動物生化核酸的生物學(xué)功能

動物生化核酸的生物學(xué)功能第1頁/共219頁講授內(nèi)容第一節(jié)

DNA的生物合成第二節(jié)

RNA的生物合成第三節(jié)

RNA催化活性的發(fā)現(xiàn)第四節(jié)蛋白質(zhì)的生物合成第五節(jié)蛋白質(zhì)的到位第六節(jié)中心法則第七節(jié)基因表達的調(diào)控第八節(jié)分子生物學(xué)技術(shù)第2頁/共219頁教學(xué)目標了解DNA復(fù)制的一般過程，以及原核細胞和真核細胞DNA合成的異同了解PCR有選擇擴增DNA的原理了解RNA合成涉及的起始、延伸和終止三個過程掌握核酶的概念掌握蛋白質(zhì)合成的一般過程掌握乳糖操縱子模型了解幾種分子生物學(xué)技術(shù)過程及原理第3頁/共219頁第一節(jié)DNA的生物合成第4頁/共219頁一、DNA的復(fù)制Watson和Crick在提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型推測DNA在復(fù)制時首先兩條鏈之間的氫鍵斷裂，兩條鏈分開然后以每一條鏈分別做模板各自合成一條新的DNA鏈這樣新合成的子代DNA分子中一條鏈來自親代DNA，另一條鏈是新合成的，這種復(fù)制方式為半保留復(fù)制

第5頁/共219頁半保留復(fù)制A=TG=C第6頁/共219頁DNA合成的同位素示蹤實驗1958，Meselson和Stahl大腸桿菌15NH4CI為唯一氮源的培養(yǎng)液中生長若干代被15N標記的大腸桿菌轉(zhuǎn)入14NH4CI為唯一氮源的培養(yǎng)液中完成第一代和第二代繁殖時，

分離DNA，密度梯度超速離心被15N標記的親代雙鏈DNA（記作15N/15N）密度大，在下部；14N/14N密度小，在上部；15N/14N在15N/15N和14N/14N之間（一）DNA的半保留復(fù)制第7頁/共219頁（二） DNA復(fù)制開始于特定的起點復(fù)制是從DNA分子上的特定部位開始的，這一部位叫原點（origin）從原點開始同時向DNA鏈的兩個方向進行，結(jié)果形成一個分叉，稱為復(fù)制叉（fork）第8頁/共219頁原核生物與真核生物DNA合成區(qū)別大腸桿菌只有一個復(fù)制原點，Q形復(fù)制，速率1700bp/s高等生物有多個復(fù)制點，速率只有50bp/s第9頁/共219頁DNA的復(fù)制總是由5`向3`方向進行前導(dǎo)鏈(leadingstrand)以3‘→5’方向的母鏈為模板，連續(xù)復(fù)制合成的一條5‘→3’方向的鏈隨后鏈另一條母鏈DNA是5‘→3’方向，它作為模板時，復(fù)制合成許多條不連續(xù)的5‘→3’方向的短鏈（三） DNA復(fù)制中一股鏈是不連續(xù)合成第10頁/共219頁DNA復(fù)制的過程第11頁/共219頁第12頁/共219頁（四） DNA復(fù)制相關(guān)的酶和蛋白質(zhì)第13頁/共219頁（1）DNA聚合酶DNA聚合酶I是一個模板指導(dǎo)酶需要打開的DNA單鏈作為模板才能合成子鏈此酶催化的底物必須是脫氧的核苷5’-三磷酸（dATP、dGTP、dTTP和dCTP）DNA聚合酶Ⅰ需要引物DNA聚合酶Ⅰ只能將脫氧核苷酸加于已存在的DNA或RNA鏈的3’-羥基上，缺少則不能合成DNA聚合酶還具有水解作用DNA聚合酶I是一個3’→5’核酸外切酶，又是5’→3’核酸外切酶。這兩種酶活性對DNA的復(fù)制都是十分重要的第14頁/共219頁第15頁/共219頁由DNA聚合酶催化的鏈延長反應(yīng)第16頁/共219頁第17頁/共219頁第18頁/共219頁2．引物酶復(fù)制合成先導(dǎo)鏈或隨后鏈岡崎片段的引物是一段RNA（5-10個核苷酸）這段RNA由一種特異的RNA聚合酶合成，此酶稱為引物酶（Primerase）。第19頁/共219頁引物及引物酶的作用已知DNA聚合酶具有3’→5’的外切作用以校對復(fù)制中的錯誤核苷酸。這就決定了它不能從頭開始合成。因此先合成一段低忠實性的多核苷酸來開始DNA的合成，并以核糖核苷酸來標記是“暫時”的。這種高度精確的安排增加了DNA復(fù)制的復(fù)雜性，卻保證了復(fù)制的忠實性。已知復(fù)制的誤差率僅為十億分之一至百億分之一，即復(fù)制十億到一百億個堿基才可能出一個差錯。第20頁/共219頁3.DNA連接酶DNA聚合酶能將脫氧核苷酸加到引物RNA鏈上并延長，但不能催化兩條DNA單鏈連接起來或把單條DNA鏈閉合起來。第21頁/共219頁第22頁/共219頁第23頁/共219頁第24頁/共219頁二、DNA的損傷和修復(fù)保證DNA分子的完整性對于生物是至關(guān)重要的在幾億年進化的過程中產(chǎn)生了對復(fù)制過程中偶然發(fā)生的錯誤，進行校正的高效“校正”系統(tǒng)及由于客觀因素造成的DNA損傷進行修復(fù)的系統(tǒng)。第25頁/共219頁

（一）DNA的損傷某些化學(xué)、物理的因素可引起細胞DNA的損傷（化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變）化學(xué)因素種類繁多，機制也很復(fù)雜；物理因素中紫外線的作用機制研究得比較清楚。例如形成胸腺嘧啶二聚體。此外，DNA的損傷還有堿基可能改變或丟失、骨架中的磷酸二酯鍵可能斷裂，螺旋鏈可能形成交聯(lián)等。第26頁/共219頁第27頁/共219頁胸腺嘧啶二聚體紫外線引起DNA分子中同一條鏈上相鄰的兩個嘧啶核苷酸以共價鍵連接生成環(huán)丁烷結(jié)構(gòu)，即嘧啶二聚體。最易見的是胸腺嘧啶二聚體。此種二聚體不能容納在雙螺旋結(jié)構(gòu)中，它不能與互補鏈上的腺嘌呤形成氫鍵配對，影響DNA的復(fù)制和基因表達。第28頁/共219頁（二）損傷修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)保護DNA的正常功能是非常重要的不論物理因素或化學(xué)因素所造成的損傷，只要DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，就能被修復(fù)酶識別，而把不正常的部分切除光誘導(dǎo)的修復(fù)（光修復(fù)）不依賴光的修復(fù)（暗修復(fù)）在高等動物體內(nèi)暗修復(fù)代替了光修復(fù)。第29頁/共219頁光修復(fù)光修復(fù)也稱光復(fù)活它是由可見光（300-400nm）激活光復(fù)活酶，該酶能分解胸腺嘧啶二聚體。已從細菌和動物的細胞中分裂出一種光復(fù)活酶。哺乳動物和人體內(nèi)缺乏此酶。第30頁/共219頁暗修復(fù)暗修復(fù)通過三種不同的機理來完成修復(fù)：1．切除修復(fù)（excisonrepair）2．重組修復(fù)（recombinationalrepair）3．SOS修復(fù)（SOSrepair）第31頁/共219頁切除修復(fù)

