動物實驗基本技術和方法

動物實驗基本技術和方法第1頁/共116頁一、實驗前準備理論準備：了解動物實驗基礎知識制定研究計劃和方案查閱關于實驗方法的參考文獻條件準備：儀器、器械、藥品運輸動物實驗和飼養(yǎng)場所第2頁/共116頁二、實驗動物抓取和固定（一）小鼠第3頁/共116頁第4頁/共116頁小鼠固定器固定第5頁/共116頁（二）大鼠第6頁/共116頁大鼠固定盒固定第7頁/共116頁（三）豚鼠第8頁/共116頁第9頁/共116頁（四）家兔第10頁/共116頁第11頁/共116頁兔子固定器固定第12頁/共116頁狗鉗狗的抓取固定（五）犬第13頁/共116頁犬嘴固定方法第14頁/共116頁貓的抓取犬固定第15頁/共116頁（六）猴抓取與保定第16頁/共116頁猴徒手固定第17頁/共116頁三、年齡的大致判斷（一）大、小鼠1、根據(jù)形態(tài)鑒定日齡（大、小鼠情況基本一樣）日齡/d外觀形態(tài)特征1仔鼠裸體鮮紅3耳殼露出表皮4臍帶瘢痕脫落5能翻身8能爬行第18頁/共116頁日齡/d外觀形態(tài)特征10能聽到聲音9～11全身被白毛，門齒長出13～15眼皮張開，能跳躍，能抓取東西18以后能自行采食，獨立生活第19頁/共116頁第20頁/共116頁第21頁/共116頁第22頁/共116頁第23頁/共116頁第24頁/共116頁第25頁/共116頁2.根據(jù)體重鑒定日齡⑴小鼠日齡與體重的對應日齡/d初生

51015202530體重/g

1.84.06.011.015.021.024.0第26頁/共116頁⑵大鼠日齡與體重的對應日齡/d初生10203040體重/g6～717～2535～5055～90100～150日齡/d

50607080體重/g150～210170～240210～270240～320第27頁/共116頁（二）豚鼠一般老年豚鼠牙齒和趾爪長，被毛稀疏無光澤，眼神呆滯，行動遲緩。而年輕豚鼠牙齒短白，爪短軟，眼睛圓亮，行動敏捷，被毛有光澤，且緊貼身體。同樣，也可根據(jù)體重來推斷大致年齡。同日齡豚鼠，雌性體重略高于雄性。與大鼠一樣，其體重受多種因素的制約。實驗對年齡要求比較嚴格時，必須由卡片記錄提供準確年齡。日齡/d初生7203060體重/g60～80100～120150～200170～220240～300日齡/d

90120180體重/g330～400400～470520～600第28頁/共116頁（三）家兔家兔的門齒和爪隨年齡增長而增長，是年齡鑒別的重要標志。青年兔門齒潔白，短小，排列整齊；老年兔門齒暗黃，厚而長，排列不整齊，有時破損。白色家兔趾小基本呈紅色，尖端呈白色。1歲家兔紅色與白色長度相等；1歲以下，紅多于白；1歲以上，白多于紅。還可根據(jù)趾爪的長度與彎曲度來區(qū)別。青年兔趾爪較短，直平，隱在腳毛中，隨年齡的增長，趾爪露出于腳毛之外，而且爪尖鉤曲。另外，家兔皮薄而緊，眼神明亮，行動活潑的為青年兔；皮厚而松，眼神頹廢，行動遲緩的為老年兔。第29頁/共116頁（四）犬 犬的年齡主要以牙齒的生長情況、磨損程度、外形顏色等情況綜合判定。仔犬在出生后十幾天即開始生出乳齒，2個月以后開始由門齒→犬齒→臼齒順序逐漸更換為恒齒，8～l0個月齒換齊。但犬齒需要1歲半以后才能長堅實。飼養(yǎng)場飼養(yǎng)的品種犬，可以根據(jù)記錄，明確了解年齡，而收購的雜種犬就無法知道確切年齡。實際中，可根據(jù)犬齒更換和磨損情況，估計犬的年齡。第30頁/共116頁年齡犬齒更換和磨損情況2個月以下僅有乳齒(白、細、尖)2～4個月更換門齒4～6個月更換犬齒(白，牙尖圓鈍)6～10個月更換臼齒1歲牙長齊，潔白光亮。門齒有尖突2歲下門齒尖突部分磨乎3歲上、下門齒尖突大部分磨平4～5歲上、下門齒開始磨損呈微斜面，并發(fā)黃6～8歲門齒磨成齒根，犬齒發(fā)黃、磨損9～10歲唇部、胡須發(fā)白10歲以上門齒磨損，犬齒不齊全，牙根黃，唇邊胡須全白第31頁/共116頁四、性別、發(fā)情、與妊娠鑒定（一）大、小鼠的性別鑒定第32頁/共116頁初生兔仔如陰部孔洞扁圓而略大于肛門，且與肛門相向、距離較近的是母兔；孔洞呈圓形而略小于肛門，孔洞向前而距肛門較遠的是公兔。三月齡以上的兔子，只要看有無陰囊即可區(qū)別公母。（二）兔的性別鑒定第33頁/共116頁Female

