果酒釀造實驗報告

-.z.果酒酵母的別離純化和選育一、實驗?zāi)康暮蛢?nèi)容1.學(xué)習(xí)掌握果酒酵母別離純化的方法；2.對別離純化得到的酵母菌進展篩選使其適合果酒釀造。二、實驗原理釀酒酵母細胞透明，呈圓形或橢圓形，形體比擬大，一般為7×12μm，含有轉(zhuǎn)化酶能將葡萄汁中的糖轉(zhuǎn)化成乙醇、二氧化碳和其它代謝產(chǎn)物。優(yōu)良純種酵母應(yīng)具備以下性能：〔1〕除釀酒水果本身的果香外，酵母也應(yīng)產(chǎn)生良好的果香與酒香?！?〕生長速度快，有較高的發(fā)酵能力，能將糖分全部發(fā)酵完?！?〕具有較高的抗S02能力，有較好的凝集力和較快的沉降速度?！?〕培養(yǎng)基成分簡單，來源廣泛，價格低廉，對溫度，pH，離子強度，溶氧等環(huán)境因素不敏感。〔5〕能在低溫或果酒適宜溫度下發(fā)酵，以保持果香和新鮮清爽的口味。三、實驗儀器與材料樣品：新鮮水果榨汁。YEPD培養(yǎng)基〔富集培養(yǎng)基〕:蛋白胨20g，葡萄糖20g，酵母膏10g，蒸餾水定容至1000ml.PDA培養(yǎng)基〔釀酒酵母培養(yǎng)基〕：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，蒸餾水定容至1000ml.〔馬鈴薯去皮，切成塊煮沸后再煮30分鐘，然后用紗布過濾，再加糖及瓊脂溶化后定容至1000ml。121℃滅菌30分鐘?！砅YG培養(yǎng)基〔菌種保藏培養(yǎng)基〕：蛋白胨3.5g，葡萄糖15g，酵母膏1.5g，KH2PO42.0g，MgSO4·7H2O1.0g，〔NH4〕2SO41.0g，瓊脂20g，蒸餾水定容至1000ml.試劑：亞硫酸鈉、乙醇，碘液，無菌生理鹽水等。發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖200克，磷酸氫二鉀1克，酵母膏10克，硫酸銨1克，七水硫酸鎂1克。器具：三角燒瓶(250mL)、無菌試管、無菌吸管(1mL及5mL)、無菌滴管、接種環(huán)、冰箱、酒精噴燈、冰箱、玻璃涂棒，血細胞計數(shù)板，顯微鏡，磁力攪拌器，臺式離心機，震蕩混合器等。4、實驗方法〔1〕獲得菌種配制YEPD培養(yǎng)基分裝于100ml三角瓶內(nèi)每瓶50ml高溫滅菌冷卻，然后分別取適量樣品好的蘋果、腐果果皮假設(shè)干，將腐果，好果局部皮裝入將富集培養(yǎng)液，各三份接種，120r/min，28℃搖床培養(yǎng)4天。用接種環(huán)劃線接種在PDA培養(yǎng)基上，每個樣品接三個平板，28℃恒溫培養(yǎng)。待菌種長出小菌落，鏡檢為酵母菌后，將其挑取于PDA平板劃線并標(biāo)號后28℃恒溫培養(yǎng)。待再次長出單菌落后，挑取劃線于PDA培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)。菌種劃線三到四次后根本純化。2．酵母菌種的復(fù)篩選擇果酒生產(chǎn)中生產(chǎn)性能優(yōu)良的新鮮果汁液作為復(fù)篩培養(yǎng)基。將初選菌種接入保藏培養(yǎng)基。培養(yǎng)24h后每支斜面接入三角瓶培養(yǎng)，置于23-25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，測定其發(fā)酵水平及產(chǎn)香水平，選育出優(yōu)良強健、耐性強的適合果酒發(fā)酵的酵母菌種。