酶聯(lián)免疫分析技術(shù)課件

2013-8-131酶聯(lián)免疫分析技術(shù)——ELISA檢測免疫檢驗利用免疫檢測原理檢測與免疫相關(guān)的物質(zhì)（抗原、抗體、補體、細(xì)胞因子等）

免疫檢驗技術(shù)

1.酶聯(lián)免疫分析技術(shù)

2.放射免疫分析技術(shù) 3.熒光免疫分析技術(shù) 4.化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù) 5.金標(biāo)免疫分析技術(shù) 6.免疫印跡技術(shù) 7.免疫電泳技術(shù)等酶聯(lián)免疫吸附試驗

(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)利用免疫檢測原理檢測體液中的微量 物質(zhì)（激素、酶、血漿中的微量蛋白、 藥物濃度等） 這些檢測結(jié)果為臨床上確定診斷， 分析病情，調(diào)整治療方案和判斷預(yù)后 提供有效的實驗依據(jù)。酶聯(lián)免疫分析技術(shù)

是以酶標(biāo)記抗原/抗體為主要試劑的 一種標(biāo)記免疫分析技術(shù)，利用酶催化 底物反應(yīng)的生物放大作用，提高特異 性抗原抗體免疫學(xué)反應(yīng)檢測的敏感性.歷史

1971年瑞典學(xué)者Engvail和Perlmann,荷蘭學(xué)者VanWeerman和Schuurs分別報道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測體液中微量物質(zhì)的固相免疫測定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)。AbAg和Ab分離，然后測定AbAg或Ab的量，2013-8-13酶聯(lián)免疫吸附實驗的原理

以待測抗原（或抗體）與酶標(biāo)抗體（或抗原）的特異結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過酶活力測定來確定抗原（或抗體）含量。 因為結(jié)合了免疫反應(yīng)和酶催化反應(yīng)，所以是一種特異而又敏感的技術(shù)。酶免疫技術(shù)Ab*+AgAb*Ag+Ab*

異相法：

****從而推算出Ag量。Ag*過量Ab*Ab

A g*Ab

均相法：Ab*Ag中的標(biāo)記物*失去特性，直接測定游離 Ab*的量，從而推算出Ag量。Ag*過量Ab*Ab

A g*Ab1特異性

抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點之間?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型互補關(guān)系，具有高度的特異性。 測定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。

22最適比例2013-8-133敏感性化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml水平酶反應(yīng)測定法的敏感度約為5-10μg/ml免疫測定中凝膠擴散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿標(biāo)記的免疫敏感度可提高數(shù)千倍，達(dá)ng/ml水平例如，HBsAg，其敏感度可達(dá)0.1ng/ml。特點靈敏度高特異性強準(zhǔn)確性好試劑穩(wěn)定方法簡便

酶聯(lián)免疫吸附實驗方法類型：

酶聯(lián)免疫吸附實驗的

分類雙抗體夾心法（三明志法）原理固相支持物表面

3包被抗體標(biāo)記抗體待測物底物一步法ELISA反應(yīng)會出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)1.雙抗體夾心法（主要用于測抗原）2.間接法（主要用于測抗體）3.競爭法（主要用于測小分子抗原/半抗原和抗體）4.捕獲法（主要用于測血清中某抗體的亞型）

鉤狀效應(yīng)（hookeffect）

一般情況下的雙抗 體夾心法ELISA反應(yīng)

抗原過量時酶底物顯色反應(yīng)測定波長辣根過氧化物酶鄰苯二胺四甲替聯(lián)苯胺氨基水楊酸鄰聯(lián)苯甲胺2,2‘-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽橘紅色黃色棕色蘭色藍(lán)綠色492460449425642堿性磷酸酯酶4-硝基酚磷酸鹽(PNP)萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽黃色紅色400500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭黃色深藍(lán)色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)硝基酚半乳糖苷(ONPG)熒光黃色360,4504202013-8-13酶及底物HRP的底物DH2+H2O2D+2H2O

上式中，DH2為供氧體，H2O2為受氫體。DH2一般為無色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物。DH2如：鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和ABTS。

OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后 ，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方 便，是HRP結(jié)合物最常用的底物。ETMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應(yīng)用液。酶反應(yīng)終止后，TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色計中定量，最適吸收波長為450nm。ABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。HRP對氫受體的專一性很高，僅作用于H2O2、小分醇的過氧化物和尿素過氧化物(ureaperoxide)。

洗滌液

常用的HRP反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按加量及比色常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸鹽緩沖液。 液的最終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。

5AP的底物為磷酸酯酶，一般采用對硝基苯磷酸酯作為底物。產(chǎn)物為黃色的對硝基酚，在405nm波長處有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一時間。AP也有發(fā)熒光底物（磷酸4-甲基傘酮），可用于ELISA作熒光測定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。

酶反應(yīng)終止液2013-8-13

對照設(shè)定

陽性對照品(positivecontrol)和陰性對照品(negativecontrol)是檢驗試驗有效性的控制品，同時也作為判斷結(jié)果的對照。陽性對照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測標(biāo)本的組成相一致，多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)。加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱；在測定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較，可以估計標(biāo)本物質(zhì)的量。陰性對照品須先行檢測確定不含待測物質(zhì)。例如HBsAg檢測

參考標(biāo)準(zhǔn)品

定量測定（如甲胎蛋白質(zhì)，癌胚抗原測定等）應(yīng)含有制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用的參考標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)包括覆蓋可檢測范圍的4-5個濃度，一般均配入含蛋白保護(hù)劑及防腐劑的緩沖液中.酶免疫測定操作中的注意事項的陰性對照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是陰性。

酶免疫測定操作中的注意事項試劑準(zhǔn)備加樣溫育洗板顯色比色結(jié)果判斷結(jié)果報告及解釋

標(biāo)本的采取和保存標(biāo)本為血漿和血清均可，血清標(biāo)本應(yīng)注意避免溶血，紅細(xì)胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為標(biāo)記的ELISA測定中，溶血標(biāo)本可能會增加非特異性顯色，出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。血清標(biāo)本宜在新鮮時檢測。 如有細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。 如在冰箱中保存過久，其中的可發(fā)生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深。5天內(nèi)測定的血清標(biāo)本可放置于4℃，超過一周測定的需低溫冰存。 反復(fù)凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。

6試劑的準(zhǔn)備

從冰箱中取出的試驗用試劑應(yīng)待溫度 與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗不 需用的部分應(yīng)及時放回冰箱保存。同時應(yīng) 將相應(yīng)的質(zhì)控取出待溫度達(dá)到與室溫平衡。 注意：檢驗人員應(yīng)經(jīng)常核對試劑說明 書的具體內(nèi)容，能夠及時發(fā)現(xiàn)實驗操作程 序的更改和標(biāo)準(zhǔn)曲線指控定值的更新。 所用蒸餾水或去離子水應(yīng)保證質(zhì)量。2013-8-137

保溫

ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結(jié)合只在固 相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔 中的標(biāo)本和酶標(biāo)記抗體，其中的抗原并不是都有均等 的和固相抗結(jié)合的機會，只有最貼近孔壁的一層溶液 中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程， 因此需經(jīng)擴散才能達(dá)到反應(yīng)的終點。這就是為什么 ELISA反應(yīng)總是需要一定時間的溫育。溫育溫育所需時間與溫度成反比，即溫育溫度高，則所需時間相對較短?！斑吘壭?yīng)”的排除:使用水浴或在將反應(yīng)溶液加入至板孔中時，將板和溶液均加熱至溫育溫度（如37℃），就可以很容易地排除“邊緣效應(yīng)”，并且可提高測定的重復(fù)性。

保溫

溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃ （冰箱溫度）等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度， 也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。 保溫的方式一般均采用水浴，可將ELISA板置于 水浴箱中，ELISA板底應(yīng)貼著水面，使溫度迅速平衡。 為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋。另外保溫的方式還有 ELISA儀器附有特制的電熱塊 反應(yīng)板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅 速平衡。 室溫溫育的反應(yīng)，操作時的室溫應(yīng)嚴(yán)格限制在 規(guī)定的范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指20-25℃，應(yīng)注意 溫育的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。為保證這一點， 一個人操作時，一次不宜多于兩塊板同時測定。

