核酸分子雜交及芯片技術(shù)

教學(xué)內(nèi)容核酸分子雜交的基本原理核酸探針核酸分子雜交技術(shù)方法

DNA芯片技術(shù)當(dāng)前1頁，總共68頁。1、變性（denaturation）

在一定的條件下，雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解開，形成無規(guī)則線團(tuán)，雙鏈解鏈成為單鏈。無共價鍵斷裂。當(dāng)前2頁，總共68頁。2、融解溫度（Tm值）：

在DNA熱變性時，其A260的升高達(dá)最大值一半時的溫度。當(dāng)前3頁，總共68頁。影響Tm的因素：

（1）DNA堿基的組成

G-C含量越多Tm值越高

A-T含量越多Tm值越低當(dāng)前4頁，總共68頁。（2）溶液的離子強度

低離子強度Tm值越低

高離子強度Tm值越高（3）pH值

pH值5-9Tm值變化不明顯

pH<4pH>11不利于氫鍵形成

（4）變性劑

干擾堿基堆積力和氫鍵的形成當(dāng)前5頁，總共68頁。3、復(fù)性

變性DNA經(jīng)過一定處理通過堿基互補重新形成雙螺旋的過程。二級反應(yīng)動力學(xué)通過隨機(jī)碰撞配對緩慢“拉鎖鏈”快當(dāng)前6頁，總共68頁。

DNA濃度

DNA片段的大小

DNA片段復(fù)雜性

合適的復(fù)性溫度

適當(dāng)?shù)碾x子強度影響復(fù)性速度的因素:當(dāng)前7頁，總共68頁?？赡嫘?非共價結(jié)合)序列特異性(堿基互補配對)紫外吸收黏度沉降系數(shù)比旋度生物活性淬火退火掌握概念應(yīng)用：探針單鏈化核酸的變性與復(fù)性特點當(dāng)前8頁，總共68頁。4、雜交

根據(jù)核酸變性和復(fù)性的原理，兩條來源不同，但具有互補序列的核酸，按堿基配對原則復(fù)性形成一個雜交體，這個過程即雜交，或稱分子雜交。分類

DNA-DNA

DNA-RNA

RNA-RNA高度特異的允許一定程度的錯配嚴(yán)格度當(dāng)前9頁，總共68頁。

當(dāng)前10頁，總共68頁。教學(xué)內(nèi)容核酸分子雜交的基本原理

核酸探針核酸分子雜交技術(shù)方法

DNA芯片技術(shù)當(dāng)前11頁，總共68頁。一、概念

探針（probe）

指能與特定靶分子發(fā)生特異性相互作用，并能被特殊方法所檢測的分子。

例如抗原-抗體、生物素-親和素等均可看成是探針與靶分子的相互作用。

當(dāng)前12頁，總共68頁。核酸探針

指能與特定核苷酸序列發(fā)生特異互補雜交，雜交后又能被特殊方法檢測的已知被標(biāo)記（同位素或非同位素標(biāo)記）的核苷酸鏈。靶分子：核酸（DNAorRNA）核酸探針:1.與靶核酸分子特異互補的核苷酸鏈。2.被標(biāo)記，能被特殊方法檢測。實質(zhì)：通過檢測探針上的標(biāo)志物來反應(yīng)靶分子的存在與否以及量的多少。當(dāng)前13頁，總共68頁。二、分類

根據(jù)性質(zhì)和來源不同：

（1）基因組DNA探針

有內(nèi)含子，雜交效率低

（2）cDNA探針

無內(nèi)含子，適用于基因表達(dá)的檢測

（3）RNA探針

單鏈性，特異性高；不穩(wěn)定，易降解

（4）寡核苷酸探針

合成方便，靈敏度受長度限制稍差當(dāng)前14頁，總共68頁。二、分類

根據(jù)標(biāo)記方法不同：

（1）放射性探針

（2）非放射性探針

當(dāng)前15頁，總共68頁。理想的核酸探針標(biāo)記物應(yīng)具備

①高度的敏感性

②標(biāo)記物與探針結(jié)合后，不影響雜交時堿基配對及探針分子的主要理化性質(zhì)；③檢測方法除有高靈敏性、高特異性、假陽性率低外，尚需考慮環(huán)境污染少，價格低；

④若用酶標(biāo)記，應(yīng)對酶的Km值影響不大，以保證標(biāo)記反應(yīng)的效率和標(biāo)記產(chǎn)物的比活性。三、標(biāo)記當(dāng)前16頁，總共68頁。（一）標(biāo)記物