Male

第34頁/共116頁（三）大、小鼠發(fā)情鑒定第35頁/共116頁小鼠性周期陰道分泌物涂片變化階段持續(xù)時間（h）涂片可見卵巢變化動情前期9-18大量有核上皮細胞少量角化上皮細胞卵泡加速生長動情期6-12滿視野角化上皮細胞，少量有核上皮細胞卵泡成熟、排卵動情后期30-48角化上皮細胞及白細胞黃體生成動情間期36-42大量白細胞及少量粘液黃體退化第36頁/共116頁（四）妊娠鑒定1、陰道栓法（大、小鼠、豚鼠）2、外部檢查法3、摸胎法4、陰道檢查法5、直腸檢查法6、超聲波檢查法7、孕酮含量測定法第37頁/共116頁陰道栓第38頁/共116頁五、編號和標記1、染色法：淺色動物3.5-5％苦味酸溶液（黃色）0.5%中性紅或堿性品紅溶液（紅色）煤焦油酒精溶液（黑色）龍膽紫溶液（紫色）第39頁/共116頁第40頁/共116頁2、打耳孔法：小型動物第41頁/共116頁

3、剪趾法：小型動物第42頁/共116頁4、剪尾法：大、小鼠，僅限與兩組間區(qū)分5、烙印法：刺號鉗，中、大型動物6、針刺法：中、大型動物7、號牌法：耳標簽、項圈、腿圈，中、大型動物8、剪毛法：大動物9、籠子標號第43頁/共116頁六、分組隨機化分組：避免人為影響例：將14只小鼠隨機分成兩組。①先將小鼠編為I～14號，②在隨機數(shù)字表上任點一數(shù)，按任意方向連續(xù)抄14個隨機數(shù)字。編排如下：第44頁/共116頁動物編號1234567891011121314隨機數(shù)字1622779439495443548217379323歸組BBABAABABBAAAA③奇數(shù)代表A織，偶數(shù)代表B組④A組：356811121314B組：1247910⑤調整分組：接剛才隨機數(shù)字23繼續(xù)抄表得隨機數(shù)字78，用78除以8（因為需要把A組的8個數(shù)字調整掉一個），得余數(shù)6，所以把A組的第6個動物，即12號動物調整到B組第45頁/共116頁⑥最終分組A組：3568111314B組：124791012第46頁/共116頁例：12只大鼠隨機分為3組①大鼠編號1~12②在隨機數(shù)字表上任點一數(shù)，按任意方向連續(xù)抄12個隨機數(shù)字。③每個數(shù)分別用3除，記錄余數(shù)，④根據(jù)余數(shù)分組大鼠編號：1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12隨機數(shù)字：08，27，01，50，15，29，39，39，43，79，69，10余數(shù)：2，0，1，2，0，2，0，0，1，1，0，1組別：B，C，A，B，C，B，C，C，A，A，C，A第47頁/共116頁⑤A：3，9，10，12B；1，4，6C：2，5，7，8，11⑥調整分組：接剛才隨機數(shù)字10繼續(xù)抄表得隨機數(shù)字61，用61除以5（因為需要把C組的5個數(shù)字調整掉一個），得余數(shù)1，所以把C組的第1個動物，即2號動物調整到B組。⑦最終分組A：3，9，10，12B；1，2，4，6C：5，7，8，11第48頁/共116頁七、去毛1、剪毛：彎頭剪毛剪。2、拔毛：大小鼠尾靜脈、家兔耳緣靜脈注射。3、剃毛：將剃毛部位先用剪刀粗剪一遍，蘸溫肥皂水潤濕，用剃刀順著被毛方向剃毛，用電動剃毛推剪，則逆被毛向剃毛。第49頁/共116頁4、化學脫毛：常用脫毛劑①8%硫化鈉水溶液②硫化鈉3份，洗衣粉1份、淀粉7份，加水調成糊狀③硫化鋇50克，氧化鋅25克，淀粉25克，加水100毫升調成糊狀④硫化鈉10克，生石灰15克，加水到100毫升，適合犬和其他大動物。第50頁/共116頁八、給藥途徑與方法（一）自動口服：加入飼料或飲水（二）投喂藥片：掰開口，放到舌根部第51頁/共116頁（三）灌胃（i.g)1、小鼠、大鼠、豚鼠灌胃時將灌胃針按在注射器上，吸入藥液。左手抓住鼠背部及頸部皮膚將動物固定，右手持注射器，將灌胃針插入動物口中，沿咽后壁徐徐插入食道。動物應固定成垂直體位，針插入時應無阻力。若感到阻力或動物掙扎時，應立即停止進針或將針拔出，以兔損傷或穿破食道以及誤入氣管。一般當灌胃針插入小鼠3～4cm，大鼠或豚鼠4～6cm后可將藥物注入。常用的灌胃量小鼠為0.2～