發(fā)酵力試驗：采用CO2失重法，取100mL三角瓶(已經(jīng)烘干、稱重)，各參加80mL果汁，置于80℃的水浴殺菌5min，冷卻到30℃后，按每升接種30mL的比例分別接入酵母種子液，在20℃下發(fā)酵。發(fā)酵過程中每24h測定1次CO2損失量，每次測定時，搖晃瓶子，以排出CO2。隨著發(fā)酵時間的延續(xù)，瓶重逐漸減輕，直到減輕量不高于0.2g，即表示發(fā)酵完畢，以CO2失重量為縱坐標(biāo)，發(fā)酵時間為橫坐標(biāo)，繪制發(fā)酵力曲線，并確定菌株發(fā)酵力的強弱。3．酵母菌的耐受性試驗采用杜氏管發(fā)酵法測定所篩選的酵母菌對乙醇〔8%、10%、12%、14%、16%、18%、20%〕、二氧化硫〔60、80、100、120、140、160、180、200mg/L〕的耐性。將酵母菌分別接入含不同濃度的乙醇和不同濃度SO2的果汁培養(yǎng)基中，在一樣條件下培養(yǎng)，觀察杜氏管中氣泡產(chǎn)生情況，重復(fù)3次。活化條件：28℃條件下，將純種別離的菌種接種在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)48h發(fā)酵條件：28℃條件下，水果原汁培養(yǎng)基中靜止發(fā)酵4d；接種量：1×107cfu/mL?！?〕耐酒精度試驗采用先分別量取無水酒精8、10、12、14、16ml，再以水果原汁為培養(yǎng)基，制成含酒精量為10%、12%、14%、16%、18%系列的液體培養(yǎng)基。按下表在試管中參加果汁。然后參加杜氏小管倒置使其充滿果汁，塞好棉塞，115℃20min滅菌。滅菌完后，待試管溫度為常溫后按下表參加酒精，加完后搖勻。最后在每個編號試管中接入對數(shù)期酵母1×107個，28℃靜止培養(yǎng)。觀察產(chǎn)氣情況，選出耐酒度比擬好的菌種。將標(biāo)簽貼于各試管上，標(biāo)10、12、14、16、18，按下表每管參加果汁量：試管編號010121416182095%酒精/mL01.051.261.41.681.902.15果汁/mL108.958.748.608.328.107.85培養(yǎng)液含酒精%〔v/v〕0101214161820耐SO2試驗按亞硫酸含量為6%計，計算出60、100、120、180、240mg/L濃度所需的量，分別參加到果汁中制成SO2不同濃度系列的液體培養(yǎng)基。按下表參加果汁，然后參加杜氏小管倒置使其充滿果汁，塞好棉塞，115℃20min滅菌。滅菌完后，待試管溫度常溫后按上表加亞硫酸〔科密歐試劑SO2含量≥6%〕，加完后搖勻。最后在每發(fā)酵管中接入對數(shù)期酵母1×107個，28℃靜止培養(yǎng)。觀察產(chǎn)氣情況，選出耐SO2比擬好的菌種。將標(biāo)簽貼于各試管上，標(biāo)1、2、3、4、5，按下表每管參加果汁量：試管編號012345亞硫酸/uL01017203040果汁/mL101010101010培養(yǎng)液含SO2mg/L060100120180240發(fā)酵3-4天，觀察記錄發(fā)泡狀況，用加號表示發(fā)泡多少，選擇耐二氧化硫和酒精度都較高的菌株做保藏，供以后利用。