加樣ELISA中一般有3次加樣步聚：即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。加標(biāo)本一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中。每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸頭，以免發(fā)生交叉污染。然后在微型震蕩器上震蕩1分鐘以保證充分混和。加酶結(jié)合物應(yīng)用液和底物應(yīng)用液時可用定量多道加液器，使加液過程迅速完成。從滴瓶中滴加試劑，除了要注意滴加角度外，滴加速度也很重要，滴加太快，很容易出現(xiàn)重復(fù)滴加或加在兩孔之間的現(xiàn)象，這樣就會在孔內(nèi)的非包被區(qū)出現(xiàn)非特異吸附，從而引起非特異顯色。洗滌洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應(yīng)步驟，但卻也決定著實驗的成敗。ELSIA洗滌：達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的干擾物質(zhì)?？梢哉f在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)。洗滌的方式：自動洗滌儀手工操作全自動加樣系統(tǒng)的標(biāo)本“交叉污染”問題

洗板每次溫育后洗板是否徹底，與非特異背景顯色有很大關(guān)系。洗板液一般為含0.05%Tween20的中性PBS。Tween20為一種非離子去垢劑，既含親水基團，也含疏水基團。洗滌作用機理，借助其疏水基團與固相上蛋白的疏水基團形成疏水鍵，從而削弱蛋白與固相的吸附，同時在其親水基團與液相中水分子的結(jié)合作用下，促使蛋白質(zhì)脫離固相而進(jìn)入液相洗板液中Tween20濃度高于0.2%，可使包被于固相上的抗原或抗體解吸附而影響試驗測定下限。9

2013-8-13

質(zhì)量控制（QuailityControl,Q.C）結(jié)果判斷：按試劑盒所定的CUT-OFF值判斷陰或陽性結(jié)果，不能以其它標(biāo)準(zhǔn)判斷。Cut-off值的確立應(yīng)盡可能地避免假陽性或假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，即敏感性和特異性相加的值達(dá)到最大。結(jié)果報告：陰性或陽性?；覅^(qū)內(nèi)的結(jié)果建議患者過一段時間復(fù)查。

室內(nèi)質(zhì)量控制

質(zhì)控品濃度的選擇

S/CO2-3 或同時選擇S/CO處于1.5左右的質(zhì)控血清以 判斷每次測定時試劑盒測定下限的有效性。 CUTOFF值計算

S/CO值計算

繪制質(zhì)控圖

質(zhì)控圖-定性

質(zhì)控血清分定值和未定值兩種。如只用一份質(zhì)控 血清定值，一般定在正常值與異常值交界點上，定性 測定時處于弱陽性水平，稱為臨界值。乙肝標(biāo)志物臨 界值的制定，應(yīng)按臨床要求，為臨床提供統(tǒng)一的判斷 弱陽性的標(biāo)準(zhǔn)。 臨界值質(zhì)控血清可以作為試劑盒中的陽性對照品 和陰性對照品以外的第三個對照品，它可以靈敏地反 映出試劑盒的檢出水平，確保弱陽性反應(yīng)的標(biāo)本不 漏檢。