放射性同位素標(biāo)記物

非放射同位素標(biāo)記物

當(dāng)前17頁，總共68頁。

1.放射性

常用的有32P/35S/3H。

特點：

檢測的靈敏度和特異性高

射線對人體有傷害

放射性物質(zhì)需特殊的處理

半衰期短不宜存放使用

當(dāng)前18頁，總共68頁。2.非放射性標(biāo)記物

常用的有地高辛（digoxigenin，Dig）、生物素（biotin）、熒光素、酶。

特點：

敏感性不如同位素標(biāo)記

穩(wěn)定性高、檢測時間短

操作簡便

不需特殊的防護(hù)設(shè)備

不存在放射性污染當(dāng)前19頁，總共68頁。（二）標(biāo)記法

酶反應(yīng)法

將標(biāo)記物（放射或非放射）預(yù)先標(biāo)記在核苷酸分子上，然后通過酶促反應(yīng)將標(biāo)記的核苷酸分子滲入探針分子中?；瘜W(xué)反應(yīng)法

利用標(biāo)記物(非放射為主)分子上的活性基團(tuán)與核酸分子上的基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而將標(biāo)記物結(jié)合到探針分子上。當(dāng)前20頁，總共68頁。1、隨機(jī)引物法（randompriming）

利用DNA聚合酶來合成與模板互補的新的DNA鏈。

將6-8寡核苷酸片段與已變性的DNA單鏈或RNA模板退火，使該片段隨機(jī)互補結(jié)合在單鏈分子上，在大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段作用下，以同位素標(biāo)記的dNTP為原料，寡核苷酸為引物的3’-OH端開始沿5’至3’方向，合成一條與模板互補的新DNA鏈。當(dāng)前21頁，總共68頁。隨機(jī)引物（6-8nt）：含有各種可能排列順序的寡核苷酸片段的混合物。46=409648=65536DNA聚合酶ⅠKlenow片段：5’→3’DNA聚合酶活性弱3’→5’外切核酸酶活性無5’→3’外切核酸酶活性鏈替代，比活高隨機(jī)引物法（randompriming）當(dāng)前22頁，總共68頁。

2、切口平移法

◆胰DNA酶I在DNA雙鏈上隨機(jī)切開若干切口，切口處形成3’-OH末端。

◆大腸桿菌DNA聚合酶I以切口處開始作用，以另一條DNA鏈為模板。

◆4種三磷酸脫氧核苷酸為原料，沿切口水解5’端核苷酸和3’端修復(fù)加入標(biāo)記核苷酸同時進(jìn)行，切口平行推移。

生成的兩條鏈都被同位素均勻標(biāo)記。當(dāng)前23頁，總共68頁。大腸桿菌DNA聚合酶I的活性種類？5’3’聚合酶活性3’

5’外切酶活性5’3’

外切酶活性當(dāng)前24頁，總共68頁。大腸桿菌DNA聚合酶I

（1）5’3’聚合酶活性標(biāo)記當(dāng)前25頁，總共68頁。（2）3’5’外切酶活性當(dāng)前26頁，總共68頁。（3）5’3’外切酶活性切口平移當(dāng)前27頁，總共68頁。

5’->3’外切酶活性使缺口平移5’->3’聚合酶活性上游鏈延伸而被標(biāo)記當(dāng)前28頁，總共68頁。3.末端標(biāo)記法

末端標(biāo)記法是將標(biāo)記物導(dǎo)入線型DNA或RNA的5’端或3’端的一類標(biāo)記法。

5’端標(biāo)記法

3’端標(biāo)記法當(dāng)前29頁，總共68頁。（1）5’端標(biāo)記法（T4多聚核苷酸激酶）

用堿性磷酸酶切除DNA雙鏈分子或RNA單鏈5’末端的磷酸基團(tuán)，使其成為5’-OH，然后在（γ-32P）ATP存在下，經(jīng)T4多聚核苷酸激酶催化，將γ位上的32P轉(zhuǎn)移到DNA或RNA分子的5’-OH末端，使DNA片段或RNA或寡核苷酸5’端均帶32P標(biāo)記。當(dāng)前30頁，總共68頁。T4多聚核苷酸激酶催化當(dāng)前31頁，總共68頁。（2）3’端標(biāo)記法（大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段）

