生物傳感器在食品檢測(cè)中的應(yīng)用

1生物傳感器的基本概念生物傳感器通常是指由一種生物敏感部件和轉(zhuǎn)化器緊密結(jié)合,對(duì)特定種類化學(xué)物質(zhì)或生物活性物質(zhì)具有選擇性和可逆響應(yīng)的分析裝置。它是發(fā)展生物技術(shù)必不可少的一種先進(jìn)的檢測(cè)與監(jiān)控方法,也是對(duì)物質(zhì)在分子水平上進(jìn)行快速和微量分析的方法當(dāng)前1頁，總共57頁。1.1生物傳感器工作原理生物傳感器的工作原理是待測(cè)物質(zhì)經(jīng)擴(kuò)散作用進(jìn)入固定生物膜敏感層，經(jīng)分子識(shí)別而發(fā)生生物學(xué)作用，產(chǎn)生的信息如光、熱、音等被相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)換器變?yōu)榭啥亢吞幚淼碾娦盘?hào)，再經(jīng)二次儀表放大并輸出，以電極測(cè)定其電流值或電壓值，從而換算出被測(cè)物質(zhì)的量或濃度。當(dāng)前2頁，總共57頁。換能器（Transducer）感受器（Receptor）測(cè)量信號(hào)（MeasurableSignal）=分析物（Analyte）溶液（Solution）選擇性膜（Thinselectivemembrane）識(shí)別元件（RECOGNITION）生物傳感器工作機(jī)理當(dāng)前3頁，總共57頁。轉(zhuǎn)換器敏感元件待測(cè)物生物傳感器的模型當(dāng)前4頁，總共57頁。當(dāng)前5頁，總共57頁。1.1.1將化學(xué)變化轉(zhuǎn)變成電信號(hào)酶?jìng)鞲衅鳛槔?酶催化特定底物發(fā)生反應(yīng),從而使特定生成物的量有所增減.用能把這類物質(zhì)的量的改變轉(zhuǎn)換為電信號(hào)的裝置和固定化酶耦合,即組成酶?jìng)鞲衅?常用轉(zhuǎn)換裝置有氧電極、過氧化氫。當(dāng)前6頁，總共57頁。1.1.2將熱變化轉(zhuǎn)換成電信號(hào)固定化的生物材料與相應(yīng)的被測(cè)物作用時(shí)常伴有熱的變化.例如大多數(shù)酶反應(yīng)的熱焓變化量在25-100kJ/mol的范圍.這類生物傳感器的工作原理是把反應(yīng)的熱效應(yīng)借熱敏電阻轉(zhuǎn)換為阻值的變化,后者通過有放大器的電橋輸入到記錄儀中.當(dāng)前7頁，總共57頁。1.1.3將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)

例如，過氧化氫酶,能催化過氧化氫/魯米諾體系發(fā)光,因此如設(shè)法將過氧化氫酶膜附著在光纖或光敏二極管的前端,再和光電流測(cè)定裝置相連,即可測(cè)定過氧化氫含量.還有很多細(xì)菌能與特定底物發(fā)生反應(yīng),產(chǎn)生熒光.也可以用這種方法測(cè)定底物濃度.當(dāng)前8頁，總共57頁。上述三原理的生物傳感器共同點(diǎn)：都是將分子識(shí)別元件中的生物敏感物質(zhì)與待測(cè)物發(fā)生化學(xué)反應(yīng),將反應(yīng)后所產(chǎn)生的化學(xué)或物理變化再通過信號(hào)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)進(jìn)行測(cè)量,這種方式統(tǒng)稱為間接測(cè)量方式.當(dāng)前9頁，總共57頁。1.1.4直接產(chǎn)生電信號(hào)方式這種方式可以使酶反應(yīng)伴隨的電子轉(zhuǎn)移、微生物細(xì)胞的氧化直接(或通過電子遞體的作用)在電極表面上發(fā)生.根據(jù)所得的電流量即可得底物濃度.當(dāng)前10頁，總共57頁。1.2生物傳感器發(fā)展歷程開端于20世紀(jì)60年代。1962年克拉克等人報(bào)道了用葡萄糖氧化酶與氧電極組合檢測(cè)葡萄糖的結(jié)果,可認(rèn)為是最早提出了生物傳感器(酶?jìng)鞲衅?的原理。1967年Updike等人實(shí)現(xiàn)了酶的固定化技術(shù),研制成功酶電極,這被認(rèn)為是世界上第一個(gè)生物傳感器。