第32頁/共219頁2．重組修復(fù)重組修復(fù)是一種復(fù)制后修復(fù)。這種修復(fù)中含嘧啶二聚體的DNA片段仍可進行復(fù)制，但子鏈中在損傷的對應(yīng)部位出現(xiàn)缺口。復(fù)制后通過分子內(nèi)重組或稱為姐妹鏈交換（sister-strandexchange），從完整的親代鏈上把相應(yīng)堿基順序的片段移至子代鏈缺口處，使之成為完整的分子。親鏈上的缺口由聚合酶I和連接酶填補完整，這就稱為重組修復(fù)。第33頁/共219頁重組修復(fù)的結(jié)果在重組修復(fù)過程中親代鏈上的嘧啶二聚體并未消除，因此在進行第二次復(fù)制時子代鏈中仍會出現(xiàn)缺口，還需通過重組修復(fù)來彌補。但隨著復(fù)制的不斷進行，代數(shù)增多之后，雖然親代鏈中的嘧啶二聚體仍然存在，而損傷的這一條DNA鏈卻逐漸被稀釋，最后對正常生理過程沒有影響，損傷也就得到了修復(fù)。第34頁/共219頁3．SOS修復(fù)

這種修復(fù)是允許子鏈DNA復(fù)制合成時越過親鏈上受損傷的片段而不形成缺口，稱為旁路系統(tǒng)（bypasssystem）。這種修復(fù)以犧牲復(fù)制的忠實性為代價。例如修復(fù)嘧啶二聚體時，SOS系統(tǒng)被激活后，就沿復(fù)制叉前進合成子鏈，但在損傷對應(yīng)部位隨機放上兩個腺嘌呤或其它錯誤核苷酸，子鏈雖合成但可能含有堿基錯誤。SOS修復(fù)的詳細機理還不十分清楚。第35頁/共219頁三、RNA指導(dǎo)下的DNA合成20世紀70年代從一些含RNA的腫瘤病毒如鳥類成髓細胞白血病病毒和勞氏肉瘤病毒中分離到一種獨特的RNA指導(dǎo)的RNA聚合酶由于它以RNA為模板合成DNA，故此稱為反轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）第36頁/共219頁

反轉(zhuǎn)錄酶

反轉(zhuǎn)錄酶以病毒RNA為模板，在引物參與下以四種dNTP為底物，按5’→3’方向催化合成一條與模板RNA互補的RNA-DNA雜交鏈，其中的DNA鏈稱為互補DNA鏈（cDNA）。然后再以新合成的RNA鏈為模板，合成另一條互補的DNA鏈，形成雙鏈的DNA分子。新合成的雙鏈DNA分子可以進入宿主細胞核，并整合到宿主的DNA中，隨宿主DNA一起復(fù)制傳遞給子代細胞。在某些條件下此潛伏的DNA可以活躍起來轉(zhuǎn)錄出病毒RNA而使病毒繁殖。在另外一些條件下它也可以引起宿主細胞發(fā)生癌變。第37頁/共219頁

逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活周期第38頁/共219頁四、多聚酶鏈式反應(yīng)（PCR）

多聚酶鏈式反應(yīng)（PCR，Polymerasechainreaction），是20世紀80年代末發(fā)展起來的一種快速的DNA特定片段體外合成擴增的方法。第39頁/共219頁PCR反應(yīng)的步驟⑴在微量離心管中，加入適量的緩沖液，微量的模板DNA，人工合成的兩個DNA引物，四種脫氧單核苷酸（dNTP），一種耐熱的多聚酶和Mg2+。⑵將上述溶液加熱，使模板DNA在高溫下（如95℃）變性，雙鏈解開為兩條單鏈；⑶然后降低反應(yīng)溫度，使兩條引物在低溫下（37℃）分別與兩條模板互補退火，形成局部雙鏈；⑷再升高反應(yīng)溫度至中溫（72℃），此時多聚酶以dNTP為原料，以兩引物為復(fù)制的起點，在兩條模板上合成新的DNA子鏈。⑸如此重復(fù)改變反應(yīng)溫度，即高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個階段。第40頁/共219頁第41頁/共219頁PCR反應(yīng)的結(jié)果以三次改變溫度為一個循環(huán)，每一次循環(huán)就使欲擴增的DNA區(qū)段的拷貝數(shù)放大一倍即第一次循環(huán)，每條模板雙鏈DNA變?yōu)?條；第二次循環(huán)，則變?yōu)?條；第三次循環(huán)，變成8條……以幾何級數(shù)擴增下去。一般樣品經(jīng)30次循環(huán)．最終使特定DNA片段放大了數(shù)百萬倍。第42頁/共219頁PCR的特點（1）對DNA模板要求不高，純度要求不嚴，用量很低，DNA分子量的長度僅為幾百個bp，只要含有未損傷的需要擴增的片段即可。

（2）引物設(shè)計十分重要，它決定了PCR擴增片段的大小及特異性。引物的設(shè)計是按需要及引物設(shè)計原則進行的?，F(xiàn)在已有DNA合成儀，設(shè)計好的引物能很快合成。（3）需要一個耐熱的DNA聚合酶。發(fā)現(xiàn)了TaqDNA聚合酶，PCR才進入實用階段。PCR技術(shù)現(xiàn)已成為分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物工程、法醫(yī)學(xué)及考古學(xué)等領(lǐng)域不可缺少的工具。第43頁/共219頁PCR技術(shù)的應(yīng)用PCR技術(shù)可以廣泛應(yīng)用于科研和實際檢測中，用于DNA研究、序列分析、測定基因表達，從cDNA可放大特定克隆、構(gòu)建基因圖、進化分析、生物證據(jù)分析和醫(yī)學(xué)研究與臨床檢驗等。第44頁/共219頁五、DNA核苷酸順序測定DNA順序測定技術(shù)有A.Maxam和W.Gilbert提出的化學(xué)裂解法和1978年F.Sanger提出的雙脫氧核苷酸末端終止法。以Sanger法最適用。第45頁/共219頁Sanger法的程序Sanger法最突出的特點是在PCR反應(yīng)中加入一種2’，3’-二脫氧核苷三磷酸（ddNTP），整個測定的程序如下：將被測DNA制成單鏈模板。分別加入4個反應(yīng)管中。并在每個管中加入引物、DNA聚合酶和4種dNTP（其中一種為32P標記）。然后在4個管中分別加入ddTTP、ddCTP、ddGTP和ddATP。然后進行保溫反應(yīng)。由于雙脫氧的ddNTP比正常的dNTP少了3’-羥基，當它在DNA聚合酶作用下?lián)饺氲秸谘由斓腄NA鏈時，因ddNTP不含3’-羥基，于是就阻止了其它dNTP的繼續(xù)摻入，起了特異性終止劑的作用。第46頁/共219頁2’，3’-二脫氧核苷三磷酸結(jié)構(gòu)圖第47頁/共219頁Sanger法的結(jié)果分析反應(yīng)結(jié)束后在4個管中分別形成一些全部具有相同5’-引物端、和分別以ddT、ddC、ddG、ddA殘基為3’-端結(jié)尾的一系列長短不一的混合物。每種混合物經(jīng)變性聚丙烯酰胺電泳分離及放射自顯影，可見4種混合物形成不同的電泳遷移條帶。每一條帶都代表著一段以ddNTP終止的片段。只要按照電泳條帶出現(xiàn)的先后次序即可讀出被測DNA的順序。第48頁/共219頁第49頁/共219頁第二節(jié)RNA的生物合成第50頁/共219頁