大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段有5’→3’DNA聚合酶和微弱的3’→5’外切酶活性，但無5’→3’外切酶活性。對殘缺3’末端可進(jìn)行標(biāo)記。

末端的性質(zhì)？當(dāng)前32頁，總共68頁。當(dāng)前33頁，總共68頁。教學(xué)內(nèi)容核酸分子雜交的基本原理

核酸探針

核酸分子雜交技術(shù)方法

DNA芯片技術(shù)當(dāng)前34頁，總共68頁。

核酸分子雜交↓

固相雜交液相雜交膜上印跡雜交核酸原位雜交核酸分子雜交的分類核酸分子雜交技術(shù)是一種信號放大技術(shù)。當(dāng)前35頁，總共68頁。一、膜上印跡雜交

印跡技術(shù)：將凝膠中待測的核酸分子轉(zhuǎn)移到一定的固相支持物上的方法。指將待測核酸序列結(jié)合到一定的支持物上，然后與存在于液相中的核酸探針進(jìn)行雜交的過程。當(dāng)前36頁，總共68頁。1．固相支持物的選擇常用的固相支持物：硝酸纖維膜（NC）尼龍膜PVDF膜（聚二氟乙烯膜）當(dāng)前37頁，總共68頁。2．印跡方法Methodsoftransfer虹吸印跡法（Capillary）真空轉(zhuǎn)移法（Vacuum）電轉(zhuǎn)移法（Electrophoretic）BlotDNAtomembrane當(dāng)前38頁，總共68頁。

CapillaryBlotting(upward)

nospecialequipmentrequired!1975年E.SouthernSouthernDNA印跡轉(zhuǎn)移技術(shù)DNA片段<1kb，1小時DNA片段>15kb，18小時當(dāng)前39頁，總共68頁。當(dāng)前40頁，總共68頁。Electrophoreticblotting不宜用硝酸纖維素膜一般2~3小時，最多6~8小時especiallygoodforsmallfragmentsresolvedbyPAGE當(dāng)前41頁，總共68頁。Vacuumblotting30~60分鐘moreefficientandquantitativethancapillarymustapplyvacuumevenlyandnottoostrongly當(dāng)前42頁，總共68頁。3．印跡類型Southern印跡雜交Northern印跡雜交斑點及狹縫印跡雜交菌落或噬菌斑雜交原位雜交當(dāng)前43頁，總共68頁。提取DNA限制性內(nèi)切酶消化瓊脂糖凝膠電泳堿變性轉(zhuǎn)移到NC膜，高溫烘烤與DNA或RNA探針雜交放射自顯影Southernblottinghybridization預(yù)雜交當(dāng)前44頁，總共68頁。當(dāng)前45頁，總共68頁。Southern印跡雜交的應(yīng)用：

檢測靶分子為DNA,檢測靶分子是否含有目的基因。

可用于基因組基因的定性及定量分析、克隆基因的酶切圖譜分析、基因突變分析、DNA指紋圖譜等。當(dāng)前46頁，總共68頁。Northern印跡雜交

應(yīng)用DNA探針檢測特異mRNA的一種雜交技術(shù)，主要用于分析mRNA的轉(zhuǎn)錄或mRNA分子大小，其方法類似于Southern印跡雜交。

當(dāng)前47頁，總共68頁。RNA極易被RNase降解RNA酶抑制劑0.1%DEPC處理水(焦碳酸二乙酯)Northernblottinghybridization檢測靶分子為RNA，單鏈，探針制備時需注意是否與靶分子配對。當(dāng)前48頁，總共68頁。pancreaskidneyskeletalliverlungplacentabrainheartmuscleGEFmRNANouthernblottinghybridization當(dāng)前49頁，總共68頁。優(yōu)點：簡單、迅速（直接點樣）；可在同一張膜上進(jìn)行多個樣品的檢測；應(yīng)用：同一種樣品經(jīng)不同倍數(shù)的稀釋,可以得到半定量的結(jié)果；核酸粗提樣品的檢測效果也較好。Dotandslotblottinghybridization將變性后的DNA或RNA直接點樣于膜上當(dāng)前50頁，總共68頁。檢測的是基因組DNA還是mRNA?當(dāng)前51頁，總共68頁。Colonyorphagehybridization

