2022年醫(yī)學(xué)專題-土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)導(dǎo)學(xué)案

PAGEPAGE4土壤中分解尿素的細菌的分別與激素1、尿素[CO(NH2)2]——重要的農(nóng)業(yè)氮肥。只能被土壤中細菌分解為NH3才能被植物吸取利用。2、CO(NH2)2+H2O細菌脲酶CO2+2NH3一、爭辯思路（一）篩選菌株1、實例耐高溫DNA聚合酶的查找美國科學(xué)家布魯克（1966年）--在美國黃石公園的一個熱泉中發(fā)覺耐熱細菌。這說明查找菌株要到期相應(yīng)的中查找。2、試驗室中微生物的篩選原理人為供應(yīng)有利于目的菌株生長的條件(包括養(yǎng)分、溫度、pH等)，同時抑制或阻擋其他微生物生長。要分別一種微生物，必需依據(jù)該微生物的特點，包括養(yǎng)分、生理、生長條件等，接受選擇培育分別的方法，或抑制使大多數(shù)微生物不能生長，或造成有利于該菌生長的環(huán)境，經(jīng)過肯定時間培育后使該菌在群落中的數(shù)量上升，再通過平板稀釋等方法對它進行純培育分別。思考：1、該培育基的配方中，為微生物的生長供應(yīng)碳源和氮源的分別是什么物質(zhì)？碳源：葡萄糖、尿素氮源：思考：1、該培育基的配方中，為微生物的生長供應(yīng)碳源和氮源的分別是什么物質(zhì)？碳源：葡萄糖、尿素氮源：2、此配方能否篩選出產(chǎn)生脲酶的細菌？為什么？能。只有產(chǎn)生脲酶的細菌才能利用作為氮源而生存。KH2PO41.4gNaHPO42.1gMgSO4H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素1.0g瓊脂15.0g將上述物質(zhì)溶解后，用蒸餾水定容到1000mL。4、選擇培育基：允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻擋其他種類微生物生長的培育基。思考：1、思考：1、1個菌落1個活菌。2、統(tǒng)計的菌落數(shù)實際活的細菌數(shù)。3、用稀釋涂布平板法肯定要重復(fù)試驗，一般至少要涂布3個平板。4、重復(fù)試驗結(jié)果中小于30菌落的不用。1、活體計數(shù)法稀釋涂布平板法（1）操作方法：稀釋涂布平板→統(tǒng)計菌落數(shù)。（2）原理：1個菌落→1個活菌。（3）統(tǒng)計原則①、選30～300個菌落的平板統(tǒng)計。②、每個稀釋度取3個平板取其平均值。（4）統(tǒng)計結(jié)果：統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目，因此統(tǒng)計結(jié)果一般用表示。每克樣品中的菌株數(shù)=。C:某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)；V:所用稀釋液的體積；M:稀釋倍數(shù)。2、顯微鏡直接計數(shù)（三）設(shè)置對比1、設(shè)置對比的目的：排解試驗組中非測試因素對試驗結(jié)果的影響，提高試驗結(jié)果的可信度。2、對比試驗是指除了被測試的條件外，其他條件都相同的試驗。滿足該條件的稱為對比組，未滿足該條件的稱為試驗組。菌落計數(shù)配制土壤溶液菌落計數(shù)配制土壤溶液系列稀釋涂布平板與培育對比組：設(shè)置對比同等條件下，培育空白培育基。四、試驗設(shè)計（一）土壤取樣

1、土壤是自然?培育基其微生物數(shù)量、種類。2、土壤取樣：（1）取樣的位置：土壤中70～90％是細菌。在富含有機質(zhì)的土壤層的3～8cm處中分布著絕大多數(shù)的細菌。（2）取樣要求：鏟去表層土。（1）、測細菌數(shù)：一般用104、105、106稀釋液。（二）樣品稀釋（2）、測放線菌：一般用103、104、105稀釋液。原則：確保平板上的菌落數(shù)在之間。（3）、測真菌數(shù)：一般用102、103、104稀釋液。1、接種：用適當?shù)南♂屢鹤魍坎计桨?、培育：細菌：30～37℃，1～（三）微生物的培育與觀看放線菌:25～28℃,5～霉菌:25～28℃,3～3、觀看：a.