微生物檢驗(yàn)肝炎病毒

肝炎病毒

HEPATITISVIRUS

侯玨

臨床微免教研室

目的要求1.掌握HAV、HBV、HCV、HDV、HEV的生物學(xué)特性2.掌握HAV、HBV、HCV、HDV、HEV病原學(xué)檢測(cè)常用的標(biāo)志物及其臨床意義3.熟悉HAV、HBV、HCV、HDV、HEV的臨床意義

概述侵害肝臟為主引起病毒性肝炎的一組病原體主要肝炎病毒及其相關(guān)病毒：

甲型肝炎病毒(HepatitisAVirus;HAV)

乙型肝炎病毒(HepatitisBVirus;HBV)

丙型肝炎病毒(HepatitisCVirus;HCV)

丁型肝炎病毒(HepatitisDVirus;HDV)

戊型肝炎病毒(HepatitisEVirus;HEV)

庚型肝炎病毒(GBV/HGV)TT病毒(TTVirus;TTV)

在法定報(bào)告?zhèn)魅静≈?病毒性肝炎始終處于首位

第一節(jié)甲型肝炎病毒

(HepatitisAVirus;HAV)

一、分類

小核糖核酸病毒科（Picornaviridae)

嗜肝RNA病毒屬(heparnavirus)

二、臨床意義所致疾?。杭仔透窝着R床表現(xiàn)：乏力，食欲下降，黃疸，肝功能異常（肝炎共同臨床表現(xiàn)）肝細(xì)胞損傷的機(jī)制

?

免疫病理損傷

?

病毒因素:小

致病特點(diǎn)

主要為糞－口途徑傳播潛伏期短30天發(fā)病急恢復(fù)快死亡率低8.06/10萬不形成攜帶者不轉(zhuǎn)為慢性不致肝癌

三、微生物學(xué)特性（一）病毒結(jié)構(gòu)：

球形直徑27~32nm

無包膜

20面體對(duì)稱核衣殼:含衣殼蛋白和病毒RNA

基因結(jié)構(gòu)和功能模式圖

?基因變異

?變異小

P1P2P35’NC3’NC編碼區(qū)（Codingregion;Openreadingframe,ORF)VP4VP2VP3VP12A2B2C3A3B3C3D多聚蛋白功能蛋白翻譯裂解結(jié)構(gòu)蛋白非結(jié)構(gòu)蛋白(二）基因組

單正鏈RNA，全長7478bp

基因：?jiǎn)喂烧淩NA,7478個(gè)核苷酸

組成5’端末端非編碼區(qū)（733個(gè)核苷酸）編碼區(qū)（6681）:P1、P2和P3三個(gè)功能區(qū)

3’端末端非編碼區(qū)64）5’末端非編區(qū):不編碼蛋白與病毒的感染和復(fù)制有關(guān)基因穩(wěn)定同源性高制備探針編碼區(qū):編碼結(jié)構(gòu)蛋白（衣殼蛋白VP1VP2,VP3，VP4),

各含氨基酸30022224623

非結(jié)構(gòu)蛋白（RNA多聚酶,蛋白酶）

三）易感動(dòng)物：狨猴、黑猩猩:輕度肝炎用于研究發(fā)病和免疫機(jī)制及對(duì)減毒活疫苗的毒力考核

敏感細(xì)胞：靈長類上皮和成纖維細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞（不引起細(xì)胞病變）HAV感染過程