當(dāng)前11頁，總共57頁。20世紀(jì)70年代中期后,生物傳感器技術(shù)的成功主要集中在對(duì)生物活性物質(zhì)的探索、活性物質(zhì)的固定化技術(shù)、生物電信息的轉(zhuǎn)換以及生物傳感器等研究,并獲得了較快的進(jìn)展,如Divies首先提出用固定化細(xì)胞與氧電極配合,組成對(duì)醇類進(jìn)行檢測(cè)所謂“微生物電極”。1977年,鈐木周一等發(fā)表了關(guān)于對(duì)生化需氧量(BOD)進(jìn)行快速測(cè)定的微生物傳感器的報(bào)告,并在微生物傳感器對(duì)發(fā)酵過程的控制等方面,作了詳細(xì)報(bào)導(dǎo),正式提出了對(duì)生物傳感器的命名。當(dāng)前12頁，總共57頁。1.3生物傳感器分類（1）根據(jù)傳感器輸出信號(hào)的產(chǎn)生方式,可分為生物親合型生物傳感器、代謝型或催化型生物傳感器;（2）根據(jù)生物傳感器的信號(hào)轉(zhuǎn)換器可分為電化學(xué)生物傳感器、半導(dǎo)體生物傳感器、測(cè)熱型生物傳感器、測(cè)光型生物傳感器、測(cè)聲型生物傳感器等（3）根據(jù)生物傳感器中生物分子識(shí)別元件上的敏感材料可分為酶?jìng)鞲衅?、微生物傳感器、免疫傳感器、組織傳感器、基因傳感器、細(xì)胞及細(xì)胞器傳感器。當(dāng)前13頁，總共57頁。

生物親合型傳感器被測(cè)物質(zhì)與分子識(shí)別元件上的敏感物質(zhì)具有生物親合作用，即二者能特異地相結(jié)合，同時(shí)引起敏感材料的分子結(jié)構(gòu)和/或固定介質(zhì)發(fā)生變化。例如：電荷、溫度、光學(xué)性質(zhì)等的變化。反應(yīng)式可表示為：

S（底物）+R（受體）=SR當(dāng)前14頁，總共57頁。

代謝型傳感器底物（被測(cè)物）與分子識(shí)別元件上的敏感物質(zhì)相作用并生成產(chǎn)物，信號(hào)轉(zhuǎn)換器將底物的消耗或產(chǎn)物的增加轉(zhuǎn)變?yōu)檩敵鲂盘?hào)，這類傳感器稱為代謝型傳感器，其反應(yīng)形式可表示為