5、技術(shù)指標(biāo)隨著菌種的發(fā)酵，質(zhì)量會降低，降低的越快，發(fā)酵速率越高根據(jù)它質(zhì)量隨時間的變化曲線可以了解它發(fā)酵速度的快慢酒精，二氧化硫?qū)N有抑制作用，表現(xiàn)為發(fā)泡少，綜合比擬兩種對發(fā)酵的抑制作用大小，選擇耐受性較高的菌株做保藏。6、分析實驗數(shù)據(jù)，討論結(jié)果。果酒酵母的發(fā)酵1、實驗?zāi)康?、意義1．掌握果酒釀造的原理并對篩選果酒酵母菌種進展發(fā)酵性能測定〔起酵時間、產(chǎn)酒精度、耐受性能〕。2．用實驗十三所篩選果酒酵母進展小型釀酒實驗，掌握果酒釀造一般工藝流程，并對自釀果酒進展感官品評和理化分析檢測〔糖度、酸度、酒精度〕。2、實驗原理果酒發(fā)酵：果漿或果汁中的葡萄糖和果糖在酵母菌的作用下，最后生成酒精和二氧化碳?？捎靡韵路错懯絹碚f明：果酒發(fā)酵是一個極其復(fù)雜的生物化學(xué)現(xiàn)象。在每一步反響過程中都有酶的參與，除了最后生成酒精、二氧化碳和少量的甘油、高級醇類、醛類物質(zhì)之外，還會生成二磷酸己糖、磷酸甘油醛、丙酮酸、乙醛等許多中間產(chǎn)物。果酒的發(fā)酵分主發(fā)酵和后發(fā)酵兩個階段，主發(fā)酵是將發(fā)酵液的糖分變成酒精，后發(fā)酵是繼續(xù)分解殘?zhí)菫榫凭?，加速酒的轉(zhuǎn)化，使酒更加穩(wěn)定。用人工培養(yǎng)的酵母發(fā)酵的稱為人工發(fā)酵，利用天然酵母發(fā)酵的稱為自然發(fā)酵。按照工藝的不同又可分為渣汁混合發(fā)酵和渣汁別離發(fā)酵兩種形式。3、實驗材料樣品：新鮮水果及壓榨汁。試劑：亞硫酸鈉、乙醇、無菌水、化學(xué)純液體石蠟、五氧化二磷、脫脂奶粉、10%HCl、干冰、95%乙醇、食鹽、無水氯化鈣、河沙、瘦黃土(有機物含量少的黃土)或者紅土；器皿：三角燒瓶(250mL)、無菌試管、無菌吸管(1mL及5mL)、無菌滴管、接種環(huán)、40目及100目篩子、枯燥器、安瓿管、冰箱、冷凍真空枯燥裝置、酒精噴燈、濾紙條〔0.5×1.2cm〕冰箱，低溫冰箱〔-30℃〕，液氮冷凍保藏器，玻璃涂棒，血細胞計數(shù)板，顯微鏡，紫外線等〔15W〕，磁力攪拌器，臺式離心機，震蕩混合器等。4、實驗方法〔1〕果酒釀造的工藝流程鮮果→分選→破碎、除?！麧{→別離取汁→澄清→清汁→發(fā)酵→倒桶→貯酒→過濾→冷處理→調(diào)配→過濾→成品〔2〕工藝簡述1〕發(fā)酵前的處理前處理包括水果的選別、破碎、壓榨、果汁的澄清，果汁的改進等。①破碎、除梗：破碎要求每粒種子破裂，但不能將種子和果梗破碎，否則種子內(nèi)的油酯、糖苷類物質(zhì)及果梗內(nèi)的一些物質(zhì)會增加酒的苦味。破碎后的果漿立即將果漿與果梗別離，防止果梗中的青草味和苦澀物質(zhì)溶出。②二氧化硫處理：二氧化硫在果酒中的作用有殺菌、澄清、抗氧化、增酸、使色素和單寧物質(zhì)溶出、復(fù)原作用、使酒的風(fēng)味變好等。使用二氧化硫有氣體二氧化硫及亞硫酸鹽，前者可用管道直接通入，后者則需溶于水后參加。發(fā)酵基質(zhì)中二氧化硫濃度為60-100mg/L?！惨云咸丫茷槔憾趸蛱砑恿康挠嬎悖篬葡萄果實×70%×60]/[0.06×1000]?！炒送猓行杩紤]下述因素：原料含糖高時，二氧化硫結(jié)合時機增加，用量略增；原料含酸量高時，活性二氧化硫含量高，用量略減；溫度高，易被結(jié)合且易揮發(fā)，用量略減；微生物含量和活性越高、越雜，用量越高；霉變嚴重，用量增加。2〕果汁的調(diào)整：取汁測定果汁中糖度和酸度，根據(jù)發(fā)酵需要調(diào)整糖度和酸度。①糖的調(diào)整：釀造酒精含量為10%-12%的酒，果汁的糖度需17-20°B*。如果糖度達不到要求則需加糖，實際加工中常用蔗糖或濃縮汁。②酸的調(diào)整：酸可抑制細菌繁殖，使發(fā)酵順利進展；使酒顏色鮮明；使酒味清爽，并具有柔軟感；與醇生成酯，增加酒的芳香；增加酒的貯藏性和穩(wěn)定性。干酒易在0.6%-0.8%，甜酒0.8%-1%一般pH大于3.6或可滴定酸低于0.65%時應(yīng)該對果汁加酸。發(fā)酵調(diào)整后的果汁里加上酵母菌,于28度溫度下培養(yǎng)一周，每天測含糖量，含酸量，分別制成曲線。發(fā)酵完畢后用蒸餾設(shè)備將酒蒸出，并用酒度計測量酒度。另外：糖的滴定實驗1.實驗?zāi)康恼莆諒?fù)原糖和總糖的測定原理，學(xué)習(xí)用直接滴定法測定復(fù)原糖的方法。2.實驗原理斐林氏溶液與復(fù)原糖共沸，其中斐林氏溶液中的Cu2+被復(fù)原糖復(fù)原為Cu2O〔磚紅色〕時，反響到達終點，過量的復(fù)原糖使次甲基藍指示劑藍色褪去，顯露出Cu2O的紅色即為終點。3.實驗材料和用具1〕試劑費林甲液：稱取68.29g硫酸銅〔CuSO4·5H2O〕，溶于蒸餾水中并稀釋到1000ml。費林乙液：稱取346g酒石酸鉀鈉及100gNaOH，溶于蒸餾水中，完全溶解后，用蒸餾水稀釋到1000ml，貯存于具橡皮塞玻璃瓶中。0.25％葡萄糖標(biāo)準溶液：準確稱取2.500g經(jīng)98-105℃枯燥至恒重的無水葡萄糖，加蒸餾水溶解后移入1000ml容量瓶中，參加5ml濃HCl〔防止微生物生長〕，用蒸餾水稀釋到1000ml。2〕器具：電熱恒溫水浴鍋，調(diào)溫電爐，250ml錐形瓶，滴定管。4.操作步驟

1〕標(biāo)定預(yù)備試驗：吸取費林溶液A、B各5.00mL于250mL三角瓶中，加50mL水，搖勻，在電爐上加熱至沸，在沸騰狀態(tài)下用制備好的葡萄糖標(biāo)準溶液滴定，當(dāng)溶液的藍色將消失呈紅色時，加2滴次甲基藍指示液，繼續(xù)滴至藍色消失，記錄消耗的葡萄糖標(biāo)準溶液的體積。2〕標(biāo)定正式試驗：戲取費林溶液A、B各5.00mL于250mL三角瓶中，加50mL水和比預(yù)備試驗少1mL的葡萄糖標(biāo)準溶液，加熱至沸，并保持2min，加2滴次甲基藍指示液，在沸騰狀態(tài)下于1min內(nèi)用葡萄糖標(biāo)準溶液滴至終點，記錄消耗的葡萄糖標(biāo)準溶液的總體積。計算式中：F——費林溶液A、B各5mL相當(dāng)于葡萄糖的克數(shù)，g；m——稱取葡萄糖的質(zhì)量，g；V——消耗葡萄糖標(biāo)準溶液的總體積，mL。3〕蘋果酒樣品復(fù)原糖測定：準確吸取一定量的樣品〔V1〕于100mL容量瓶中，使之所含復(fù)原糖量為0.2～0.4g，加水定容至刻度。吸取費林溶液A、B各5.00mL于250mL三角瓶中，加50mL水和一定量的試樣〔試樣所含復(fù)原糖量為0.2-0.4g〕，加熱至沸，并保持2min，加2滴次甲基藍指示液，在沸騰狀態(tài)下于1min內(nèi)用葡萄糖標(biāo)準溶液滴至終點，記錄消耗的葡萄糖標(biāo)準溶液的總體積。按式〔5〕計算。