一、轉(zhuǎn)錄整個生物體所有的遺傳信息，都編碼在每個細胞的DNA分子中。DNA是通過轉(zhuǎn)錄（transcription），將遺傳信息轉(zhuǎn)移到RNA分子上。轉(zhuǎn)錄就是以DNA為模板合成RNA的過程。第51頁/共219頁（一）DNA的大小與基因在整個DNA的分子上分布著許多特殊的片段。在這些片段中有些是為一種或幾種蛋白質(zhì)的全部氨基酸編碼的核苷酸順序，稱為基因（gene），也稱為順反子或多順反子。通常也把這些編碼蛋白質(zhì)的基因片段稱為結(jié)構(gòu)基因。在DNA分子上還有些片段是為rRNA和tRNA編碼的核苷酸，這些片段有時也稱為基因。有些DNA片段，不編碼基因而是一些不被轉(zhuǎn)錄的調(diào)控區(qū)，它們具有主宰基因轉(zhuǎn)錄和表達的功能，是基因不可缺少的部分。第52頁/共219頁重復(fù)基因DNA中有些基因是重復(fù)的，稱為重復(fù)基因。原核生物中的重復(fù)基因數(shù)較少，真核生物中重復(fù)基因則很豐富如酵母的tRNA基因為每一種不同的tRNA編碼的基因平均達10個重復(fù)基因這種多重復(fù)基因的現(xiàn)象，是為適應(yīng)細胞的分裂和增殖的需要。第53頁/共219頁基因重疊DNA分子中的基因的組合也很不相同在一些病毒中存在基因重疊的現(xiàn)象，如大腸桿菌噬菌體ΦΧ174DNA序列中基因排列。第54頁/共219頁不連續(xù)基因真核生物的許多基因是不連續(xù)的，即一個完整的基因被一個或更多個插入的片段所間隔。把這些插入而不編碼的序列稱為內(nèi)含子（intron），把被間隔的編碼蛋白質(zhì)的基因部分稱為外顯子（exno）。轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA都必須經(jīng)過加工，除去其中的內(nèi)含子并經(jīng)復(fù)雜的修飾才能成為成熟的各種RNA，其中的mRNA才能成為合成蛋白質(zhì)的模板。第55頁/共219頁第56頁/共219頁第57頁/共219頁第58頁/共219頁（二）雙鏈DNA中僅有一段被轉(zhuǎn)錄基因中僅一股鏈被轉(zhuǎn)錄?，F(xiàn)在把被轉(zhuǎn)錄的一股鏈稱為模板鏈，另一股鏈稱為編碼鏈。mRNA與模板鏈是互補的。mRNA的核苷酸順序則與編碼鏈完全相同，只是其中以U代替了T。因此，mRNA的遺傳信息與編碼鏈相同，代表了基因的編碼順序。第59頁/共219頁（三）RNA聚合酶基因的轉(zhuǎn)錄是由RNA聚合酶（RNApolymerase）催化。RNA聚合酶催化底物合成時是形成磷酸二酯鍵。合成的方向是5’→3’：即RNA聚合酶是沿著模板鏈的3’→5’方向移動。RNA聚合酶的條件模板，雙鏈DNA或單鏈DNA均可作模板?；罨牡孜铮枰?種三磷酸的核苷酸：ATP，GTP、UTP及CTP為反應(yīng)底物。二價金屬離子，主要是Mg2+和Mn2+。第60頁/共219頁第61頁/共219頁RNA聚合酶的結(jié)構(gòu)組成大腸桿菌的RNA聚合酶是一個非常大的（450KD）極其復(fù)雜的酶分子。它由4種亞基組成。整個酶的亞基組成是α2ββ’σ，稱為全酶。沒有σ亞基的RNA聚合酶稱為核心酶（α2ββ′）。RNA聚合酶中各亞基的作用σ亞基激活RNA聚合酶使之識別轉(zhuǎn)錄起始點的序列，并參與解開DNA雙鏈，找到模板鏈。當轉(zhuǎn)錄開始合成RNA鏈后，σ亞基就從全酶中解離下來。解離下來的σ亞基可與另一核心酶連接，開始另一輪的轉(zhuǎn)錄。核心酶繼續(xù)對DNA模板轉(zhuǎn)錄。全酶的作用是識別起始，而核心酶的作用是延長及辨認轉(zhuǎn)錄終止。第62頁/共219頁（四）DNA模板上的啟動子概念轉(zhuǎn)錄起始于RNA聚合酶結(jié)合在被轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)段上。結(jié)合的特定部位稱為啟動子（promoter）。它是20至200個堿基的特定順序。習(xí)慣上將+1以下的轉(zhuǎn)錄方向稱“下游”，-1以上稱“上游”，啟動子在上游區(qū)?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)原核生物的啟動子順序中存在兩個共同的順序，即-10順序，也稱為Pribnow順序（pribnowbox）和-35順序。第63頁/共219頁

啟動子中不同順序的作用-10順序-10的基本順序是TATAATG。-10順序被看作是雙螺旋打開形成開放啟動復(fù)合物的區(qū)域。-35順序典型的情況下含有9個堿基，被認為是酶結(jié)合的起始部位。啟動子常以單位時間內(nèi)合成RNA分子數(shù)的多少分為強啟動子和弱啟動子。據(jù)認為強弱之間的區(qū)別就存在于-35的結(jié)構(gòu)中。第64頁/共219頁啟動子處的反應(yīng)聚合酶含有兩個核苷酸結(jié)合位點，稱為起始部位和延伸部位。起始部位結(jié)合三磷酸嘌呤核苷酸ATP或GTP。轉(zhuǎn)錄與復(fù)制不同，不需要引物，因而合成的RNA第一個核苷酸常常是pppA或pppG。第65頁/共219頁（五）延長在轉(zhuǎn)錄鼓泡上進行轉(zhuǎn)錄泡是一個含有核心酶、DNA和新生RNA的區(qū)域，在這個區(qū)域里含有一段解鏈的DNA“泡”，所以稱為轉(zhuǎn)錄泡（transcriptionbubble）。在“泡”里新合成的RNA與模板DNA鏈形成一雜交的雙螺旋。此段雙螺旋長約12bp，相當于A型DNA螺旋的一轉(zhuǎn)。在“泡”里核心酶始終與DNA的另一鏈（編碼鏈）結(jié)合，使DNA中約有17個bp被解開。延長速率大約是每秒鐘50個核苷酸，轉(zhuǎn)錄鼓泡移動170nm的距離。第66頁/共219頁RNA-DNA雜交鏈的長度在RNA聚合酶沿著DNA模板移動的整個過程中形成的RNA-DNA雜交鏈的長度及DNA未解開的區(qū)域長度均保持不變。雜交雙鏈12bp的長度恰好短于雙螺旋完整的一轉(zhuǎn)，當形成完整的一轉(zhuǎn)前，RNA因彎曲很厲害即離開了DNA模板，防止了RNA5’-末端與DNA相互纏繞打結(jié)。第67頁/共219頁第68頁/共219頁轉(zhuǎn)錄的錯誤頻率RNA聚合酶沒有核酸外切酶活性，不能對進入RNA鏈的核苷酸進行校正，所以轉(zhuǎn)錄的錯誤頻率是每104或105中有一個錯誤，是DNA復(fù)制中錯誤的105倍。這種準確性雖很低，但由于RNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物很多，極少數(shù)有缺陷的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物大概不會產(chǎn)生有害的影響。第69頁/共219頁（六）轉(zhuǎn)錄終止轉(zhuǎn)錄有終止點，轉(zhuǎn)錄終止出現(xiàn)在DNA分子內(nèi)特定的堿基順序上。細菌及病毒DNA的終止順序分析證明，它們有明顯的特點。富含GC，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物極易形成二重對稱性（dyadsymmetry）結(jié)構(gòu)，緊接GC之后有一串A。按此模板轉(zhuǎn)錄出來的RNA極易自身互補，形成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)新生的RNA鏈卻以幾個U殘基而結(jié)束。當RNA聚合酶遇到這種結(jié)構(gòu)特點時就會停止下來。第70頁/共219頁二、RNA轉(zhuǎn)錄后的加工成熟 1.原核生物的mRNA成熟過程