HAV口腸血（病毒血癥）肝細(xì)胞內(nèi)增殖致?。ǔ霈F(xiàn)臨床癥狀）

潛伏期急性期Ab排毒量

通過膽汁隨糞便排出體外

排毒高峰四、微生物學(xué)檢測(cè)（一）病毒學(xué)標(biāo)志物

HAV顆粒，HAV-RNA，HAAg，抗-HAV-IgM

，抗-HAV-IgG（二）標(biāo)本

血清：HAV抗體、HAVRNA

糞便：HAV顆粒

HAV-RNAHAAg

（三）檢測(cè)方法1、檢測(cè)HAV顆粒：

直接電鏡檢測(cè)EM

免疫電鏡技術(shù)IEM

直接可確診急性HAV感染，有傳染性

費(fèi)時(shí)，繁瑣，設(shè)備要求高不適于大量標(biāo)本的檢測(cè)敏感性低僅用于潛伏期或早期

少用HAVparticlesfoundinfecalextractsbyimmunoelectronmicroscopy

HAV形態(tài)電鏡圖

糞便標(biāo)本負(fù)染X200000

2.檢測(cè)HAV抗原

RIAELISA抗原性強(qiáng)僅一個(gè)抗原型可確診HAV感染，有傳染性糞便中持續(xù)時(shí)間短缺乏商品化試劑盒3檢測(cè)核酸

RT-PCR

分子雜交法

敏感特異性強(qiáng)僅用于潛伏期或早期

可確診急性HAV感染，有傳染性

適合：感染早期，基因分型，水源、食物污染4、檢測(cè)抗體(HAV感染后的血清學(xué)標(biāo)志物)

抗原性穩(wěn)定,只有一個(gè)血清型針對(duì)VP的抗體是保護(hù)性抗體抗HAV-IgM

抗HAV-IgG（1）檢測(cè)HAV-IgM

：IgM抗體捕獲法單份血清競(jìng)爭(zhēng)法（2）檢測(cè)HAVIgG（或總抗體）

RIAELISA

雙份血清單份血清EE抗HAV-IgGHAVAg抗HAV-IgG.HRPS:抗HAV?

產(chǎn)生特點(diǎn)：無論顯性感染還是隱性感染,均能產(chǎn)生抗-HAV的IgM和IgG抗體抗-HAV-IgM：在急性期和恢復(fù)早期出現(xiàn)發(fā)病后1~2周內(nèi)出現(xiàn)，1~2個(gè)月迅速下降，

3個(gè)月后基本消失抗-HAV-IgG：恢復(fù)后期（病后3~12周）出現(xiàn)，有保護(hù)作用，維持終身（3）HAV血清學(xué)標(biāo)志物臨床應(yīng)用抗-HAV-IgM

：診斷甲肝最有價(jià)值指標(biāo)現(xiàn)癥感染有臨床診斷意義

抗-HAV-IgG：

單份血清：感染過甲肝，有免疫力有流行病學(xué)意義雙份血清：效價(jià)4倍或以上增高現(xiàn)癥感染

思考題

王××，男性,25歲乏力，食欲不振9天，鞏膜皮膚黃染4天。既往體健，否認(rèn)“肝炎”病史。體查:皮膚鞏膜中度黃染，未見蜘蛛痣、肝掌。腹軟，肝脾未捫及。血常規(guī):Hb120g/L，WBC8.5×109/L,N0.70,L0.30,尿常規(guī):URO+++，BIL+++肝功能:ALT>200IU/L,TBIL150.0μmol/L，DBIL60.0μmol/L問題：1.本例的診斷是什么?2.醫(yī)生疑甲肝，為協(xié)助病原學(xué)診斷，你認(rèn)為選用哪種（哪些）標(biāo)志物最合適?第三節(jié)丙型肝炎病毒

(HepatitisCVirus;HCV)

一、分類

黃病毒科肝炎病毒屬

二、臨床意義

傳播途徑:經(jīng)胃腸道外傳播(似HBV)潛伏期：15-150天傳播途徑：血液傳播、性接觸傳播、母嬰傳播、家庭內(nèi)接觸傳播等，但約半數(shù)途徑不明無癥狀HCV攜帶者和慢性丙肝者多見易感人群感染HCV后，慢性化的比例高達(dá)75%~85%占輸血后肝炎的80%~90%，是輸血后慢性肝炎和肝硬化的主要原因免疫力不牢固三、微生物特性

●

球形有包膜的RNA病毒，直徑50nm●

病毒基因?yàn)閱喂烧淩NA，鏈全長約10Kb

●

黑猩猩是HCV唯一敏感的動(dòng)物尚無理想的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)