1ml，大鼠1～4ml，豚鼠為1～5ml。第52頁/共116頁2、狗、兔、貓、猴

灌胃時，先將動物固定，再將特制的擴口器放入動物口中，擴口器之寬度可視動物口腔大小而定，如狗的擴口器可用木料制成長方形，長約10～15cm，粗細應適合狗嘴，約2～3cm，中間粘一小孔，孔的直途為5～10cm。灌胃時將擴口器放于上述動物上下門牙之后，并用繩將它固定于嘴部，將帶有彈性的橡皮導管（如導尿管），經擴口器上的小圓孔插入，沿咽后壁而進入食道，此時應檢查導管是否正確插入食道，可將導管外口置于一盛水的燒杯中，如不發(fā)生氣泡，即認為此導管是在食道中，未誤入氣管，即可將藥液灌入。灌胃管插入長度狗為20cm，兔子為12-15cm。第53頁/共116頁動物最大灌胃量第54頁/共116頁第55頁/共116頁

（四）直腸給藥（五）呼吸道給藥（六）滴鼻（七）點眼（八）經皮膚給藥：常用于檢測藥物、毒物、化妝品等的透皮吸收、局部作用、至敏作用等。家兔和豚鼠選擇脊柱兩側皮膚，大小鼠常采取浸尾方式。（九）皮內注射(i.d)：一般用于接種或過敏實驗。將藥液注射在真皮和表皮之間。皮內注射時需將注射的局部脫去被毛，消毒后，用左手拇指和食指按住皮膚并使之繃緊，在兩指之間，用注射器連4(1/2)號細針頭，緊貼皮膚表層刺入皮內，然后再向上挑起并再稍刺入，即可注射藥液，此時可見皮膚表面鼓起一白色小皮丘。

第56頁/共116頁（十）皮下注射(s.c)：注射時以左手拇指和食指提起皮膚，將連有5（1/2）號針頭的注射器刺入皮下。皮下注射部位一般狗、貓多在大腿外側，豚鼠在后大腿的內側或小腹部；大白鼠可在側下腹部。兔在背部或耳根部注射。蛙可在脊背部淋巴腔注射。（十一）肌肉注射(i.m)：股部肌肉第57頁/共116頁（十二）腹腔注射(i.p)：用大、小白鼠做實驗時，以左手抓住動物，使腹部向上，右手將注射針頭于左（或右）下腹部刺入皮下，使針頭向前推