2.原核生物的tRNA成熟過程

3.原核生物的rRNA成熟過程第71頁/共219頁1.原核生物的mRNA成熟過程原核生物的mRNA通常不用修飾，因生成的mRNA高度不穩(wěn)定，當它們的3’末端合成尚未完成時，mRNA的5’末端已經(jīng)開始降解。mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯是同步發(fā)生的，mRNA僅僅合成一部分時，翻譯就開始了，翻譯結(jié)束，mRNA就開始降解。第72頁/共219頁2.原核生物的tRNA成熟過程tRNA的成熟過程較為復(fù)雜，包括切割與核苷酸的修飾。多數(shù)tRNA的前體約比成熟分子大20％，在5’和3’端都含有多余的順序。這些多余順序由特異的核酸酶RNaseP及RnaseQ（或RNaseⅢ）分別在5’和3’端進行切割。第73頁/共219頁第74頁/共219頁稀有堿基稀有堿基的形成是在轉(zhuǎn)錄后與切割同時完成的。堿基的修飾是由酶催化的如甲基化酶，該酶能將甲基引入tRNA核苷酸的不同位置。第75頁/共219頁3.原核生物的rRNA成熟過程大腸桿菌的rRNA是由三種rRNA叢集在一起形成一個轉(zhuǎn)錄單位，彼此由間隙區(qū)（內(nèi)含子）分隔開來。在間隙區(qū)中還存在著tRNA。這些rRNA和tRNA基因同時轉(zhuǎn)錄，形成一個長的RNA分子。在原核生物中，加工修飾與轉(zhuǎn)錄是同時進行的，因此在細胞內(nèi)從來不存在完整的前體分子。第76頁/共219頁由16sRNA、tRNA谷、23sRNA、5sRNA和tRNA色以及在遠端的另一個tRNA天冬等組成第77頁/共219頁

三、真核生物中的轉(zhuǎn)錄

真核生物中的轉(zhuǎn)錄比原核生物復(fù)雜，其主要差別如下：

1．真核生物中轉(zhuǎn)錄與翻譯處在不同的區(qū)域

2．RNA聚合酶不相同

3．啟動子不同

4．轉(zhuǎn)錄后RNA加工修飾不同第78頁/共219頁1．真核生物中轉(zhuǎn)錄與翻譯處在不同的區(qū)域在原核生物中mRNA的轉(zhuǎn)錄與翻譯幾乎是同步發(fā)生的。而真核生物，轉(zhuǎn)錄是發(fā)生在細胞核內(nèi)，翻譯則在核外進行。轉(zhuǎn)錄合成的RNA必須穿出核膜才發(fā)揮作用。這種轉(zhuǎn)錄和翻譯在空間上和時間上的分隔使得真核生物能夠以精巧的方式進行RNA的加工、修飾、拼接，增強了真核生物對基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)控。第79頁/共219頁2．RNA聚合酶不相同原核生物中RNA由一種聚合酶合成。在真核生物中則有三種類型的RNA聚合酶。第80頁/共219頁3．啟動子不同已知真核生物的啟動子與原核生物的很相似，也位于轉(zhuǎn)錄起始部位的5’端，但存在著幾個重要的區(qū)域。如距起始部位最近的一個是在-25處，稱為TATA盒（Hogness盒），與原核的-10順序（TATAAT）極為相似。它是啟動子活性所必需的。此外在-40和-110之間還有更多的影響啟動的堿基。具體的生物學(xué)功能尚在研究中。第81頁/共219頁4．轉(zhuǎn)錄后RNA加工修飾不同（1）mRNA加“帽子”和“尾巴”的修飾（2）mRNA的剪切加工（3）rRNA的剪切加工（4）tRNA的剪切加工第82頁/共219頁（1）mRNA加“帽子”和“尾巴”的修飾原核生物的只有幾秒鐘。而且不用加工修飾。真核生物mRNA分子的壽命較長，有的可達幾小時，真核生物的mRNA在5’和3’兩個末端都要受到修飾。5’末端要形成一種稱作帽子（cap）的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。第83頁/共219頁帽子在mRNA5’末端連接一個7-甲基的鳥苷。連接帽子的頭兩個核苷酸的核糖也被不同程度的甲基化。第84頁/共219頁mRNA3’末端的poly（A）結(jié)構(gòu)在mRNA3’末端則要加上一段多聚腺嘌呤核苷酸poly（A）:（AAAAAAAAA-------）的順序，長度可達20至200個核苷酸。第85頁/共219頁真核生物中mRNA的加“帽子”和“尾巴”的生物學(xué)意義真核生物中mRNA的加“帽子”和“尾巴”的生物學(xué)意義尚不十分清楚。添加帽子發(fā)生在mRNA合成起始不久，其功能也許是保護mRNA免受核酸酶降解，以及為蛋白質(zhì)合成機器（核糖體）提供識別特征。加“尾巴”可能增加mRNA的穩(wěn)定性，并對mRNA附著于細胞的內(nèi)膜上也可能有作用。第86頁/共219頁（2）mRNA的剪切加工真核生物每種mRNA分子內(nèi)部含有數(shù)目變化很大的內(nèi)含子。最少的是2個，最多的例如α-膠原蛋白在轉(zhuǎn)錄單位中含52個內(nèi)含子之多。這些內(nèi)含子廣泛地分布于mRNA的前體分子中，長短各不相同，但都比外顯子長。真核生物mRNA前體物的剪切加工，包括內(nèi)含子的剪除及留下的片段拼接成成熟mRNA等過程，稱為RNA剪接（RNASplicing）。剪接是在核內(nèi)進行，而且是在加上“帽子”和接上“尾巴”之后。整個剪接過程完成之后，5’端的“帽子”和3’端的“尾巴”并不丟失。第87頁/共219頁原核生物真核生物第88頁/共219頁核不均一RNA在細胞內(nèi)任何時候都存在著大量正在加工似乎無用的RNA分子。這些分子總稱為核不均一RNA〔hnRNA〕。第89頁/共219頁第90頁/共219頁第91頁/共219頁（3）rRNA的剪切加工在典型動物細胞的核仁中有一段幾百個拷貝的DNA順序（核糖體DNA或rDNA）編碼18s，5.8s和28srRNA分子。5srRNA基因位于核仁之外，處在另一個轉(zhuǎn)錄單位中，基因長24000個拷貝。所有的rRNA轉(zhuǎn)錄物都需要加工，過程與原核相似，即剪切5’和3’末端和切除轉(zhuǎn)錄物中不需要的區(qū)域。第92頁/共219頁（4）tRNA的剪切加工真核生物的tRNA也是一個大轉(zhuǎn)錄物（tRNA前體轉(zhuǎn)錄物），這些轉(zhuǎn)錄物可能含有一個或多個tRNA的順序。成熟的tRNA也是在轉(zhuǎn)錄后經(jīng)剪切加工而成。第93頁/共219頁第三節(jié)催化活性RNA的發(fā)現(xiàn)第94頁/共219頁一、T．Cech的發(fā)現(xiàn)1982年塞克（T．Cech）及其同事在用四膜蟲（Tetrahymena）研究rRNA剪接的過程中引出了一個非常出人意料的發(fā)現(xiàn)。第95頁/共219頁四膜蟲核糖體RNA的前體長4.6kb，必須除去一段414bp的內(nèi)含子，才能產(chǎn)生成熟的26srRNA。塞克（T．Cech）及其同事發(fā)現(xiàn)只需核苷酸存在下，RNA就能剪接自身或自我剪切（self-splicing）。即RNA分子本身具有高度的專一性和催化活性。第96頁/共219頁其它催化活性RNA的發(fā)現(xiàn)對大腸桿菌核糖核酸酶P（RnaseP）的研究真核的酵母和真菌的線粒體中的發(fā)現(xiàn)對核糖體大亞基的研究第97頁/共219頁早期RNA世界在DNA和蛋白質(zhì)出現(xiàn)之前，生命進化的早期存在著一個RNA的世界。這些RNA分子集信息編碼和催化功能于一身;經(jīng)過億萬年的衍變進化，開始合成蛋白質(zhì)，由于蛋白質(zhì)有20種氨基酸的多側(cè)鏈，比RNA的4個堿基更為多樣性，于是逐步替代RNA形成催化活性更高的酶；由RNA衍變，出現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄開始形成DNA。由于DNA的雙螺旋比單鏈的RNA更穩(wěn)定，因此替代RNA成為遺傳信息穩(wěn)定的貯藏所，成為今天專管遺傳信息編碼的載體。第98頁/共219頁第四節(jié)蛋白質(zhì)的生物合成第99頁/共219頁蛋白質(zhì)的生物合成概述生物體每個蛋白質(zhì)的生物合成都受DNA的指導(dǎo)，但貯存遺傳信息的DNA并非蛋白質(zhì)合成的直接模板，而是轉(zhuǎn)錄了遺傳信息的mRNA。以mRNA為模板合成蛋白的過程稱為翻譯（translation）或稱為表達（expression）。第100頁/共219頁遺傳信息是如何儲藏在4種核苷酸中的？如何破譯遺傳密碼？一、遺傳密碼數(shù)學(xué)家、物理學(xué)家——邏輯運算或推導(dǎo)分子生物學(xué)家——？第101頁/共219頁遺傳密碼的破譯1955年紐約大學(xué)Grunberg-Manago用將核苷酸連接起來的酶形成RNA聚合體