式中：*——總糖或復(fù)原糖的含量，g／L；F——費林溶液Ⅰ、Ⅱ各5mL相當(dāng)于葡萄糖的克數(shù)，g；V1——吸取的樣品體積，mL；V2——樣品稀釋后或水解定容的體積，mL；V3——消耗試樣的體積，mL；G——葡萄糖標(biāo)準溶液的準確濃度，g／mL；V——消耗葡萄糖標(biāo)準溶液的體積，mL。所得結(jié)果應(yīng)表示至一位小數(shù)。

滴定酸的測定—中和滴定法實驗?zāi)康暮蛢?nèi)容〔1〕采用中和滴定法測定葡萄酒〔果酒〕中滴定酸的含量?！?〕適用于各種類型葡萄酒〔果酒〕中滴定酸含量的測定。以g/L報告其結(jié)果，測定值保存一位小數(shù)。2.實驗原理利用酸堿中和的原理，以氫氧化鈉標(biāo)準溶液直接滴定葡萄酒〔果酒〕樣品中的滴定酸，用酚酞指示劑指示滴定終點，由所消耗的氫氧化鈉標(biāo)準溶液的體積計算葡萄酒〔果酒〕中滴定酸的含量。3.試劑酚酞指示劑溶液，10g/L：稱取酚酞1.0g，溶于60mL乙醇中，用水稀釋至100mL。0.1mol/L氫氧化鈉標(biāo)準滴定溶液。氫氧化鈉標(biāo)準溶液，c(NaOH)＝0.1mol/L?！?〕配制將氫氧化鈉配成飽和溶液，注入塑料瓶〔或桶〕中，封閉放置至溶液清亮，使用前虹吸上層清液。量取5mL氫氧化鈉飽和溶液，注入1000mL不含二氧化碳的水中，混勻?！?〕標(biāo)定稱取0.6g于105～110℃烘至恒量的基準鄰苯二甲酸氫鉀，準確至0.0001g。溶于50mL不含二氧化碳的水中，參加2滴酚酞指示劑溶液，以新制備的氫氧化鈉標(biāo)準溶液滴定至溶液呈微紅色為其終點。同時做空白試驗?！?〕計算按下式計算氫氧化鈉標(biāo)準溶液的濃度：C＝m/(V1-V2)×0.2042式中：C——氫氧化鈉標(biāo)準溶液濃度，mol/L；m——基準鄰苯二甲酸氫鉀的質(zhì)量，g；V——滴定時所消耗氫氧化鈉溶液的體積，mL；V1——空白試驗消耗氫氧化鈉溶液的體積，mL；0.2042——與1.00mL氫氧化鈉標(biāo)準溶液[c(NaOH)=1.000mol/L]相當(dāng)?shù)?，以克表示的鄰苯二甲酸氫鉀的質(zhì)量。4.操作步驟〔1〕樣品的測定取調(diào)溫至20℃的樣品2.00-5.00mL(取樣量可根據(jù)酒的顏色深淺而增減)置于250mL三角瓶中，參加中性蒸餾水50mL，同時參加2滴酚酞指示劑溶液，搖勻后，立即用氫氧化鈉標(biāo)準溶液〔c(NaOH)＝0.1mol/L〕滴定至溶液微紅色為終點，并保持30s內(nèi)不變色，記錄所消耗氫氧化鈉標(biāo)準溶液的體積V1。起泡葡萄酒和加氣起泡葡萄酒需排除二氧化碳后，再進展測定。〔2〕空白的測定吸取中性蒸餾水50mL置于250mL三角瓶中，同時參加2滴酚酞指示劑溶液，其余操作同1?！?〕結(jié)果計算按下式計算滴定酸的量，以g/L表示：式中：*——樣品中滴定酸的含量，g/L；c——氫氧化鈉標(biāo)準溶液濃度，mol/L；V1——樣品滴定時，消耗氫氧化鈉標(biāo)準溶液的體積，mL；V0——空白滴定時，消耗氫氧化鈉標(biāo)準溶液的體積，mL；V2——吸取樣品的體積，