S（底物）＋R（受體）=SR→P（生成物）

當(dāng)前15頁，總共57頁。當(dāng)前16頁，總共57頁。上面介紹的各種名稱都是類別的名稱，每一類又都包含許多種具體的生物傳感器例如，僅酶電極一類，根據(jù)所用酶的不同就有幾十種，如葡萄糖電極、尿素電極、尿酸電極、膽固醇電極、乳酸電極、丙酮酸電極等等．就是葡萄糖電極也并非只有一種，有用pH電極或碘離子電極作為轉(zhuǎn)換器的電位型葡萄糖電極，有用氧電極或過氧化氫電極作為轉(zhuǎn)換器的電流型葡萄糖電極等．實(shí)際上還可再細(xì)分。當(dāng)前17頁，總共57頁。1.4生物傳感器組成部分一是生物分子識(shí)別元件(感受器),是具有分子識(shí)別能力的生物活性物質(zhì)(如組織切片、細(xì)胞、細(xì)胞器、細(xì)胞膜、酶、抗體、核酸、有機(jī)物分子等);二是信號(hào)轉(zhuǎn)換器(換能器),主要有電化學(xué)電極(如電位、電流的測(cè)量)、光學(xué)檢測(cè)元件、熱敏電阻、場(chǎng)效應(yīng)晶體管、壓電石英晶體及表面等離子共振器件等，當(dāng)待測(cè)物與分子識(shí)別元件特異性結(jié)合后,所產(chǎn)生的復(fù)合物(或光、熱等)通過信號(hào)轉(zhuǎn)換器變?yōu)榭梢暂敵龅碾娦盘?hào)、光信號(hào)等,從而達(dá)到分析檢測(cè)的目的。當(dāng)前18頁，總共57頁。1.5生物傳感器優(yōu)點(diǎn)(1)根據(jù)生物反應(yīng)的特異性和多樣性,理論上可以制成測(cè)定所有生物物質(zhì)的傳感器,因而測(cè)定范圍廣泛(2)一般不需進(jìn)行樣品的預(yù)處理,它利用本身具備的優(yōu)異選擇性把樣品中被測(cè)組分的分離和檢測(cè)統(tǒng)一為一體，測(cè)定時(shí)一般不需另加其他試劑,使測(cè)定過程簡(jiǎn)便迅速,容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)分析(3)體積小、響應(yīng)快、樣品用量少,可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)在位檢測(cè)當(dāng)前19頁，總共57頁。(4)通常其敏感材料是固定化生物元件,可反復(fù)多次使用(5)準(zhǔn)確度高,一般相對(duì)誤差可達(dá)到1%以內(nèi)(6)可進(jìn)行活體分析(7)傳感器連同測(cè)定儀的成本遠(yuǎn)低于大型的分析儀,因而便于推廣普及(8)有的微生物傳感器能可靠地指示微生物培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)的供氧狀況和副產(chǎn)物的產(chǎn)生，能得到許多復(fù)雜的物理化學(xué)傳感器綜合作用才能獲得的信息當(dāng)前20頁，總共57頁。第二節(jié)敏感器件（分子識(shí)別元件）當(dāng)前21頁，總共57頁。酶?jìng)鞲衅?EnzymeSensor)當(dāng)前22頁，總共57頁。酶的活力單位（酶單位）1）標(biāo)準(zhǔn)酶單位國際生物化學(xué)協(xié)會(huì)酶委員會(huì)規(guī)定了酶單位的標(biāo)準(zhǔn)形式為：一個(gè)酶單位（U）是在特定的條件下lmin內(nèi)催化形成1μmol產(chǎn)物的酶量（或轉(zhuǎn)化1mo1底物的酶量）．特定條件一般是指選定的條件，如溫度為25℃，30℃，37℃，最適pH,底物為飽和溶液．當(dāng)前23頁，總共57頁。2）酶的比活力

每毫克蛋白質(zhì)所含某酶的活力單位數(shù)稱某酶的比活力．3）酶濃度每毫升酶蛋白溶液所含某酶的活力單位數(shù)稱某酶濃度．一定重量或一定體積酶制劑所具有的酶活力單位數(shù)叫做總活力．在酶的提純過程中，總活力逐漸下降，比活力逐漸提高．當(dāng)前24頁，總共57頁。4）轉(zhuǎn)換值

也稱分子活力或摩爾活力．其定義是1摩爾酶在最適條件下，1min內(nèi)所轉(zhuǎn)化的底物的摩爾數(shù)．轉(zhuǎn)化值的單位為min-1．轉(zhuǎn)換值的倒數(shù)是一個(gè)催化循環(huán)所需要的時(shí)間．

當(dāng)前25頁，總共57頁。酶的固定化技術(shù)固定化酶使酶的利用率、穩(wěn)定性與機(jī)械強(qiáng)度等方面均較可溶性酶有所提高，使用固定化酶為酶電極的制備提供了良好的條件.當(dāng)前26頁，總共57頁。當(dāng)前27頁，總共57頁。1.惰性載體——物理吸附法此法是酶分子通過極性鍵、氫鍵、疏水力或π電子相互作用等吸附于不溶性載體上．常用的載體有：多孔玻璃、活性炭、氧化鋁、石英砂、纖維素酯（包括硝酸纖維素、醋酸纖維素）、葡聚糖、瓊脂精、聚氯乙烯、聚苯乙烯等.已用此法固定化的酶如：脂肪酶、α－D葡萄糖苷酶、過氧化物酶等．當(dāng)前28頁，總共57頁。2.離子載體—交換法