A連接成多聚A（polyA，A-A-A-A-A-A-A）polyCpolyGpolyUpolyAU問題：什么樣的核苷酸組合可以被翻譯成多肽片段？1960年德國人31歲Matthei和美國國家健康研究所33歲的Nirenberg將ATP和游離的氨基酸加入到從細胞中提取的核糖體、核酸和酶的混合物中在試管中合成多肽問題：哪一種RNA可促進多肽的合成？第102頁/共219頁在試管中加入了ATP、游離的氨基酸、酶和核糖體及核糖體RNA——沒有蛋白質(zhì)的合成問題：需要其他帶有遺傳信息的RNA？

MarianneGrunberg-Manago方法人工合成RNA加入不同的酶、核糖體、ATP、氨基酸加入polyU、polyA、polyAUpolyU產(chǎn)生了許多蛋白質(zhì)問題：polyU主要利用了哪些氨基酸呢？第103頁/共219頁不同的氨基酸分別加入到polyU試管系統(tǒng)中5天通宵達旦星期六早晨，熬紅了眼的Matthei得到了答案：polyU合成的肽鏈全部是苯丙氨酸（Phe）世界上破譯第一個遺傳密碼的人問題：幾個U決定一個苯丙氨酸的合成？第104頁/共219頁Nirenberg莫斯科第五屆國際生物化學(xué)大會

不善于推銷自己小組會上Meselson認為非同小可全體大會上重新做學(xué)術(shù)報告問題：幾個U決定一個苯丙氨酸的合成？Nirenberg全力組織其他遺傳密碼的破譯Nirenberg發(fā)現(xiàn)并定義了3個核苷酸為一個密碼子決定一個氨基酸的翻譯Khorana按需要連接任意核苷酸ACACACACACACACthr-his-thr-his鏈ACA——蘇氨酸的密碼子CAC——組氨酸的密碼子第105頁/共219頁1966年，Nirenberg和Khorana全部遺傳密碼字典64個密碼子61個負責(zé)20種氨基酸翻譯，3個終止密碼子Nirenberg和Khorana

1968年諾貝爾獎第106頁/共219頁第107頁/共219頁遺傳密碼遺傳密碼DNA（或mRNA）中的核苷酸序列與蛋白質(zhì)中的氨基酸序列之間的對應(yīng)關(guān)系稱為。密碼子DNA（或mRNA）上每3個核苷酸翻譯成蛋白質(zhì)多肽鏈上的一個氨基酸,這3個核苷酸就稱為密碼子第108頁/共219頁（二）遺傳密碼的主要特征1.密碼子高度簡并

2.密碼的通用性

3.遺傳密碼的變異性

4.重疊基因與重疊密碼第109頁/共219頁二、解碼系統(tǒng)氨基酸與tRNA分子的連接，也稱為氨基酸的活化密碼子一反密碼子的相互作用

反密碼子3’-X’-Y’-Z’-5’

密碼子5’-X-Y-Z-3’擺動假說前兩個堿基對是標準型的堿基互補，以保證結(jié)合有最大限度的穩(wěn)定性，第三個堿基則要求不那么嚴格，可以允許結(jié)構(gòu)上有小小的波動（即擺動）。在Holley測定的酵母tRNAAla順序中發(fā)現(xiàn)反密碼子是TGC，它可以識別丙氨酸的同義密碼子GCU、GCC、GCA。氨基酸+tRNA+ATP氨基酰-tRNA+AMP+PPi氨基酰-tRNA合成酶第110頁/共219頁三、核糖體核糖體（ribosome）是蛋白質(zhì)合成的主要場所。它含有蛋白質(zhì)合成中所需要的多種酶活性，能將mRNA分子的堿基順序翻譯成氨基酸順序。第111頁/共219頁

（一）核糖體的化學(xué)組成

第112頁/共219頁真核生物核糖體真核生物的核糖體大約是80s40s亞基18srRNA約30種蛋白質(zhì)60s亞基5s、5.8s、28srRNA50種蛋白質(zhì)第113頁/共219頁（二）核糖體的結(jié)構(gòu)與功能核糖體的結(jié)構(gòu)至少要滿足如下的部位：容納mRNA的部位，結(jié)合氨基酰-tRNA的部位（稱A-位點），結(jié)合肽基-tRNA的部位（稱P-位點），形成肽鍵的部位（轉(zhuǎn)肽酶中心）。識別并結(jié)合mRNA上特異的起始部位，能沿mRNA移動以“解讀”全部信息，在翻譯結(jié)束后肽鏈脫落掉下等功能。第114頁/共219頁第115頁/共219頁（三）多核糖體

蛋白質(zhì)合成過程中一個mRNA的分子上不止結(jié)合一個核糖體而是一群核糖體，稱多核糖體（polysome）。

多個核糖體同時翻譯一個mRNA分子，這顯著提高了mRNA的利用率。一條mRNA的最大利用率可達每80個核苷酸結(jié)合一個核糖體。合成的多肽釋放后，核糖體即解離成30s和50s亞基。第116頁/共219頁四、蛋白質(zhì)合成的過程

（一）翻譯起始（二）肽鏈延長（三）肽鏈合成終止三個階段第117頁/共219頁第118頁/共219頁（一）翻譯起始大腸桿菌內(nèi)蛋白質(zhì)合成的起始，是從核糖體小亞基30s與fMet-tRNAfmet及一個mRNA分子起始因子參與下形成起始復(fù)合物開始。最終形成70s的起始復(fù)合物，完成翻譯起始階段。第119頁/共219頁fMet-tRNAfMet大腸桿菌蛋白質(zhì)合成的第一個氨基酸都是甲酰化的甲硫氨酸，即N-甲酰甲硫氨酸（fMet）。Met的甲?；窃贛et-tRNAfMet合成后，由轉(zhuǎn)甲?；复呋?，從N-9-甲酰四氫葉酸（fTHF）上將甲?；D(zhuǎn)移到甲硫氨酸的NH3+基上形成。但轉(zhuǎn)甲酰酶不會催化組成肽鏈中的甲硫氨酸甲?；?。第120頁/共219頁翻譯起始信號作為起始密碼子的AUG通常離mRNA5’-末端約20-30個堿基，在這段前導(dǎo)順序中，具有一段特殊順序AGGAGGU，位于起始AUG之前的固定的位置上，稱為S.D序列核糖體小亞基30s內(nèi)的16srRNA3’-末端有順序5’-PyACCUCCUUA-3’，Py可以是任何嘧啶核苷酸。于是這段順序即與mRNA前導(dǎo)順序中的AGGAGGA能形成穩(wěn)定的堿基對。第121頁/共219頁翻譯起始信號示意圖第122頁/共219頁mRNA翻譯的方向翻譯的方向是沿mRNA的5’→3’方向進行。所以，在大腸桿菌中，當mRNA的5’端剛轉(zhuǎn)錄合成后不久就與核糖體結(jié)合開始翻譯。第123頁/共219頁（二）肽鏈延長蛋白質(zhì)合成的肽鏈延長階段包括進位肽鍵形成移位第124頁/共219頁第125頁/共219頁1．進位第126頁/共219頁2．肽鏈形成第127頁/共219頁第128頁/共219頁3.移位第129頁/共219頁（三）肽鏈合成的終止當70s移位至A位出現(xiàn)終止密碼子時，就沒有氨基酰-tRNA再進入A位點，肽鏈延長停止。終止過程是由釋放因子（releasefactor，RF）參與下完成的，使P位上的肽鏈轉(zhuǎn)移至水中，形成游離肽鏈，同時70s釋放出50s核糖體亞基。此時，另一個被稱為核糖體釋放因子（ribosomereleasingfactor，RR）的成分參與使30s與mRNA分開。脫去肽鏈的tRNA與終止因子也離開。分離后的50s、30s又可為合成另一條肽鏈所用。第130頁/共219頁蛋白質(zhì)的合成過程第131頁/共219頁第132頁/共219頁五.真核生物的蛋白質(zhì)合成