CE1E2/NS1NS2NS3NS4aNS4bNS5aNS5bIRES核心蛋白Capsid包膜蛋白EnvelopeproteinsP7？Zn++蛋白酶Zn++protease絲氨酸蛋白酶SerineproteaseRNA螺旋酶RNAHelicase？IFN耐藥性?IFNResistance?(ISDR)RNA多聚酶RNA-dependantRNApolymeraseHCV基因結(jié)構(gòu)和功能示意圖：宿主蛋白酶：絲氨酸蛋白酶：Zn++蛋白酶5‘

HCV基因變異

RNA聚合酶缺乏校正功能

E2基因區(qū)存在兩個(gè)高變區(qū)，HVR1或HVR2

Simmonds等:6個(gè)主要基因型，多個(gè)(>80)基因亞型我國HCV基因型分布:1b、2a為優(yōu)勢(shì)流行基因亞型

有準(zhǔn)種感染（Quasispecies)

HCV基因變異的臨床意義

流行病學(xué)意義與HCV的致病性和發(fā)病機(jī)制有關(guān)與干擾素抗病毒治療效果有關(guān)四、微生物學(xué)檢測(cè)標(biāo)本：血液肝組織檢測(cè)方法免疫學(xué)方法：HCV抗體分子生物學(xué)方法：HCV-RNA

HCV感染后血清學(xué)標(biāo)志及檢測(cè)

標(biāo)志物：抗HCV

篩選試驗(yàn)：ELISA

血清免疫診斷試劑：5-1-1多肽、C100多肽等CE1E2/NS1NS2NS3NS4aNS4bNS5aNS5bELISA1RIBA1C100C1005-1-1ELISA2RIBA2C22-3C33CC100C33CC1005-1-1ELISA3RIBA3C22-3C33CC33CC100C1005-1-1NS5NS53～4M8～12W6～10W確證試驗(yàn)：重組免疫印跡法

主要用于ELISA初篩檢測(cè)可疑者

血清抗HCV非保護(hù)性抗體陽性代表HCV感染，不能嚴(yán)格區(qū)分HCV的現(xiàn)癥感染和既往感染；不能嚴(yán)格區(qū)分HCV的急性感染和慢性感染抗-HCV空窗期較長，一般出現(xiàn)于感染HCV后4-32周，抗-HCV陰性者有時(shí)不能完全排除HCV感染痊愈后仍有可能在血中檢測(cè)到抗-HCV，因此在單獨(dú)抗-HCV陽性時(shí)，還要結(jié)合其它指標(biāo)來判斷患者是否為現(xiàn)癥感染獻(xiàn)血者血液篩查

血清HCV-RNA檢測(cè)方法：

RT-PCR或熒光實(shí)時(shí)PCR

，bDNA（分支鏈DNA技術(shù)），

LCR（連接酶鏈反應(yīng)），NASBA（核酸順序放大技術(shù)）

陽性代表HCV感染，有病毒血癥，有傳染性感染HCV后1～3周，血清中即可檢測(cè)到HCVRNA

——早期診斷最有效指標(biāo)抗-HCV抗體陰性，不確定或血清學(xué)指標(biāo)與臨床表現(xiàn)不相符病例的診斷是干擾素抗病毒治療及療效監(jiān)測(cè)的主要標(biāo)志物病毒學(xué)應(yīng)答：（1）早期病毒學(xué)應(yīng)答（EVR）：指治療12周時(shí)血清HCVRNA定性檢測(cè)陰性（或定量檢測(cè)小于最低檢測(cè)限），或定量檢測(cè)降低2個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)(Log)以上。

(2)治療結(jié)束時(shí)病毒學(xué)應(yīng)答（ETVR）：即治療結(jié)束時(shí)定性檢測(cè)HCVRNA為陰性(或定量檢測(cè)小于最低檢測(cè)限)。

(3)SVR：即治療結(jié)束至少隨訪24周時(shí)，定性檢測(cè)HCVRNA陰性

(或定量檢測(cè)小于最低檢測(cè)限)；

(4)無應(yīng)答(NR)：指從未獲得EVR、ETVR及SVR者。

(5)復(fù)發(fā)(relapse)，即治療過程中HCVRNA轉(zhuǎn)陰，但停止治療后

HCVRNA再次轉(zhuǎn)為陽性.感染后時(shí)間急性丙型肝炎向慢性肝炎進(jìn)展的典型經(jīng)過肝組織免疫組化技術(shù):