選用具有離子交換劑的載體，在適宜的pH下，使酶分子與離子交換劑通過離子鍵結(jié)合起來，形成固定化酶．常用的帶有離子交換劑的載體如下DEAE一纖維素、TEAE一纖維素、AE—纖維素、CM—纖維素、DEAE一葡萄糖、肌酸激酶等．3．活化載體—共價(jià)結(jié)合法

a.重氮法b.迭氮法c.鹵化氰法．d.縮合法e.烷基化法當(dāng)前29頁，總共57頁。4.物理包埋法此法是將酶分子包埋在凝膠的細(xì)微格子里制成固定化.常用的凝膠有：聚丙烯酸胺、淀粉、明膠、聚乙烯醇、海藻酸鈣、桂樹脂等．用凝膠包埋法制備的固定化酶如：木瓜蛋白酶、纖維素酶、乳酸脫氫酶等．當(dāng)前30頁，總共57頁。酶?jìng)鞲衅魉鼘⒒钚晕镔|(zhì)酶覆蓋在電極表面,酶與被測(cè)的有機(jī)物或無機(jī)物反應(yīng),形成一種能被電極響應(yīng)的物質(zhì)。例如,脲在尿素酶催化下發(fā)生反應(yīng)1967年Updick和Hicks將固定化的葡萄糖氧化酶膜結(jié)合在氧電極上,做成了第一支葡萄糖電極；此后,這類酶?jìng)鞲衅魍ǔＪ峭ㄟ^檢測(cè)產(chǎn)物H2O2的濃度變化或氧的消耗量來檢測(cè)底物。當(dāng)前31頁，總共57頁。當(dāng)前32頁，總共57頁。葡萄糖電極缺點(diǎn):(1)溶解氧的變化可能引起電極響應(yīng)的波動(dòng);(2)由于氧的溶解度有限,當(dāng)溶解氧貧乏時(shí),響應(yīng)電流明顯下降而影響檢測(cè)限;(3)傳感器響應(yīng)性能受溶液pH值和溫度影響較大當(dāng)前33頁，總共57頁。第二代生物傳感器,即介體型生物傳感器,常用媒介體有鐵氰化物、有機(jī)染料、醌及其衍生物、導(dǎo)電有機(jī)鹽類和二茂鐵及其衍生物。最近,人們更關(guān)注酶與電極之間的直接電子傳遞研究,并用于構(gòu)造第三代生物傳感器依據(jù)信號(hào)轉(zhuǎn)換器的類型,酶?jìng)鞲衅鞔笾驴煞譃槊鸽姌O(主要包括離子選擇電極、氣敏電極、氧化還原電極等電化學(xué)電極)、酶場(chǎng)效應(yīng)晶體管傳感器(FET-酶)和酶熱敏電阻傳感器等當(dāng)前34頁，總共57頁。當(dāng)前35頁，總共57頁。3.3微生物傳感器(MicroorganismSensor)微生物傳感器分為兩類：一類是利用微生物在同化底物時(shí)消耗氧的呼吸作用；另一類是利用不同的微生物含有不同的酶。好氧微生物在繁殖時(shí)需消耗大量的氧,可以氧濃度的變化來觀察微生物與底物的反應(yīng)情況。當(dāng)前36頁，總共57頁。裝置是：由適合的微生物電極與氧電極組成。原理是：利用微生物的同化作用耗氧,通過測(cè)量氧電極電流的變化量來測(cè)量氧氣的減少量,從而達(dá)到測(cè)量底物濃度的目的.當(dāng)前37頁，總共57頁。例如,熒光假單胞菌,能同化葡萄糖；蕓苔絲孢酵母可同化乙醇,因此可分別用來制備葡萄糖和乙醇傳感器，這兩種細(xì)菌在同化底物時(shí),均消耗溶液中的氧,因此可用氧電極來測(cè)定基于不同類型的信號(hào)轉(zhuǎn)換器,常見的微生物傳感器有電化學(xué)型、光學(xué)型、熱敏電阻型、壓電高頻阻抗型和燃料電池型，當(dāng)前38頁，總共57頁。當(dāng)前39頁，總共57頁?？贵w（antibody）抗體是一種免疫球蛋白．免疫球蛋白有5種，分別命名為IgG，IgA，IgM，IgD和IgE.無脊椎動(dòng)物不產(chǎn)生免疫球蛋白．魚有IgM,兩棲類有IgM和IgG.除人類有5種免疫球蛋白外，大多數(shù)哺乳動(dòng)物只有IgG，IgA,IgM和IgE四種免疫球蛋白．抗原（antigen）抗原是一種進(jìn)入機(jī)體后能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的物質(zhì)．