真核生物中蛋白質(zhì)合成的基本過程與原核生物中類似。只是真核生物蛋白質(zhì)合成時參與的蛋白組分較多，有些步驟更為復(fù)雜。第133頁/共219頁六.蛋白質(zhì)的加工從mRNA翻譯得到的蛋白質(zhì)多數(shù)是沒有生物活性的初級產(chǎn)物。只有經(jīng)翻譯后的加工過程才能成為有活性的終產(chǎn)物。加工包括修飾折疊第134頁/共219頁蛋白質(zhì)的折疊助折疊蛋白酶二硫鍵異構(gòu)酶加速蛋白質(zhì)中形成正確的二硫鍵肽酰脯酰順反異構(gòu)酶催化肽脯氨酰之間肽鍵的旋轉(zhuǎn)反應(yīng)，從而加速蛋白質(zhì)的折疊過程分子伴侶能幫助新生肽鏈正確組裝，成熟，自身卻不是終產(chǎn)物分子成分的蛋白質(zhì)第135頁/共219頁第136頁/共219頁（二）蛋白質(zhì)的修飾（1）N-端修飾除去甲酰基，多數(shù)情況甲硫氨酸也被氨肽酶除去（2）多肽鏈的水解切除水解切除多余的肽段，使之折疊成為有活性的酶或蛋白質(zhì)。（3）氨基酸側(cè)鏈的修飾氨基酸側(cè)鏈的修飾包括羥化、羧化、甲基化、二硫鍵的形成等（4）糖基化修飾糖糖基化是多種多樣的，可以在同一肽鏈上的同一位點連接上不同的寡糖，也可以在不同位點上連接寡糖。糖基化是在酶催化下進行的。第137頁/共219頁第138頁/共219頁第五節(jié)蛋白質(zhì)的到位第139頁/共219頁蛋白質(zhì)到位的機制信號肽除了少數(shù)蛋白外，幾乎所有分泌蛋白都在N-末端含有一段信號序列（Signalsequences）或稱為信號肽。信號識別蛋白（SRP）能識別正在合成多肽并將要通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的核糖體，與信號肽相結(jié)合，形成SRP-信號肽-核糖體復(fù)合物，并暫時停止多肽鏈的合成。隨即SRP將復(fù)合體從細胞質(zhì)引向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。?？康鞍祝―P）膜上SRP的受體，與復(fù)合體相結(jié)合，釋放出SRP。通過一個依賴GTP的過程，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜被打開一個通道，信號肽穿過膜與膜內(nèi)另一受體SSR（SSR）相結(jié)合核糖體上暫時停止的多肽鏈又恢復(fù)合成延長。這樣新生的肽鏈就尾隨信號肽穿過膜延伸進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號肽在蛋白質(zhì)肽鏈合成完成之前，即由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的信號肽酶切除。第140頁/共219頁第141頁/共219頁第142頁/共219頁第六節(jié)中心法則

第143頁/共219頁第七節(jié)基因表達調(diào)控第144頁/共219頁DNA轉(zhuǎn)錄和RNA翻譯，即遺傳信息從基因流向RNA又流向蛋白質(zhì)的過程總稱為基因表達基因表達可以在不同的水平上進行調(diào)控，如控制基因的開啟、關(guān)閉和活性的大小，影響和控制轉(zhuǎn)錄和翻譯等都屬于基因表達的調(diào)控在高度復(fù)雜的生物細胞及其多種多樣的代謝過程中，基因的表達是高度有序的。一、原核生物基因的表達和調(diào)控第145頁/共219頁第146頁/共219頁乳糖操縱子學(xué)說乳糖進入腸道后，大腸桿菌會立刻制造出一些特殊的酶，其中最主要的為b-半乳糖苷酶，來吸收和利用作為細胞能源的乳糖。法國科學(xué)家Monod和Jacob發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌在不含乳糖的葡萄糖培養(yǎng)基中不會分泌b-半乳糖苷酶；相反，含有乳糖時，會合成b-半乳糖苷酶，使乳糖水解。經(jīng)過一系列的實驗后，他們又發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌在沒有乳糖的環(huán)境中不產(chǎn)生編碼b-半乳糖苷酶的mRNA。1961年，他們提出了一種模型即乳糖操縱子學(xué)說。第147頁/共219頁乳糖操縱子結(jié)構(gòu)基因編碼b-半乳糖苷酶（Z）、透性酶（Y）和硫半乳糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶（A）的基因。操縱子包括啟動子、操縱基因和結(jié)構(gòu)基因調(diào)節(jié)基因、阻遏蛋白乳糖+阻遏蛋白，改變阻遏蛋白的形狀第148頁/共219頁第149頁/共219頁第150頁/共219頁第151頁/共219頁第152頁/共219頁第153頁/共219頁第154頁/共219頁第155頁/共219頁第156頁/共219頁第157頁/共219頁第158頁/共219頁第159頁/共219頁第160頁/共219頁第161頁/共219頁第162頁/共219頁第八節(jié)分子生物學(xué)技術(shù)第163頁/共219頁分子生物學(xué)技術(shù)概念以DNA和RNA的體外操作為核心建立的一系列試驗技術(shù)包括DNA和RNA的分離制備基因的分離核苷酸的順序分析分子雜交DNA重組轉(zhuǎn)基因技術(shù)克隆技術(shù)DNA指紋技術(shù)第164頁/共219頁一、DNA重組技術(shù)第165頁/共219頁概述DNA重組技術(shù)（recombinantDNAtechniques）運用多種限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶等，把DNA作為組件，在體外將一種DNA和載體DNA重新組合，轉(zhuǎn)入宿主體內(nèi)，使外源基因表達，最終改變生物原有遺傳性狀的綜合技術(shù)由于這項技術(shù)是按照人們預(yù)先設(shè)計的方案，實現(xiàn)體外基因改造，最后使生物的遺傳性狀獲得改變，故又稱為“遺傳工程（geneticengineering）”或“基因工程（geneengineering）”、“分子克?。╩olecularcloning）”?；蚬こ淌遣捎梅肿由飳W(xué)、核酸生物化學(xué)以及微生物遺傳學(xué)的現(xiàn)代方法和手段建立起來的綜合技術(shù)?；蚬こ碳夹g(shù)的建立，使所有實驗生物學(xué)領(lǐng)域產(chǎn)生巨大變革。第166頁/共219頁DNA重組技術(shù)發(fā)展1970年，Smith等人從細菌中分離出的一種限制性酶，酶切病毒DNA分子，標志著DNA重組時代的開始。1972年，Berg等用限制性酶分別酶切猿猴病毒和l噬菌體DNA，將兩種DNA分子用連接酶連接起來