可檢查肝細(xì)胞內(nèi)HCV核心抗原,NS3,NS5抗原肝組織分子生物學(xué)檢查:HCV-RNA(原位雜交;原位PCR)第五節(jié)戊型肝炎病毒

(HepatitisEvirus;HEV)一、病毒分類

肝炎病毒科肝炎病毒屬二、臨床意義

主要為糞－口途徑傳播由膽汁經(jīng)糞便排出體外多表現(xiàn)為急性戊型肝炎012345678MTYPProXHelRDRP？Capsid（A）N3151ORF3ORF2ORF1三、微生物學(xué)特性

結(jié)構(gòu)：球形，無包膜,直徑32～34nm

基因組：

7.2Kb，正單鏈RNA，含3個(gè)主要的ORF

HEV基因結(jié)構(gòu)模式圖基因分型：

7型

Ⅰ亞洲，北非分離株；Ⅱ墨西哥，南美州分離株

Ⅲ美國分離株（人，豬）；Ⅳ中國（包括臺(tái)灣）分離株

N意大利，西臘，西班牙，奧地利，阿根廷分離株易感動(dòng)物

靈長類動(dòng)物：黑猩猩、絨猴無滿意的細(xì)胞培養(yǎng)體系四、微生物學(xué)檢測(cè)1、標(biāo)本血清：糞便：2、檢查方法：顯微鏡檢迄今未用于臨床

免疫學(xué)方法：HEV抗體分子生物學(xué)方法：HEV-RNA

標(biāo)志物臨床意義抗HEV－IgM:

出現(xiàn)早，持續(xù)時(shí)間2~3個(gè)月陽性：近期HEV感染抗HEV-IgG:

出現(xiàn)較早（發(fā)病后20～30天）持續(xù)時(shí)間約（6~12月，4~5，14？年）*陽性——HEV感染(現(xiàn)癥或既往感染)*由陰轉(zhuǎn)陽，滴度由低轉(zhuǎn)高4倍以上

——現(xiàn)癥或近期HEV感染

用于流行病學(xué)調(diào)查、既往感染或疫苗接種效果評(píng)價(jià)SymptomsALTIgGanti-HEVIgManti-HEVVirusinstool012345678910111213HepatitisEVirusInfectionTypicalSerologicCourseTiterWeeksafterExposure

第二節(jié)乙型肝炎病毒(HepatitisBVirus;HBV)

低：北美、西歐、澳大利亞

中：東歐、地中海、日本、前蘇聯(lián)

高：熱帶非洲、東南亞、中國乙肝是危及亞洲人民生命的致命殺手之一

全世界有3.5億慢性乙肝病毒攜帶者，其中75％在亞洲

我國:“乙肝大國”，HBsAg陽性率7.18%

一、病毒學(xué)分類

嗜肝脫氧核糖核酸（DNA）病毒科(Hepadnaviridae)

正嗜肝DNA病毒屬(Orthohepadnavirus):（HBV,WHV,GSHV)

禽嗜肝DNA病毒屬(Avihepadnavirus):DHBV二、HBV感染特點(diǎn)

1潛伏期長70天2傳播途徑:經(jīng)胃腸道外傳播3發(fā)病慢恢復(fù)慢易轉(zhuǎn)為慢性4成年人多見5臨床類型復(fù)雜，無癥狀攜帶者多6整合肝癌

三、微生物學(xué)特性（一）形態(tài)結(jié)構(gòu)

小球形顆粒（smallsphericalparticle)：HBsAg（主），無核酸管形顆粒(tubuloseparticle)：聚合的小球型顆粒

Dane顆粒(Daneparticle)：完整的HBV病毒

電鏡下的HBV

病毒結(jié)構(gòu)和大小

包膜（HBsAg;大,中,小)HBV病毒顆粒

(Daneparticle)

