降解量＝抗原量。

第十五頁，共七十五頁，2022年，8月28日雙抗原夾心法（抗-HBs等）示意圖1.將抗原包被在固相載體上。2.如樣品中含有抗體，則結(jié)合為抗原抗體復(fù)合物。3.再加入酶標(biāo)記抗原，則結(jié)合為抗原-抗體-酶標(biāo)記抗原復(fù)合物。4.酶催化底物并顯色。酶抗原酶標(biāo)記抗原抗體抗原固相載體第十六頁，共七十五頁，2022年，8月28日雙抗原夾心法測抗體用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBsAg的檢測常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。第十七頁，共七十五頁，2022年，8月28日

間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。（二）間接法第十八頁，共七十五頁，2022年，8月28日酶抗抗體酶標(biāo)記抗抗體抗體抗原固相載體1.將抗原包被在固相載體上。2.如樣品中含有抗體，則結(jié)合為抗原抗體復(fù)合物。3.再加入酶標(biāo)記抗抗體，則結(jié)合為抗原-抗體-酶標(biāo)記抗抗體復(fù)合物。4.酶催化底物并顯色。間接法（抗-HCV等）示意圖第十九頁，共七十五頁，2022年，8月28日間接法測抗體

傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測相應(yīng)抗體的方法。第二十頁，共七十五頁，2022年，8月28日包被固相載體:用已知抗原包被固相載體加待檢標(biāo)本:使相應(yīng)抗體與固相抗原結(jié)合洗滌，除去無關(guān)的物質(zhì)加酶標(biāo)抗抗體:與固相載體上抗原抗體復(fù)合物結(jié)合；洗滌，除去未結(jié)合的酶標(biāo)抗抗體加底物顯色根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量測定第二十一頁，共七十五頁，2022年，8月28日（三）競爭法

此法可用于抗原和半抗原的定量測定，也可用于測定抗體。第二十二頁，共七十五頁，2022年，8月28日用已知特異性抗體包被固相載體測定管加待測抗原和一定量的酶標(biāo)抗原使二者與固相抗體競爭結(jié)合對照管只加一定量酶標(biāo)抗原與固相抗體直接結(jié)合分別洗滌除去未結(jié)合的成分加底物顯色分別測定兩管的吸光度值，根據(jù)對照管與測定管吸光度值之比，計算標(biāo)本中待測抗原含量第二十三頁，共七十五頁，2022年，8月28日（3）競爭法測定抗原A.

將抗體吸附在固相載體表面;B.加入酶標(biāo)抗原和待測抗原，競爭結(jié)合抗體；對照只加入酶標(biāo)抗原；C.加底物。對照孔與樣品孔底物降解量的差＝未知抗原量。第二十四頁，共七十五頁，2022年，8月28日對照管由于只加酶標(biāo)抗原，與固相抗體充分結(jié)合，故分解底物顯色深；測定管的顯色程度則隨待測抗原和酶標(biāo)抗原與固相抗體競爭結(jié)合的結(jié)果而異。如待測抗原量多，競爭性地抑制酶標(biāo)抗原與固相抗體結(jié)合，使固相上結(jié)合的酶標(biāo)抗原量減少。因此，加入底物后顯色反應(yīng)較弱。第二十五頁，共七十五頁，2022年，8月28日放射免疫測定法(Radioimmunoassaly,RIA)

應(yīng)用同位素標(biāo)記技術(shù)來檢測抗原抗體反應(yīng)的高靈敏度方法。此法兼有放射性同位素標(biāo)記物所顯示的高靈敏度（可達(dá)到ng和pg水平）和血清學(xué)反應(yīng)的高特異性優(yōu)點。第二十六頁，共七十五頁，2022年，8月28日發(fā)光免疫測定法(Luminescentimmunoassay)將化學(xué)發(fā)光反應(yīng)與免疫測定法結(jié)合起來的新型技術(shù)。常用的發(fā)光試劑有魯米諾（luminol)和光澤精(lucigenin)。第二十七頁，共七十五頁，2022年，8月28日一：靈敏性