，得到新的DNA分子。1973年，Cohen等進一步將酶切后的DNA分子與質(zhì)粒DNA連接起來，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.cloi細胞中。第167頁/共219頁（一）DNA重組技術(shù)基礎(chǔ)核酸的制備關(guān)鍵在于對核酸酶的抑制DNA制備操作相對簡單很難獲得完整的DNA大分子RNA制備難度較大第168頁/共219頁2.限制性內(nèi)切核酸酶概念一種水解DNA的磷酸二脂酶，遺傳工程中重要工具——生命的手術(shù)刀。這種酶能識別雙鏈DNA分子中一段特異的核苷酸序列，在這一段序列內(nèi)將雙鏈DNA分子切斷。細菌細胞中存在限制/修飾系統(tǒng)限制：降解外源DNA，防御異源遺傳信息進入的手段修飾：修飾外源DNA片段后，保留在新細胞中。第169頁/共219頁限制性內(nèi)切酶的類別第Ⅰ類酶每隔一段DNA序列隨機切割雙鏈DNA分子，沒有序列特異性,酶切位點不定。如EcoB(大腸桿菌B株)、EcoK(大腸桿菌K株)分子量較大(約300000)，作用時需ATP、Mg++等輔助因子。第Ⅱ類酶能識別一段特異的DNA序列，準確地酶切雙鏈DNA的特異序列。如EcoRI(大腸桿菌)、HindⅢ(嗜血桿菌)，分子量較小(約20000-100000)，作用時需Mg2+存在。第170頁/共219頁第Ⅱ類酶特點：(1)切割產(chǎn)生平末端(bluntends)如SmaⅠ：第171頁/共219頁(2)有的產(chǎn)生粘性末端從兩個方向閱讀而序列相同的序列。識別特定堿基順序，為回文對稱序列,又稱反向重復(fù)序列：如EcoRⅠ：第172頁/共219頁第173頁/共219頁3.載體載體（vector）能將外源基因DNA帶入宿主細胞，并復(fù)制或最終使外源基因DNA表達的自主DNA。將“目的”基因?qū)胧荏w細胞的運載工具。類型質(zhì)粒、噬菌體、病毒、細菌或酵母菌人工染色體等。第174頁/共219頁細菌質(zhì)粒概念質(zhì)粒是細菌細胞內(nèi)獨立于細菌染色體而自然存在的、能自我復(fù)制、易分離和導(dǎo)入的環(huán)狀雙鏈DNA分子。質(zhì)粒能從細菌中提取出來，又能轉(zhuǎn)入細菌，這個過程稱為轉(zhuǎn)化。質(zhì)粒具有重組表型檢測標記，檢測是否攜帶外源DNA片段。第175頁/共219頁4.宿主細胞概念可使外源基因得以增殖和表達的活細胞類型細菌、酵母、真菌、各種真核細胞、受精卵第176頁/共219頁

（二）DNA重組的基本過程目的基因的獲得準備基因，載體和工具酶等。重組目的基因與載體結(jié)合形成重組DNA分子。轉(zhuǎn)化重組DNA分子引入受體細胞，并克隆。分離、鑒定篩選目的基因在受體細胞能夠正確表達的無性繁殖系。第177頁/共219頁第178頁/共219頁DNA重組技術(shù)說明不同來源、無關(guān)的基因在實驗室中可以按人的愿望進行重組構(gòu)建。重組的外源基因引入另一種生物細胞后，可以被增殖并保持原有的遺傳性狀，在新的環(huán)境中轉(zhuǎn)錄和翻譯。使宿主的遺傳性狀按照設(shè)計的路線發(fā)生永久性的改變第179頁/共219頁二、轉(zhuǎn)基因技術(shù)1982年P(guān)almiter等人，首次將大鼠的生長激素基因放在小鼠金屬巰基蛋白啟動子之后，顯微注射入小鼠受精卵，獲得“超級屬”。具有生長激素的轉(zhuǎn)基因鼠第180頁/共219頁轉(zhuǎn)基因的方法和技術(shù)：第181頁/共219頁1982年，美國食品衛(wèi)生和醫(yī)藥管理局批準，用基因工程在細菌中生產(chǎn)人的胰島素投放市場。1985年，轉(zhuǎn)基因植物獲得成功。1994年，延熟保鮮的轉(zhuǎn)基因番茄商品生產(chǎn)。1996年，克隆羊誕生。第182頁/共219頁1996年全世界轉(zhuǎn)基因植物種植面積為170萬公頃，1997年為1100萬公頃，1998年為2780萬公頃，1999年達到3990萬公頃，2000年達到4420萬公頃，2001年達到5260萬公頃，2002年達到5000萬公頃。第183頁/共219頁轉(zhuǎn)基因動物:與轉(zhuǎn)基因植物相比，轉(zhuǎn)基因動物的發(fā)展要慢些。轉(zhuǎn)基因動物：目的基因+載體重組DNA微量注射法將重組DNA導(dǎo)入受體合子細胞核中遺傳轉(zhuǎn)化。如：利用轉(zhuǎn)基因羊，大量表達人類的抗胰蛋白酶。(Wilmut等，Nature385,1997)第184頁/共219頁受精卵細胞注射法轉(zhuǎn)基因牛：受精卵注射法第185頁/共219頁人類生長激素轉(zhuǎn)基因豬同胞鼠對照轉(zhuǎn)移有人類生長激素轉(zhuǎn)基因鼠第186頁/共219頁三、體細胞克隆技術(shù)概念由體細胞核在卵細胞中無性繁殖而成的動物可分泌人類生長因子Ⅸ的轉(zhuǎn)基因克隆羊“Dolly”(Wilmut等，Nature385,1997)第187頁/共219頁第188頁/共219頁四、DNA指紋——分子遺傳標記限制性片段長度多態(tài)性，RFLP（restrictionfragmentlengthpolymorphism）酶切-電泳-探針southern雜交-放射性自顯影只能檢測一個位點，操作復(fù)雜，費時、成本高，對模板要求大可變串聯(lián)重復(fù)序列，TRS（tandemrepeatedsequence）小衛(wèi)星9~70bp酶切-電泳-探針southern雜交-放射性自顯影——DNA指紋圖譜（fingerprinting,DFP）多態(tài)檢測率高，共顯性，高度特異性技術(shù)復(fù)雜，成本高，有時譜帶過于復(fù)雜微衛(wèi)星2~6bp引物設(shè)計-PCR-聚丙烯酰胺凝膠電泳分布均勻，多態(tài)信息豐富，共顯性，穩(wěn)定性好，可比性強，分析易自動化須事先了解微衛(wèi)星兩側(cè)序列才能設(shè)計引物第189頁/共219頁隨機擴增多態(tài)性DNA，RAPD（randomamplifiedpolymorphism）隨機引物-PCR-凝膠電泳引物隨機合成，快捷簡便，經(jīng)濟，模板量少多態(tài)信息中等重復(fù)性差，呈顯隱性遺傳，無法區(qū)分雜合子和顯性純合子擴增片段長度多態(tài)性，AFLP（amplifiedfragmentlengthpolymorphism）酶切-接頭-PCR-凝膠電泳克服了RFLP技術(shù)復(fù)雜，RADP穩(wěn)定性差、標記顯隱性遺傳的缺點大部分標記呈顯性遺傳，成本較高第190頁/共219頁應(yīng)用個體及親緣關(guān)系的鑒定DNA指紋：親子鑒定微衛(wèi)星：親緣鑒定AFPL：品種鑒定種質(zhì)資源的遺傳評估，檢測，保護和利用基因定位與遺傳圖譜的構(gòu)建標記輔助選擇（Marker-assistedselection,MAS）第191頁/共219頁不同產(chǎn)地白花蛇舌草DNA指紋圖譜PrimerBA0162：

GGAGGAGAGG1福建寧化2福建沙縣3福建武平4福建省5廣西邕寧6廣西省7廣東省8廣東龍門9廣東省10廣東省11湖南省12云南昆明13湖北省(偽品)14廣西省(偽品)1234567M891011121314M白花蛇舌草DNA指紋圖譜研究第192頁/共219頁五、核酸分子雜交Southern雜交分析由英國的Southern發(fā)明(1975)，一種將瓊脂糖中的DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜,進行DNA分子雜交分析的方法。篩選基因庫得到陽性克隆后,將限制性酶酶切與Southern雜交結(jié)合,繪制限制性酶圖譜。Northern雜交分析：與Sorthern雜交相同的原理和程序。用于分析克隆的基因在某一細胞或組織的轉(zhuǎn)錄水平，檢測mRNA的存在。Western雜交分析用于蛋白質(zhì)的分析第193頁/共219頁遺傳疾病診斷