從重組DNA文庫中篩選陽性克隆當(dāng)前52頁，總共68頁。核酸原位雜交（nucleicacidhybridizationinsitu）用標(biāo)記的已知核酸序列為探針，與細(xì)胞涂片或組織切片中核酸進(jìn)行雜交檢測的方法。每張標(biāo)本所用雜交液較少，20~100μl，為了避免雜交液蒸發(fā)后造成雜交液濃縮，需使用密閉的濕盒。在組織或細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行DNA或RNA精確定位和定量。當(dāng)前53頁，總共68頁。核酸原位雜交的基本步驟1.細(xì)胞或組織的固定：載玻片2.組織細(xì)胞雜交前的預(yù)處理用去垢劑或蛋白酶除去核酸表面蛋白質(zhì)3.探針的選擇和標(biāo)記4.雜交5.雜交結(jié)果檢測當(dāng)前54頁，總共68頁。探針與分裂中期染色體DNA雜交，研究特定核酸序列在染色體中的精確定位；探針與細(xì)胞內(nèi)RNA進(jìn)行雜交，觀察該組織細(xì)胞中特定基因的表達(dá)水平；用特異性的細(xì)菌、病毒的核酸作為探針對組織細(xì)胞進(jìn)行雜交，確定有無該病原體的感染。應(yīng)用：當(dāng)前55頁，總共68頁。FISH(熒光原位雜交)結(jié)果地高辛標(biāo)記的探針用抗地高辛-羅丹明顯示(紅色)生物素標(biāo)記的探針，用抗生物素蛋白-FITC顯示(綠色)當(dāng)前56頁，總共68頁。1.熒光染色體原位雜交(FluorescenceinsituHybridization；FISH)

基本原理是將DNA探針用熒光染料標(biāo)記，然后將標(biāo)記的探針直接原位雜交到染色體上，來檢測DNA序列在染色體上的定位。

2.比較基因組原位雜交(ComparativeGenomicHybridization；CGH)由原位雜交發(fā)展起的一些新技術(shù)自學(xué)當(dāng)前57頁，總共68頁。雜交基本流程（一）核酸分子與固相介質(zhì)的結(jié)合

1.噬菌體/克隆的轉(zhuǎn)移

2.從凝膠上轉(zhuǎn)移DNA:毛細(xì)轉(zhuǎn)移、真空轉(zhuǎn)移、電轉(zhuǎn)移（二）核酸的固定：烘烤（80℃，2h）、紫外、堿（三）雜交：預(yù)雜交、雜交、洗脫（四）雜交信號的檢測：放射自顯影、非放射性雜化分子的檢測當(dāng)前58頁，總共68頁。核酸分子的濃度和長度：50～300bp,0.1～0.5g2.溫度:Tm-25℃3.離子強度:Na+濃度約為1mol/L4.雜交液中的甲酰胺:50%甲酰胺,降低Tm5.核酸分子的復(fù)雜性6.非特異性雜交反應(yīng):封閉影響雜交的因素當(dāng)前59頁，總共68頁。常用封閉物：①變性非特異DNA：鮭魚精子DNA， 小牛胸腺DNA②高分子化合物：Denhardt溶液 脫脂奶粉當(dāng)前60頁，總共68頁。核酸雜交分類表雜交方法適用范圍Southern印跡檢測經(jīng)凝膠電泳分開的DNA分子，需轉(zhuǎn)印到膜上Northern印跡檢測經(jīng)凝膠電泳分開的RNA分子，需轉(zhuǎn)印到膜上斑點及狹縫印跡雜交檢測未經(jīng)分離的、固定在膜上的DNA或RNA分子菌落或噬菌斑雜交檢測固定在膜上的、經(jīng)裂解后從細(xì)菌或噬菌體中釋放出的DNA分子原位雜交檢測細(xì)胞或組織中的DNA或RNA分子當(dāng)前61頁，總共68頁。教學(xué)內(nèi)容核酸分子雜交的基本原理

核酸探針

核酸分子雜交技術(shù)方法

DNA芯片技術(shù)當(dāng)前62頁，總共68頁。生物芯片技術(shù)采用類似集成電路制作中的微加工技術(shù)，將生命科學(xué)研究中的若干不連續(xù)過程（如樣品制備、生化反應(yīng)、檢測和分析步驟）集成到一塊幾平方厘米的芯片上，使這些分散的過程連續(xù)化與微型化，實現(xiàn)對大量生物樣品中的各種數(shù)據(jù)的快速、自動和并行處理和分析。芯片技術(shù)當(dāng)前63頁，總共68頁。微陣列