0.5～1.0cm，再以45度角穿過腹肌，固定針頭，緩緩注入藥液，為避免傷及內臟，可使動物處于頭低位，使內臟移向上腹。若實驗動物為家兔，進針部位為下腹部的腹白線離開1cm處。第58頁/共116頁第59頁/共116頁（十三）靜脈注射(i.v)：1、小鼠：尾靜脈2、大鼠：尾靜脈、陰莖靜脈、舌下靜脈、淺背側跖靜脈第60頁/共116頁大小鼠有上、左、右3根尾靜脈，成品字型小鼠尾靜脈注射第61頁/共116頁第62頁/共116頁大鼠陰莖靜脈注射大鼠舌下靜脈注射大鼠淺背側跖靜脈注射第63頁/共116頁3、豚鼠：淺背側跖靜脈、耳靜脈注射4、家兔：耳靜脈注射5、豬：耳緣靜脈6、猴：前肢橈靜脈、后肢隱靜脈注射第64頁/共116頁豬耳緣靜脈注射第65頁/共116頁7、貓、狗：前肢內側頭靜脈、后肢外側小隱靜脈注射第66頁/共116頁狗前肢內側頭靜脈第67頁/共116頁狗后肢外側小隱靜脈第68頁/共116頁猴的后肢皮下靜脈注射第69頁/共116頁（十四）腦腔注射：1、小鼠小指夾鼠尾，拇指和是指置小鼠頭兩側固定，中指和無名指壓住鼠身，在注射處消毒后，右手持注射器，以食指固定針芯，垂直刺入針頭深度約5～7mm。2、兔將兔用固定器固定好，剃去頭頂?shù)谋幻?，左手將頭皮繃緊，消毒后，右手持錐子，自頭頂正中稍偏一側部位，錐穿頭骨，即換以左手固定錐子，右手持注射器，使針頭沿錐尖刺入，慢慢拔出錐子，即刻將針頭刺入約10～20mm，即可推液。第70頁/共116頁（十五）關節(jié)腔注射：（十六）椎管內注射：注射入蛛網(wǎng)膜下腔（十七）淋巴囊內注射：蛙和蟾蜍第71頁/共116頁（十八）小腦延髓池注射：第72頁/共116頁幾種動物不同給藥途徑的常用注射量（毫升）注射途徑小鼠大鼠豚鼠兔狗腹腔0.2～1.01～32～55～105～15肌肉0.1～0.20.2～0.50.2～0.50.5～12～5靜脈0.2～0.51～21～53～105～15皮下0.1～0.50.5～10.5～21～33～10第73頁/共116頁九、采血方法（一）大、小鼠：1、眶靜脈叢（竇）：少量多次采大小鼠血。小鼠0.2～0.3ml，大鼠0.4～0.6ml2、摘眼球：用于一次大量采小鼠血，可得到4～5％體重的血量3、尾靜脈：用于少量多次采大小鼠血第74頁/共116頁第75頁/共116頁尾靜脈采血第76頁/共116頁4、剪頭：用于一次性大量采小鼠血，可得到0.5～1.0ml的血量5、大血管：包括頸動脈（靜脈），股動脈（靜脈），腋下動脈（靜脈），腹主動脈，此方法不常用于小鼠采血，而多用于大鼠一次性大量采血?？傻?ml左右血量。6、心臟采血：小鼠少用，可用于大鼠一次性（開胸）或多次采血（不開胸）。第77頁/共116頁心臟采血第78頁/共116頁（二）家兔：1、耳緣靜脈：中等血量的采集，可反復采血，每次5～10ml。2、耳中央動脈：可反復采血，每次10～15ml。第79頁/共116頁3、心臟采血：可用于一次性（開胸）或多次采血（不開胸）。一次性開胸采血可得到80～100ml血量4、頸動靜脈采血：用于一次性采血，需要手術，可得血量80～10ml。第80頁/共116頁（三）豚鼠：1、心臟采血：可用于一次性（開胸）或多次采血（不開胸）。一次性開胸采血可得到5～10ml血量。2、背跖靜脈采血：用于少量反復采血。3、耳緣剪口采血第81頁/共116頁（四）犬貓：和靜脈注射部位相同，前肢內側頭靜脈、后肢外側小隱靜脈。也可頸靜脈（動脈）或心臟采血。第82頁/共116頁（五）豬：前腔靜脈或耳大靜脈采血（六）羊：頸靜脈采血（七）猴：前肢頭靜脈、后肢皮下靜脈或耳緣靜脈等。（八）禽類：翼下靜脈第83頁/共116頁仔豬前腔靜脈采血