該測定法的靈敏度來自作為報告集團的酶。眾所周知,酶是一種有機催化劑，很少量的酶即可誘導(dǎo)大量的催化反應(yīng)，產(chǎn)生可供觀察的顯色反應(yīng)現(xiàn)象。因此該體系常被稱為酶放大體系。ELISA實現(xiàn)了在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克、甚至納克水平上對其進(jìn)行定量。例如，在測定血清中某一物質(zhì)的含量時，化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml水平，酶反應(yīng)測定法的敏感度約為5~10μg/ml。

ELISA的特點第二十八頁，共七十五頁，2022年，8月28日二：特異性其特異性來自抗體或抗原的選擇性?？乖贵w的結(jié)合實質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點之間。由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補關(guān)系，所以抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性。

第二十九頁，共七十五頁，2022年，8月28日ELISA的試劑(A、B、C三部分)ELISA中有三個必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物。（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；（3）酶的底物；（4）陰性對照品和陽性對照品，參考標(biāo)準(zhǔn)品；（5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；（6）洗滌液；（7）酶反應(yīng)終止液第三十頁，共七十五頁，2022年，8月28日ELISA的試劑準(zhǔn)備A

固相載體

聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學(xué)活性。聚氯乙烯。聚氯乙烯對蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相近。第三十一頁，共七十五頁，2022年，8月28日包被的方式將抗原或抗體固定在過程稱為包被(coating)。

蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點、濃度等的影響。大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體表面。第三十二頁，共七十五頁，2022年，8月28日不易吸附的非蛋白質(zhì)抗原可用間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質(zhì)較多的抗原也可采用捕獲包被法。親和素生物素即用親和素先包被載體，加入生物素化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測定。脂類物質(zhì)無法與固相載體結(jié)合，可將其在有機溶劑（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。優(yōu)點：試驗的特異性、敏感性均由此得以改善，重復(fù)性亦佳?？乖昧可?，僅為直接包被的1/10乃至于/100。第三十三頁，共七十五頁，2022年，8月28日包被用抗原：天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。合成多肽抗原是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一個抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結(jié)合到固相載體表面。第三十四頁，共七十五頁，2022年，8月28日包被用抗體IgG對聚苯乙烯有強吸附力，其聯(lián)結(jié)發(fā)生在Fc段上，抗體結(jié)合點暴露于外。取材于抗血清或含單克隆抗體的培養(yǎng)液.須除去雜抗體后才能用于ELISA，以保證試驗的特異性。腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強，因此不需要作吸收層析處理，直接包被。在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。第三十五頁，共七十五頁，2022年，8月28日包被的條件 pH9.6碳酸鹽緩沖液 pH7.2的磷酸鹽緩沖液 pH7-8的Tris-HCL緩沖液。加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時。包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為10ng/ml-20ug/ml。第三十六頁，共七十五頁，2022年，8月28日封閉封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。常用封閉劑：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉,比較價廉，可以高濃度使用（5%）。所有的ELISA固相均需封閉？第三十七頁，共七十五頁，2022年，8月28日洗滌液在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸鹽緩沖液。第三十八頁，共七十五頁，2022年，8月28日

ELISA的試劑準(zhǔn)備B

結(jié)合物即酶標(biāo)記的抗體（或抗原）是ELISA中關(guān)鍵的試劑1酶的催化活性2抗體（或抗原）的免疫活性3含有或少含有游離的抗體（或抗原）4結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。第三十九頁，共七十五頁，2022年，8月28日結(jié)合物用的抗原和抗體制備結(jié)合物時所用純度較高的IgG，以免在與酶聯(lián)結(jié)時其他雜蛋白的干擾。最好用層析純化的抗體，這樣全部酶結(jié)合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進(jìn)行反應(yīng)，實驗結(jié)果本底淺淡。在ELISA中用酶標(biāo)抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的。第四十頁，共七十五頁，2022年，8月28日酶純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專一性強，性質(zhì)穩(wěn)定，來源豐富，價格不貴，受檢標(biāo)本中不存在相同的酶。酶結(jié)合物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保存，價格低廉，有色產(chǎn)物易于測定等。在ELISA中，HRP，AP，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。HRP是一種糖蛋白，含糖量約為18%，分子量為44000，是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。第四十一頁，共七十五頁，2022年，8月28日結(jié)合物的制備酶標(biāo)記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鹽氧化法。（1）戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團試劑，可使酶與蛋白質(zhì)的氨基通過它而聯(lián)結(jié)。有效（結(jié)合率達(dá)60%-70%）和重復(fù)性好。交聯(lián)反應(yīng)是隨機的，結(jié)合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果。（2）過碘酸氧化法：適用含糖量較高的酶。過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成chiff氏堿而結(jié)合。簡便有效.第四十二頁，共七十五頁，2022年，8月28日結(jié)合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中最后的酶活性測定。但游離的抗體則會與酶標(biāo)抗體競爭相應(yīng)的固相抗原，因此制備的酶結(jié)合物應(yīng)予純化，去除游離的酶和抗體后用于檢測，效果更好。制得結(jié)合物，最適的工作濃度就是指結(jié)合物稀釋至這一濃度時，能維護一個低的本底，并獲得測定的最佳靈敏度，達(dá)到最合適的測定條件和測定費用的節(jié)省。第四十三頁，共七十五頁，2022年，8月28日結(jié)合物的保存酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，易失活。高濃度較為穩(wěn)定，凍干后可在普通冰箱中保存一年左右。結(jié)合物溶液中加入等體積的甘油，加入蛋白保護劑。另外再加入抗生素（例如慶大霉素）和防腐劑（HRP結(jié)合物加硫柳泵，AP結(jié)合物可加疊氮鈉）。第四十四頁，共七十五頁，2022年，8月28日結(jié)合物的稀釋液用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工作液。為避免結(jié)合物在反應(yīng)中直接吸附在固相載體上：0.1%牛血清白蛋白，0.05%吐溫20。試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液，使用時不需再行稀釋，在4-8℃保存期可達(dá)6個月。第四十五頁，共七十五頁，2022年，8月28日試劑準(zhǔn)備C酶的底物第四十六頁，共七十五頁，2022年，8月28日酶的底物HRP的底物OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結(jié)合物最常用的底物。DH2+H2O2

D+2H2O上式中，DH2為供氧體，H2O2為受氫體。DH2一般為無色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物。DH2如：鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和ABTS。E第四十七頁，共七十五頁，2022年，8月28日TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應(yīng)用液。酶反應(yīng)終止后，TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色計中定量，最適吸收波長為450nm。ABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。HRP對氫受體的專一性很高，僅作用于H2O2、小分醇的過氧化物和尿素過氧化物(ureaperoxide)。第四十八頁，共七十五頁，2022年，8月28日AP的底物為磷酸酯酶，一般采用對硝基苯磷酸酯作為底物。產(chǎn)物為黃色的對硝基酚，在405nm波長處有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一時間。AP也有發(fā)熒光底物（磷酸4-甲基傘酮），可用于ELISA作熒光測定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。第四十九頁，共七十五頁，2022年，8月28日酶反應(yīng)終止液常用的HRP反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。第五十頁，共七十五頁，2022年，8月28日對照設(shè)定

陽性對照品(positivecontrol)和陰性對照品(negativecontrol)是檢驗試驗有效性的控制品，同時也作為判斷結(jié)果的對照。 陽性對照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測標(biāo)本的組成相一致，多以含蛋白保護劑的緩沖液為基質(zhì)。 加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱； 在測定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較，可以估計標(biāo)本物質(zhì)的量。第五十一頁，共七十五頁，2022年，8月28日參考標(biāo)準(zhǔn)品定量測定（如甲胎蛋白質(zhì)，癌胚抗原測定等）應(yīng)含有制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用的參考標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)包括覆蓋可檢測范圍的4-5個濃度，一般均配入含蛋白保護劑及防腐劑的緩沖液中. 陰性對照品須先行檢測確定不含待測物質(zhì)。例如HBsAg檢測的陰性對照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是陰性。第五十二頁，共七十五頁，2022年，8月28日5標(biāo)本的采取和保存

體液、分泌物和排泄物等均可作標(biāo)本以測定其中某種抗體或抗原成份。以血清標(biāo)本為例：血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份同血清。血漿和血清可同等應(yīng)用。血清標(biāo)本應(yīng)避免溶血：紅細(xì)胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為標(biāo)記的ELISA測定中，可能會增加非特異性顯色。第五十三頁，共七十五頁，2022年，8月28日加樣:在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡?；静僮髯⒁馐马椀谖迨捻摚财呤屙?，2022年，8月28日保溫抗原抗體完成反應(yīng)的保溫過程稱為溫育(incubation)。ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時間的溫育？溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。第五十五頁，共七十五頁，2022年，8月28日保溫方式：ELISA儀器附有特制的電熱塊，水浴。若用保溫箱：ELISA板放在濕盒內(nèi)，在盒底墊濕的紗布，最后將ELISA板放在濕紗布上。反應(yīng)板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應(yīng)，操作時的室溫應(yīng)嚴(yán)格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指20-25℃，但具體操作時可根據(jù)說明書的要求控制溫育。應(yīng)注意溫育的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。為保證這一點，一個人操作時，一次不宜多于兩塊板同時測定。第五十六頁，共七十五頁，2022年，8月28日洗滌洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應(yīng)步驟，但卻也決定著實驗的成敗。ELSIA洗滌：達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來?？梢哉f在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)。洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動洗滌儀外，手工操作有流水沖洗式和浸泡式兩種：第五十七頁，共七十五頁，2022年，8月28日（1）流水沖洗式流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌，洗滌液為蒸餾水，自來水。洗滌效果更為徹底，且也簡便、快速。已有實驗表明，流水沖洗式同樣適用于微量滴定板的洗滌。讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳。

（2）浸泡式微量滴定板多采用。洗滌液為非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。第五十八頁，共七十五頁，2022年，8月28日顯色顯色是酶催化無色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應(yīng)。反應(yīng)的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內(nèi)，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。TMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反應(yīng)觀察結(jié)果。但為保證實驗結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當(dāng)時間閱讀結(jié)果。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達(dá)頂峰，隨即逐漸減弱，至2小時后即可完全消退至無色。第五十九頁，共七十五頁，2022年，8月28日比色拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀中。以蒸餾水校零點，測讀底物孔（未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過程的孔），以記錄本次試驗的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進(jìn)行計算。結(jié)果以光密度（oplicaldensity，OD），現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長寫于A字母的右下角，如OPD的吸收波長為492nm，表示方法為"A492nm"或"OD492nm"。第六十頁，共七十五頁，2022年，8月28日酶標(biāo)比色儀酶標(biāo)比色儀簡稱酶標(biāo)儀，通常指測讀ELISA光度計。針對固相載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設(shè)計。酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有：測讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精確度和可測范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可精確到0.001，準(zhǔn)確性為±1%，重復(fù)性達(dá)0.5%。操作時室溫宜在15-30℃，使用前先預(yù)熱儀器15-30分鐘，測讀結(jié)果更穩(wěn)定。測讀A值時，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波長。有的酶標(biāo)儀可用雙波長式測讀。各種酶標(biāo)儀性能有所不同，使用中應(yīng)詳細(xì)閱讀說明書。第六十一頁，共七十五頁，2022年，8月28日6結(jié)果判斷

6.1定性測定定性測定的結(jié)果判斷作出“有”或“無”的回答，分別用“陽性”、“陰性”表示。在這種半定量測定中，將標(biāo)本作一系列稀釋后進(jìn)行試驗，呈陽性反應(yīng)的最高稀釋度即為滴度。根據(jù)滴度的高低，可以判斷標(biāo)本反應(yīng)性的強弱，這比觀察不稀釋標(biāo)本呈色的深淺判斷為強陽性、弱陽性更具定量意義。在間接法和夾心法ELSIA中，陽性孔呈色深于陰性孔。在競爭法ELISA中則相反，陰性孔呈色深于陽性孔。兩類反應(yīng)的結(jié)果判斷方法不同，分述于下。第六十二頁，共七十五頁，2022年，8月28日A.陽性判定值：（cut-offvalue）一般為陰性對照A值加上一個特定的常數(shù)(0.05)，以此作為判斷結(jié)果陽性或陰性的標(biāo)準(zhǔn)。B.標(biāo)本/陰性對照比值：在實驗條件（包括試劑）較難保證恒定的情況下，這種判斷法較為合適。在得出標(biāo)本（S）和陰性對照（N）的A值后，計算S/N值。間接法和夾心法第六十三頁，共七十五頁，2022年，8月28日（2）競爭法因肉眼很難辨別弱陽性反應(yīng)與陰性對照的顯色差異，一般均用比色計測定，讀出S、P和N的吸光值。a.陽性判定值法陰性判定值=0.4×NCX+0.6×PCX陽性A≤陽性判定值