每24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目。緣由：不同種類的微生物，往往需不同的培育溫度和培育時間，每隔24h統(tǒng)計1次菌落數(shù)目，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時記錄作為結(jié)果，這樣可以防止因培育時間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。b.以“穩(wěn)定菌落”為觀看對象。緣由：不同種類的細菌形成的菌落，在大小、外形、光澤度、顏色、硬度、透亮?????度等方面具有一度的特征，菌落特征可作為菌種鑒定的重要依據(jù)。（四）鑒定酚紅鑒別培育基：鑒定分解尿素的細菌。原理：脲酶催化尿素分解成氨→培育基堿性增加→酚紅變紅→結(jié)論：該細菌能分解尿素。留意：1、在肯定的培育條件下（相同的培育基、溫度及培育時間），同種微生物表現(xiàn)出相同而穩(wěn)定的菌落特征。2、關(guān)注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質(zhì)地等等，都是區(qū)分細菌的重要手段。五、試驗的具體操作（一）、無菌操作1、土壤取樣從肥沃、潮濕的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先預(yù)備好的信封中。取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。2、制備培育基：制備以尿素為唯一氮源的選擇培育基。注意①注意①、為了保證結(jié)果精確?????，一般選擇菌落數(shù)在30——300的平板上進行計數(shù)。②、為使結(jié)果接近真實值可將同一稀釋度加到三個或三個以上的平皿中，經(jīng)涂布，培育計算出菌落平均數(shù)。③、統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低。這是由于兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀看到的只是一個菌落。因此，統(tǒng)計結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是活菌數(shù)來表示。④、涂布平板法所選擇倒平板的稀釋度很重要，一般以三個稀釋度中的其次個稀釋度倒平板所消滅的平均菌落數(shù)在50個左右為最好。（1）、應(yīng)在火焰旁稱取土壤10g。將稱好的土樣倒入盛有90mL無菌水的錐形瓶中，塞好棉塞。（2）、在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁進行。（3）、分別不同的微生物接受不同的稀釋度，其緣由是不同微生物在土壤中含量不同，其目的是保證獲得菌落數(shù)在30～300之間、適于計數(shù)的平板。（4）、假如得到了2個或2個以上菌落數(shù)目在30——300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進行菌落的計數(shù)，假猶如一稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗不精確，需要重新試驗。（二）、做好標記1、試驗時要對培育皿作好標記。注明培育基類型、培育時間、稀釋度、培育物等。2、裝系列稀釋菌的試管在試管架上最好由低到高放置。（三）、制定方案六、結(jié)果分析與評價1.通過對比試驗，若培育物有雜菌污染，菌落數(shù)偏高；若培育物混入其他氮源，則菌落形態(tài)多樣，菌落數(shù)偏高，難以選擇出分解尿素的微生物。2.提示：選擇每個平板上長有30——300個菌落的稀釋倍計算每克樣品的菌數(shù)最合適。同一稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)的菌落數(shù)不能相差懸殊，如相差較大，表示試驗不精確。留意：測定飲水中大腸桿菌數(shù)量的方法是將肯定體積的水用細菌過濾器過濾后，將濾膜放到伊紅美藍鑒別性培育基上培育，大腸桿菌菌落呈現(xiàn)黑色，通過記述得出水樣中大腸桿菌的數(shù)量。例1：土壤中的細菌能分解尿素，是由于它們能合成一種()A．尿素酶B．脲酶C．蛋白酶D．肽酶例2：在培育基中加入尿素(惟一氮源)，以分別出能分解尿素的細菌，這種加入尿素的培育基在功能上屬于()A．選擇培育基B．固體培育基C．液體培育基D．半固體培育基例3：試驗測定鏈霉素對3種細菌的抗生素效應(yīng)，用3種細菌在事先預(yù)備好的瓊脂平板上畫3條等長的平行線(3條線均與圖中的鏈霉素帶接觸)，將平板置于37℃條件下恒溫培育3天，結(jié)果如圖所示。從試驗結(jié)果分析，以下敘述不A．鏈霉素能阻擋結(jié)核菌的生長B．鏈霉素對結(jié)核菌比對霍亂菌更有效C．鏈霉素對結(jié)核菌比對傷寒菌更有效D．鏈霉素可以用于治療傷寒病人例4：測定土壤中細菌數(shù)量一般選用104、105和106倍的稀釋液進行平板培育，而測定真菌的數(shù)量一般選用102、103和104倍稀釋，其緣由是()A．細菌個體小，真菌個體大B．細菌易稀釋，真菌不易稀釋C．細菌在土壤中數(shù)量比真菌多D．隨機的，沒有緣由例5：用來推斷選擇培育基是否起到了選擇作用需要設(shè)置的對比是()A．未接種的選擇培育基B．未接種的牛肉膏蛋白胨培育基C．接種了的牛肉膏蛋白胨培育基D．接種了的選擇培育基例6：通常用來作為菌種鑒定的重要依據(jù)是()A．菌落B．細菌形態(tài)C．細菌體積D．細菌結(jié)構(gòu)例7：下列能選擇出分解尿素的細菌的培育基是()A．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、尿素、瓊脂、水B．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、瓊脂、水C．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、尿素、瓊脂、水D．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、水例8：在涂布平板操作時錯誤的是()A．將涂布器在酒精燈火焰上灼燒，直到燒紅B．取少量菌液滴加在培育基表面C．將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃待酒精燃盡后，冷卻8s～10s再用D．涂布時可轉(zhuǎn)動培育皿，使涂布均勻例9：在以尿素為唯一氮源的培育基中加入酚紅指示劑，培育能分解尿素的細菌后，指示劑的顏色是()A．藍色B．紅色C．黑色D．棕色例10：在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長，同時又能抑制或者阻擋其他種類微生物生長的培育基稱做()A．鑒別培育基B．加富培育基C．選擇培育基D．基礎(chǔ)培育基例11：分別土壤中分解尿素的細菌，對培育基的要求是()①加尿素②不加尿素③加瓊脂④不加瓊脂⑤加葡萄糖⑥不加葡萄糖⑦加硝酸鹽⑧不加硝酸鹽A．①③⑤⑦B．②④⑥⑧C．①③⑤⑧D．①④⑥⑦例12：在查找目的菌株時，要依據(jù)它對生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去查找，下列不屬于厭氧細菌生存環(huán)境的是()A．土壤深層B．人或動物體內(nèi)寄生C．真空D．池塘淤泥例13：下列是關(guān)于檢測土壤中細菌總數(shù)試驗操作的敘述，其中錯誤的是()A．用蒸餾水配制牛肉膏蛋白胨培育基，經(jīng)高溫、高壓滅菌后倒平板B．取104、105、106倍的土壤稀釋液和無菌水各0.1mL，分別涂布于各組平板上C．將試驗組和對比組平板倒置，37℃D．確定對比組無菌后，選擇菌落數(shù)在300以上的試驗組平板進行計數(shù)例14：可以鑒定出分解尿素的細菌的方法是()A．以尿素為惟一氮源的培育基中加入二苯胺試劑B．以尿素為惟一氮源的培育基中加入酚紅指示劑C．以尿素為惟一氮源的培育基中加入蘇丹Ⅲ試劑D．以尿素為惟一氮源的培育基中加入雙縮脲試劑例15：在做土壤中分解尿素的細菌的分別與計數(shù)試驗時，甲組試驗用氮源只含尿素的培育基，乙組試驗用氮源除尿素外還含硝酸鹽的培育基，其他成分都相同，在相同條件下操作，培育與觀看，則乙組試驗