HBcAg42nm核心DNAPHBV-DNA

（二）病毒的基因組

HBV基因組又稱HBV-DNA,3200bp

環(huán)狀,部分雙股DNA,分長(L),短(S)兩股

L鏈含4個(gè)開放讀碼區(qū)(Openreadingframe;ORF)

S

PreS1,Pre-S2,S

(PreS1,Pre-S2,

S

)

CC,Pre-C

ORFs

(HBcAg,HBeAg)

P

DNAp

(DNAp)

X

Xgene

(HBxAg)基因變異

HBV有逆轉(zhuǎn)錄的復(fù)制過程，基因變異率比一般DNA病毒高

PreC區(qū)變異:

C區(qū)第1896位核苷酸

TGG變?yōu)門AG——轉(zhuǎn)錄終止密碼子—不能表達(dá)HBeAg——逃避免疫—加重肝炎病情

HBeAg（-）

YMDD（酪氨酸-蛋氨酸-天門冬氨酸-天門冬氨酸）變異：

P區(qū)多聚酶基因變異，YVDD(蛋氨酸纈氨酸)或YIDD(蛋氨酸異亮氨酸)YMDD位于乙肝病毒DNA聚合酶上，是拉米夫定的主要作用位點(diǎn)基因分型（A-H型，共8型）

A型常見于歐洲、北美和非洲

B型和C型流行于亞洲

D型見于全世界

E型分布在非洲

F型見于南美和阿拉斯加

G型見于北美

H型存在于中美

（三)易感動(dòng)物

黑猩猩

無滿意的細(xì)胞培養(yǎng)體系

四、微生物學(xué)檢測(cè)

（一）標(biāo)本：血液肝組織（二）HBV感染標(biāo)志物（HBVMarkers;HBV-M)

?HBV的分子生物學(xué)標(biāo)記

HBV-DNA；HBVDNAp

?HBV抗原抗體系統(tǒng)

HBsAg/HBsAb(抗HBs)系統(tǒng)

HBeAg/HBeAb(抗HBe)系統(tǒng)

HBcAg/HBcAb(抗HBc)系統(tǒng)

HBxAg/HBxAb(抗HBx)系統(tǒng)（三）檢查方法：

1、HBV-DNA檢測(cè)

定性(斑點(diǎn)雜交,PCR)

定量(枝鏈DNA雜交,bDNA;熒光實(shí)時(shí)定量PCR)

臨床意義：有HBV感染有傳染性有HBV復(fù)制評(píng)價(jià)抗病毒治療效果

2、HBV抗原抗體檢測(cè)常用方法：ELISA項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)方法HBsAg夾心法抗HBs間接法HBeAg夾心法抗HBcIgM捕獲法抗HBc競(jìng)爭(zhēng)法抗HBe競(jìng)爭(zhēng)法

3、HBV標(biāo)志物臨床意義

HBsAg/抗HBs系統(tǒng)

HBsAg:HBV感染的證據(jù)不代表病毒復(fù)制

抗HBs:HBV感染后唯一的保護(hù)性抗體

空窗期：HBV急性感染的恢復(fù)期

HBsAg消失，抗HBs

尚未出現(xiàn)的空隙期

出現(xiàn)時(shí)間：HBV感染后2～6周持續(xù)時(shí)間：急性6個(gè)月內(nèi)可消失慢性或攜帶者可持續(xù)陽性

HBeAg/抗HBe系統(tǒng)

HBeAg:

HBVDNA復(fù)制時(shí)產(chǎn)生的一種可溶性蛋白可游離存在于血液中與HBVDNA聚合酶消長情況一致,為病毒復(fù)制及

強(qiáng)傳染性的指標(biāo)

血清HBeAg陽性者中，HBVDNA陽性率為92%左右抗HBe:?