第84頁/共116頁采血注意事項（一）采血場所有充足的光線；室溫夏季最好保持在25～28℃，冬季，15～20℃為宜；（二）采血用具有采用部位一般需要進行消毒；（三）采血用的注射器和試管必須保持清潔干燥；（四）若需抗凝全血，在注射器或試管內需預先加入抗凝劑。（五）注意不同動物的采血量采血。第85頁/共116頁部位

動物種類ａ．尾靜脈大鼠、小鼠ｂ．耳靜脈兔、狗、貓、豬、山羊、綿羊ｃ．眼底靜脈叢兔、大鼠、小鼠

d．舌下靜脈兔

e．腹壁靜脈青蛙、蟾蜍

f．冠、腳蹼皮下靜脈雞、鴨、鵝１、取少量血第86頁/共116頁２、取中量血部位

動物種類ａ．后肢外側皮下小隱靜脈狗、猴、貓ｂ．前肢內側皮下頭靜脈狗、猴、貓ｃ．耳中央動脈兔ｄ．頸靜脈狗、貓、兔ｅ．心臟豚鼠、大鼠、小鼠ｆ．斷頭大鼠、小鼠ｇ．翼下靜脈雞、鴨、鴿、鵝ｈ．頸動脈雞、鴨、鴿、鵝第87頁/共116頁３、取大量血部位

動物種類ａ．股動脈、頸動脈狗、猴、貓、兔ｂ．心臟狗、猴、貓、兔ｃ．頸靜脈馬、牛、山羊、綿羊ｄ．摘眼球大鼠、小鼠第88頁/共116頁4、最大安全采血量與最小致死采血量動物種類最大安全采血量(ml)最小致死采血量(ml)小鼠0.20.3大鼠12豚鼠510兔1040狼狗100500獵狗50200猴1560第89頁/共116頁常用抗凝劑：1、肝素：抑制凝血酶活力，阻止血小板凝集。純品肝素1mg＝125U，10U~20U抗1ml血凝集，但通常應用2~3倍劑量。用法：可配成1%肝素溶液，用時取0.1ml于試管內，100℃烘干，每管可抗凝5~10ml血?；蛴?%肝素溶液濕潤采血注射器。肝素可改變蛋白質等電點，當用鹽析法分離蛋白作分類測定時，不可用肝素抗凝。第90頁/共116頁2、枸櫞酸鈉：使凝血必需的鈣離子失活。常用3~5%水溶液，堿性較強。3、草酸鹽合劑：草酸銨1.2g，草酸鉀0.8g，福爾馬林1.0ml，加蒸餾水至100ml。使凝血必需的鈣離子失活。每毫升血加草酸鹽合劑0.1ml。4、氟化鈉：每毫升血加6mg。第91頁/共116頁十、其他體液采集1、胸水、腹水采集：穿刺2、消化液采集：唾液，胃液，胰液，膽汁3、精液采集：中、大動物用假陰道，小動物穿刺附睪來采集精液。4、腦脊液采集：手術或小腦延髓池抽取5、骨髓采集：大動物活體穿刺，小動物處死后取股骨或胸骨骨髓。第92頁/共116頁6、尿液采集：代謝籠收集導尿管采集膀胱穿刺壓迫排尿第93頁/共116頁十一、麻醉方法（一）麻醉方法：1、全麻吸入麻醉，靜脈注射、腹腔注射。2、局麻浸潤麻醉。根據(jù)手術，按皮下、筋膜、肌肉、腹膜、骨膜等順序逐步深入注射到術野周圍。第94頁/共116頁第95頁/共116頁

（二）麻醉前準備：1、禁食8~12h，防止嘔吐，可飲水。2、根據(jù)實驗部位和種類，給動物脫毛。3、犬、豬、猴等大動物可在麻醉前給予一些藥物以減少動物緊張，減少支氣管分泌。第96頁/共116頁（1）阿托品：減少支氣管和唾液腺分泌，防止氣管阻塞。副作用：加快心率。用量：肌肉或皮下注射0.04mg/kg（2）安定：產生鎮(zhèn)靜作用，加強麻醉效果，使骨骼肌松弛。用量：2.5~5mg/kg（3）嗎啡：產生鎮(zhèn)靜作用。副作用：抑制呼吸中樞。用量：皮下注射1~2mg/kg，肌肉注射10~20mg/kg。第97頁/共116頁（三）麻醉藥物：1、全麻藥物（1）乙醚：強揮發(fā)性、易燃。乙醚是最常用的吸入麻醉劑，各種動物適用。機制：抑制中樞神經系統(tǒng)。特點：安全范圍大，肌肉完全松弛，對肝腎毒性小，麻醉誘導期和蘇醒期較長。副作用：局部刺激大，引起上呼吸道黏膜分泌增加，導致呼吸道阻塞，可用阿托品對抗解救。第98頁/共116頁第99頁/共116頁（2）巴比妥類：種類很多，有巴比妥鈉，戊巴比妥鈉，硫噴妥那，苯巴比妥鈉等。適用于各種動物。如實驗中大小鼠常用3％戊巴比妥鈉溶液腹腔注射進行麻醉。

特點：安全范圍廣，毒性小，麻醉潛伏期短，麻醉維持時間長?？筛骨换蜢o脈給藥。機理：阻斷神經沖動傳遞到大腦。副作用：過量使用可導致呼吸肌麻痹而死亡，同時抑制末梢循環(huán)，導致血壓降低，并影響基礎代謝，導致體溫降低。第100頁/共116頁（3）氯胺酮：常用其鹽酸鹽。特點：麻醉潛伏期短，麻醉維持期僅10~20min，麻醉淺，安全性高，可重復給藥。機制：阻斷大腦聯(lián)絡途徑。副作用：興奮心血管系統(tǒng)，使血壓升高，心率加快，偶爾引起嘔吐。（4）水合氯醛：作用特點和巴比妥類相似。但安全范圍小，麻醉劑量和中毒劑量接近，對皮膚和黏膜有較強刺激。第101頁/共116頁第102頁/共116頁第103頁/共116頁2、局麻藥物（1）普魯卡因：是無刺激性的局麻藥物。特點：麻醉速度快，注射后1~3分鐘就可產生麻醉?？梢跃S持30~45分鐘。對皮膚和黏膜穿透力很弱，需要注射給藥才能產生局麻效果。它可以使血管舒張，易被吸收入血液而失去效果。在其溶液中加入腎上腺素（每100ml加入0.1%腎上腺素0.2~0.5ml）可以使麻醉時間延長1~2小時。第104頁/共116頁（2）利多卡因：效力和穿透力比普魯卡因強。（3）的卡因：化學結構和普魯卡因類似，效力和穿透力比普魯卡因強。第105頁/共116頁

（四）實驗動物的急救

動物實驗過程中，可因麻醉藥過量、出血過多、分泌物或血塊堵塞氣管造成窒息以及某種藥物原因引起動物血壓、呼吸不規(guī)則等現(xiàn)象，此時應立即進行急救處理措施。急救處理措施首先要迅速排查原因，并中斷誘因（如止血、停藥、排除分泌物等），然后對癥實施急救措施。第106頁/共116頁1、呼吸、心跳（血壓）的改變動物實驗過程中，需密切觀察實驗動物的呼吸、心跳及血壓的變化，一者它們是實驗反應的數(shù)據(jù)指標，二者是實驗動物狀態(tài)的主要指征。尤其對呼吸的觀察，因為動物的死亡首先是呼吸的停止。（1）誘發(fā)原因

①麻醉給藥速度過快或過量：實施靜脈給藥麻醉，可因給藥速度過快或過量導致呼吸停止。因此，為防止麻醉劑過量，注射速度一定不要過快，嚴密觀察動物狀況，若需追加麻醉劑，一次不宜超過總量的1/5。第107頁/共116頁②氣道不暢或堵塞：常見于麻醉后，因為氣管分泌物增多或氣管切口的出血凝塊堵塞氣管，動物呼吸不規(guī)則、呼吸困難甚至引起的窒息。

③大失血：如