它可能是生物體(如各種微生物),也可能是非生物體(如各種異類蛋白、多糖等).通常，分子量大于10000，而且具有一定結(jié)構(gòu)（如苯環(huán)或雜環(huán)等結(jié)構(gòu)）的物質(zhì)均可成為抗原性物質(zhì)，都能有效地誘發(fā)產(chǎn)生抗體．3.4免疫傳感器(Immunosensor)當(dāng)前40頁，總共57頁?？贵w對(duì)相應(yīng)的抗原具有識(shí)別和結(jié)合的雙重功能,在與抗原結(jié)合時(shí),選擇性強(qiáng),靈敏度高，免疫傳感器就是利用其雙重功能將抗體或抗原和換能器組合而成的裝置。由于蛋白質(zhì)分子(抗體或抗原)攜帶有大量電荷、發(fā)色基團(tuán)等,當(dāng)抗原抗體結(jié)合時(shí),會(huì)產(chǎn)生電學(xué)、化學(xué)、光學(xué)等變化,通過適當(dāng)?shù)膫鞲衅骺蓹z測(cè)這些參數(shù),從而構(gòu)成不同的免疫傳感器，總的來說可分為兩類:(1)非標(biāo)記型;(2)標(biāo)記型當(dāng)前41頁，總共57頁。如黃曲霉毒素傳感器,它由氧電極和黃曲霉毒素抗體膜組成,加到待測(cè)樣品中,酶標(biāo)記的及未標(biāo)記的黃曲霉毒素便會(huì)與膜上的黃曲霉毒素抗體發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng),測(cè)定酶標(biāo)黃曲霉毒素與抗體的結(jié)合率,便可知樣品中的含量根據(jù)使用的信號(hào)轉(zhuǎn)換器,有電化學(xué)免疫傳感器、光學(xué)免疫傳感器、壓電免疫傳感器及表面等離子體共振(SPR)型傳感器。當(dāng)前42頁，總共57頁。3.5核酸傳感器(TheSensorofNucleicAcid)依據(jù)生物體內(nèi)核苷酸順序相對(duì)穩(wěn)定,核苷酸堿基順序互補(bǔ)的原理而設(shè)計(jì)出核酸探針傳感器,即基因傳感器?；騻鞲衅饕话阌?0~30個(gè)核苷酸的單鏈核酸分子,能夠?qū)Ｒ坏嘏c特定靶序列進(jìn)行雜交從而檢測(cè)出特定的目標(biāo)核酸分子。根據(jù)換能器種類不同可分為電化學(xué)型、光學(xué)型、壓電免疫傳感器及表面等離子體共振型基因傳感器，這種傳感器可用于檢測(cè)食品中的病原體,為食品中病原體的鑒定提供了新的手段。當(dāng)前43頁，總共57頁。4生物傳感器的應(yīng)用在食品分析中的應(yīng)用在環(huán)境監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用在軍事上的應(yīng)用當(dāng)前44頁，總共57頁。4.1在食品分析的應(yīng)用食品成分分析食品添加劑的分析農(nóng)藥和抗生素殘留量分析微生物和生物毒素的檢驗(yàn)食品鮮度的檢測(cè)當(dāng)前45頁，總共57頁。當(dāng)前46頁，總共57頁。當(dāng)前47頁，總共57頁。當(dāng)前48頁，總共57頁。當(dāng)前49頁，總共57頁。當(dāng)前50頁，總共57頁。水質(zhì)分析：一個(gè)典型應(yīng)用是測(cè)定生化需氧量（BOD），傳統(tǒng)方法測(cè)BOD需5天，且操作復(fù)雜。1977年Karube等首次報(bào)道了BOD微生物傳感器，只需15分鐘即能測(cè)出結(jié)果,連續(xù)使用壽命達(dá)17天；廢氣或環(huán)境大氣的監(jiān)測(cè)：可用于測(cè)定空氣中SO2、NOX、CO2、NH3、CH4等的含量；農(nóng)藥和抗生素殘留量的分析：用乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶為敏感材料制作的離子敏場(chǎng)效應(yīng)晶體管酶?jìng)鞲衅骺捎糜谑卟说葮悠分杏?/p>