利用PCR技術(shù)或者分子雜交技術(shù)進行遺傳疾病診斷，是直接從DNA即基因水平進行診斷，準確度高，速度快。第194頁/共219頁六、基因治療

利用基因工程技術(shù)，將特異基因?qū)氩⒄系接羞z傳缺陷患者的基因組中，治療遺傳疾病，通常叫做基因治療(genetherapy)。方法：利用減毒的病毒DNA作載體(retrovirusDNA)構(gòu)建重組DNA分子用病毒包裝物包裝后形成的減毒病毒感染患者的細胞將正?；蛘系饺旧w上。第195頁/共219頁

用漠洛尼氏鼠白血病病毒(MLV)改造而成的retrovirus載體，已用于治療嚴重綜合免疫缺陷(SCID)。SCID是由于腺苷脫氫酶基因(adenosinedeaminase，ADA)突變引起的，患者無任何免疫功能。方法：將ADA基因?qū)氲組LVretrovirus載體中取代該病毒DNA中的三個基因結(jié)構(gòu)(gag、pol、env)將重組后的病毒去感染T細胞，使ADA基因整合到T細胞的染色體中實現(xiàn)基因治療的目的。第196頁/共219頁2000年法國Fischer用該方法治愈患有SCID遺傳病的兩個嬰兒(8個月和11個月)。這一工作被認為是20世紀人類基因治療上的重大突破。第197頁/共219頁七、DNA芯片(DNAchips)核酸分子雜交的原理和方法+半導(dǎo)體技術(shù)結(jié)合發(fā)展形成的一門新技術(shù)。這一技術(shù)可使許多分子雜交反應(yīng)同時進行。

DNA芯片技術(shù)：在面積不大(如2cm２)的基片表面分成不同小格有序地點陣排列于一定位置可尋址的核苷酸分子將待分析核苷酸分子標記(如用熒光)，變性成單鏈與芯片上序列相同的核苷酸分子雜交與芯片上序列不同的核酸分子被洗掉利用高精度的激光掃描儀記錄分子已雜交的熒光信號計算機軟件分析。第198頁/共219頁DNA芯片的基片：玻璃、硅片或尼龍等。應(yīng)用領(lǐng)域：基因多態(tài)性檢測（如單核苷酸多態(tài)性篩選singlenucleotidePolymorphisms，SNPs)；基因表達分析（不同細胞和不同組織的RNA群體比較）；

克隆選擇及文庫篩選（如cDNA文庫）；基因突變檢測及遺傳病和腫瘤的診斷等。第199頁/共219頁名詞術(shù)語半保留復(fù)制(semiconservativereplication)：

DNA復(fù)制的一種方式。每條鏈都可用作合成互補鏈的模板，合成出兩分子的雙鏈DNA，每個分子都是由一條親代鏈和一條新合成的鏈組成。

復(fù)制叉（replicationforks）：

Y字型結(jié)構(gòu)，在復(fù)制叉處作為模板的雙鏈DNA解旋，同時合成新的DNA鏈。

第200頁/共219頁前導(dǎo)鏈（leadingstrand）：

與復(fù)制叉移動的方向一致，通過連續(xù)地5ˊ→3ˊ聚合合成的新的DNA鏈。

滯后鏈（laggingstrand）：

與復(fù)制叉移動的方向相反，通過不連續(xù)地5ˊ→3ˊ聚合合成的新的DNA鏈。

岡崎片段(Okazakifragments)：

相對比較短的DNA鏈（大約1000核苷酸殘基），是在DNA的滯后鏈的不連續(xù)合成期間生成的片段，這是ReijiOkazaki在DNA合成實驗中添加放

射性的脫氧核苷酸前體觀察到的。

第201頁/共219頁單鏈結(jié)合蛋白（SSB，single-strandbindingprotein）:一種與單鏈DNA結(jié)合緊密的蛋白質(zhì)，它的結(jié)合可以防止復(fù)制叉處的單鏈DNA本身重新折疊回雙鏈區(qū)。遺傳學(xué)中心法則（geneticcentraldogma）:

描述從一個基因到相應(yīng)蛋白質(zhì)的信息流的途徑。遺傳信息貯存在DNA中，DNA被復(fù)制傳給子代細胞，信息被拷貝或由DNA被轉(zhuǎn)錄成RNA，然后RNA被翻譯成多肽鏈。不過由于逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)，也可以以RNA為模板合成DNA。

轉(zhuǎn)錄（transcription）:

在由RNA聚合酶和輔助因子組成的轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的催化下，從雙鏈DNA分子中拷貝生物信息生成單一一條RNA鏈的過程。

第202頁/共219頁模板鏈(templatestrand)：

可作為模板轉(zhuǎn)錄為RNA的那條鏈，該鏈與轉(zhuǎn)錄的RNA堿基互補（A-U,G-C）。在轉(zhuǎn)錄過程中，RNA聚合酶與模板鏈結(jié)合，并沿著模板鏈的3ˊ→5ˊ方向移動，按照5ˊ→3ˊ方向催化RNA的合成。

編碼鏈（codingstrand）：

雙鏈DNA中，不能進行轉(zhuǎn)錄的那條DNA鏈,該鏈的核苷酸序列與轉(zhuǎn)錄生成的RNA的序列一致（在RNA中是以U取代了DNA中的T）。

核心酶(coreenzyme)：

大腸桿菌的RNA聚合酶全酶由五個亞基（α2ββ'δ）組成，沒有δ亞基的酶叫核心酶。核心酶只能使已開始合成的RNA鏈延長，但不具有起始合成RNA的能力，必需加入δ亞基才表現(xiàn)出全部聚合酶的活性。

第203頁/共219頁RNA聚合酶(RNApolymerase)：

以一條DNA鏈或RNA為模板催化由核苷-5ˊ-三磷酸合成RNA的酶。

啟動子（promoter）:DNA分子中RNA聚合酶能夠結(jié)合并導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄起始的序列。

內(nèi)含子（introns）：

在轉(zhuǎn)錄后的加工中，從最初的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物除去的內(nèi)部的核苷酸序列。術(shù)語內(nèi)含子也指編碼相應(yīng)RNA內(nèi)含子的DNA中的區(qū)域。

第204頁/共219頁外顯子（exons）：

既存在于最初的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中，也存在于成熟的RNA分子中的核苷酸序列。術(shù)語外顯子也指編碼相應(yīng)RNA外顯子的DNA中的區(qū)域。

終止因子(terminationfactors)：

協(xié)助RNA聚合酶識別終止信號的輔助因子（蛋白質(zhì)）。核酶（ribozymes）：具有象酶那樣催化功能的RNA分子。

第205頁/共219頁翻譯（translation）：

在蛋白質(zhì)合成期間將存在于mRNA上代表一個多肽鏈的核苷酸殘基序列轉(zhuǎn)換為多肽鏈氨基酸殘基序列的過程。

遺傳密碼（geneticcode）:

核酸中的核苷酸殘基序列與蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基序列之間的對應(yīng)關(guān)系。連續(xù)的3個核苷酸殘基序列為一個密碼，特指一個氨基酸。標準的遺傳密碼是由64個密碼組成的，幾乎為所有生物通用。

起始密碼（iniationcodon）：

指定蛋白質(zhì)合成起始位點的密碼。最常見的起始密碼是蛋氨酸密碼：AUG。

終止密碼（terminationcodon）：

任何tRNA分子都不能正常識別的、但可被特殊蛋白結(jié)合并引起新合成的肽鏈從翻譯機器上釋放的密碼。存在三個終止密碼：UAG，UAA和UGA。

第206頁/共219頁密碼子(codon)：

mRNA（或DNA）上的三聯(lián)體核苷酸殘基序列，該序列編碼著一個指定的氨基酸，tRNA的反密碼子與mRNA的密碼子互補。

反密碼子（anticodon）: