靶向測序覆蓋度優(yōu)化

為了最大程度地提高靶向重測序的研究效率，并確保高度敏感突變檢測獲得足夠的覆蓋度，應(yīng)考慮三個關(guān)鍵因素：1、目標區(qū)域的總長度；2、富集效率（readspassingfilte百分比及mapping百分比）；3、目標區(qū)域覆蓋深度范圍；靶向測序覆蓋度優(yōu)化將測序覆蓋率定義為與已知參考堿基比對的平均讀取數(shù)即：numberofreadsxreadlength/targetsize目標區(qū)域的總長度靶向區(qū)域的總長度等于富集分析中靶向的基因組序列的總長度（bp）。例：TruSeqExomeEnrichmentKit靶向測序總長度：62Mb（（包含：5'UTR,codingexons,3'UTR,microRNAs，microRNAtargets,andotherselectedandconservedregionsofinterest）95mer探針捕獲300–400bp文庫（插入片段180–280bp），文庫大小350bp靶區(qū)域150bp插入片段230bp60bpadapters60bpadapters95mer探針65的readsmap到靶區(qū)域當350bp的DNA文庫（插入片段=230bp）被生物素化TruSeq探針富集，每個探針都會拉下整個文庫

每個95mer探針均靶向目標區(qū)域，保守的假定探針需要與插入片段（230bp)的95個堿基全部雜交，插入片段最左側(cè)位置為探針最右側(cè)位置上游的230bp處，插入片段最右側(cè)位置為探針最左側(cè)位置下游230bp處。則：Pulldown=2*Insert–Probe=2*230–95=365bp。根據(jù)經(jīng)驗證據(jù)表明80mer的探針內(nèi)最多可容許15個錯配，意味著探針拉下的區(qū)域可能會更大，上述為保守估計。虛線表示富集片段的覆蓋深度，超過65的過濾Reads被映射到參考基因組上將overlap靶區(qū)域，超過80的過濾Reads被映射到靶區(qū)域中的150個堿基上。探針拉下的365bp的序列對稱地集中在探針的中點上。每個95mer探針通過平衡GC組成和特異性來針對TruSeq外顯子組靶標設(shè)計。紅色方塊顯示了一個轉(zhuǎn)錄本的子集。藍色細線表明每個探針間的最佳間隔距離。熱圖反應(yīng)了測序深度。最大的外顯子區(qū)域被22個探針均勻覆蓋，覆蓋深度為50×~150×。富集效率靶向區(qū)域的總長度等于富集分析中靶向的基因組序列的總長度（bp）。對6個樣本進行TruSeq外顯子組富集實驗，僅考慮mapping到62Mb的靶向區(qū)域，可獲得約70％的富集效率。由于TruSeq富集技術(shù)的特性，實際被測區(qū)域的上游和下游的加墊區(qū)域也被捕獲。當reads擴展到目標區(qū)域+/-150bp(117.5Mb)時，觀察到富集效率從>65%(藍色條)增加到>80%(紫色條)。因此，研究人員可以用最少的探針來獲取最大數(shù)量的DNA，同時也可以獲取任何給定目標附近的序列，從而獲取可能難以通過競爭技術(shù)（competingtechnologies）獲取的區(qū)域的生物信息。

靶區(qū)域的覆蓋深度簡單地計算平均測序覆蓋率將只提供富集樣本靶區(qū)域一個摘要平均讀深度。應(yīng)報告特定測序深度下覆蓋目標堿基的給定百分比(例如，10×讀深度下覆蓋90%的目標堿基)?？梢酝ㄟ^對樣本進行過度測序以增加總測序覆蓋率，但是，這是一種非常低效的方法。ADCBCreationofaTruSeqNormalizedMeanDistributionPlotTruSeqExome覆蓋圖歸一化腳本/計算所需的測序數(shù)據(jù)量通過如下步驟，可以確定為一定比例的堿基獲得指定覆蓋度所需的測序量90。Step1

如前TruSeqExome90的堿基預(yù)期10X則需要：Step2RequiredamountofPFmappedsequence：

如TheTruSeqExomeEnrichmentKit：需要4.8Gb的測序數(shù)據(jù)才能獲得90％的目標堿基的10X覆蓋率。Totaltargetedbases=62MbMean