質(zhì)控圖-定量失控的處理及糾正2013-8-1310ELISA法檢測失控糾正措施+2-2s,+1-3s分析失控原因（質(zhì)控品、試劑、檢測環(huán)節(jié)） 復(fù)檢所有陽性樣本-2-2s,-1-3s分析失控原因（質(zhì)控品、試劑、檢測環(huán)節(jié)）復(fù)檢所有陰性樣本標(biāo)本因素試劑因素操作因素ELISA測定影響因素標(biāo)本因素內(nèi)源性干擾因素：類風(fēng)濕因子、補體、異嗜性抗體、治療性抗體、自身抗體、溶菌酶、磷脂、藥物小分子、總蛋白濃度等外源性干擾因素：溶血、細(xì)菌污染、標(biāo)本貯存時間過長、凝固不全、反復(fù)凍融內(nèi)源性干擾因素1.類風(fēng)濕因子：人血清中IgM、IgA型類風(fēng)濕因子（rheu-matoidfactor,RF）可以與ELISA系統(tǒng)中的捕獲抗體及酶標(biāo)志二抗體的Fc段直接結(jié)合，從而導(dǎo)致假陽性。2.補體：ELISA系統(tǒng)中一抗和標(biāo)記二抗過程中，抗體分子發(fā)生變構(gòu)，其Fc段的CIq分子結(jié)合點被暴露出來，使Ciq可以將二者連接起來，從而造成假陽性。解決的辦法是：（1）用1.5％乙二胺四乙酸二鉀鹽（EDTA）稀釋標(biāo)本；（2）用530C10min加熱血清使Ciq滅活。3.嗜異性抗體：人類血清中含天然嗜異性抗體，該抗體將ELISA系統(tǒng)中一抗和標(biāo)記二抗二者連接起來，也可導(dǎo)致假陽性。4.嗜靶抗原的自身抗體：抗甲狀腺球旦白、抗胰導(dǎo)素抗體等嗜靶抗原的自身抗體，有時能與靶抗原結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物，在ELISA測定方法中均可干擾抗原-抗體測定結(jié)果。

內(nèi)源性干擾因素5.醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠Ig(s)抗體：臨床開展的用醫(yī)源性CD3等單克隆抗體，用放射性同位素標(biāo)記鼠源性抗體的影像診斷及靶向治療等技術(shù)，均可使這些患者產(chǎn)生抗體這些患者在ELISA測定時均可產(chǎn)生假陽性。6.病毒變異：病毒變異所致的假陰性主要表現(xiàn)在HB-sAg的檢測，HBV的S基因負(fù)責(zé)編碼表達(dá)表面抗原，即S旦白，任何影響S旦白表達(dá)水平或抗原性的突變，都可能導(dǎo)致表面抗原檢測出陰性結(jié)果。7.標(biāo)本中其它成分的影響：血清脂質(zhì)過高、膽紅素、血紅蛋白及血液黏度過大等，均對ELISA結(jié)果有干擾作用。

外源性干擾因素1.標(biāo)本溶血：由于各種人為因素引起的標(biāo)本溶血，均可因紅細(xì)胞破壞時釋放 大量過氧化物酶活性的血紅蛋白，在以辣根過氧化酶為標(biāo)記的ELISA測定 方法中，會導(dǎo)致非特異性顯色，而干擾測定結(jié)果。2.標(biāo)本受細(xì)菌污染：因菌體中可能含有內(nèi)源性辣根過氧化酶，因此，被細(xì)菌 污染的標(biāo)本同溶血標(biāo)本一樣，亦可產(chǎn)生非特異性顯色，而干擾測定結(jié)果。

血清標(biāo)本如是以無菌操作分離，則可以在2～8℃下保存一周，如為有菌 操作，則建議冰凍保存。樣本的長時間保存，應(yīng)在－70℃以下3.標(biāo)本保存不當(dāng)：在冰箱中保存過久的標(biāo)本，血清IgG可聚合成多聚體，在 間接法ELISA測定中會導(dǎo)致本底過深，甚至造成假陽性；標(biāo)本放置時間過 長，有時抗原或抗體免疫活性減弱，亦可出現(xiàn)假陰性。為克服上述干擾， ELISA標(biāo)本宜為新鮮采集，如不能測定，5天內(nèi)測定的可放40C冰箱，1 周后測定的應(yīng)放低溫保存，凍存后溶解的標(biāo)本，蛋白局部濃縮，分布不均， 應(yīng)充分混均后再測定，但混均時應(yīng)輕柔，不可劇烈振蕩。2013-8-1311外源性干擾因素4.血液采集后，如收集管中無促凝劑和抗凝劑，則血液通常 在半小時后開始凝固，18~24h完全凝固。日常檢驗中，常 在血液還未開始凝固時即離心分離血清，此時因血液沒有 完全凝固，離出的“血清”并非為完全的血清，其中仍殘 留部分纖維蛋白原，如將其加入微