出現(xiàn)時(shí)間：隨著HBeAg的消失而出現(xiàn)

?急性HBV感染：康復(fù)的表現(xiàn),常伴有抗HBc和/或抗

HBs的陽性,肝功能正常,無癥狀?慢性HBV感染：病毒復(fù)制降低，傳染性下降

HBVPreC基因變異：HBeAg陰性，通常有HBsAg、抗HBe和HBVDNA陽性

HBsAg（+）、HBeAg（-）、抗HBe（+）

、抗HBc（+）

HBVDNA（+）

HBcAg/抗HBc系統(tǒng)

HBcAg:

肝細(xì)胞內(nèi)和HBV病毒顆粒中不易在血液中檢出陽性表明病毒在復(fù)制，血清具有傳染性抗-HBc抗HBc-IgM：是HBV近期感染或慢性感染者病毒活動(dòng)的標(biāo)志抗HBc-IgG：出現(xiàn)遲，持續(xù)保持多年凡“有過”

HBV感染者均可陽性

急性感染恢復(fù)期慢性HBV持續(xù)性感染HBcAg的免疫原性最強(qiáng)持續(xù)時(shí)間：6～18個(gè)月抗HBc——非中和抗體，無保護(hù)力

HBV感染標(biāo)志物用途

①乙肝診斷②判斷傳染性③判斷預(yù)后HBsAg抗HBc持續(xù)+轉(zhuǎn)慢④篩選獻(xiàn)血員⑤流行病學(xué)調(diào)查

HBV感染的血清復(fù)制指標(biāo)

HBVDNA;HBVDNApHBeAg;HBcAg;

高滴度抗HBc；IgM抗HBc乙肝●介紹幾個(gè)概念：①“兩對(duì)半”②血清抗原—抗體轉(zhuǎn)換：HBeAg抗-HBe

③“轉(zhuǎn)陰”常用指標(biāo)：血清HBeAg抗原—抗體轉(zhuǎn)換

HBVDNA陰轉(zhuǎn)HBsAg，HBeAg，抗-HBs，抗-HBe，抗-HBc

“大三陽”：HBeAg(+)，表示機(jī)體內(nèi)病毒復(fù)制活躍，傳染性強(qiáng)

HBsAg（+）、HBeAg（+）、抗HBc（+）“小三陽”：HBeAb(+)，表示：非變異株時(shí):機(jī)體內(nèi)病毒復(fù)制不活躍變異株產(chǎn)生時(shí):病毒毒力增加（即機(jī)體免疫反應(yīng)性下降）,病情反復(fù)，進(jìn)展較快，甚至發(fā)展為肝硬化和肝癌癥或重癥肝炎）變異株：HBsAg（+）、HBeAg（-）、抗HBe（+）

、抗HBc（+）HBVDNA（+）“大三陽”和“小三陽”？*借助乙肝病毒抗原和抗體的測(cè)定，并不能代表病毒本身，也無法知道病毒的多少*無特異指標(biāo)區(qū)分急、慢性HBV感染，強(qiáng)調(diào)動(dòng)態(tài)觀察HBV-M乙肝標(biāo)志物檢驗(yàn)的缺點(diǎn)急性HBV感染的血清感染標(biāo)志物變化模式IgManti-HBcTotalanti-HBcHBsAgAcute(6months)HBeAgChronic(Years)anti-HBe0481216202428323652YearsWeeksafterExposureTitreProgressiontoChronicHepatitisBVirusInfectionTypicalSerologicCourse結(jié)果分析HBsAg（-）、抗HBs（+）、HBeAg（-）、抗HBe（+）、抗HBc（+）、抗HBc-IgM（-）HBsAg（+）、抗HBs（-）、HBeAg（+）、抗HBe（-）、抗HBc（+）、抗HBc-IgM（-）HBsAg（+）、抗HBs（-）、HBeAg（-）、抗HBe（+）、抗HBc（+）、抗HBc-IgM（-）HBsAg（-）、抗HBs（+）、HBeAg（-）、抗HBe（-）、抗HBc（-）、抗HBc-IgM（-）新生兒臍帶血：HBsAg（-）、抗HBe（+）、抗HBc（+）、HBeAg（-）、抗HBc-IgM（-）3、肝組織病原學(xué)檢查

肝組織免疫組化技術(shù):可檢查肝細(xì)胞內(nèi)HBsAg