干細(xì)胞及成體細(xì)胞

關(guān)于干細(xì)胞及成體細(xì)胞第一頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一2干細(xì)胞的研究史1996年7月5日，蘇格蘭愛丁堡市郊的羅斯林研究所應(yīng)用細(xì)胞核轉(zhuǎn)移技術(shù)克隆了一頭大個兒羊羔，伊恩·威爾默特以著名鄉(xiāng)村歌手多利·帕頓的名字命名這頭羊。第二頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一3細(xì)胞核轉(zhuǎn)移技術(shù)第三頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一第一節(jié)概述第四頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一干細(xì)胞（stemcell）是一類具有自我更新能力和多向分化潛能的未分化或低分化原始細(xì)胞群體，也稱為“萬能細(xì)胞”。

通常呈圓形或橢圓形，細(xì)胞體積小，核相對較大，細(xì)胞核多為常染色質(zhì)，并具有較高的端粒酶活性，不同干細(xì)胞有各異的蛋白質(zhì)標(biāo)志分子，可作為確定干細(xì)胞位置、分離提純干細(xì)胞的標(biāo)志。一、干細(xì)胞的定義第五頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一二、干細(xì)胞的增殖特征1.增值緩慢性(1)利于干細(xì)胞對外界信號作出反應(yīng)，以決定細(xì)胞的發(fā)展方向—增殖或分化。(2)減少基因突變的危險。增殖緩慢使干細(xì)胞有時間發(fā)現(xiàn)并糾正處于增殖周期過程中的錯誤。2.自穩(wěn)定性指干細(xì)胞可在個體生命過程中自我更新并維持其自身數(shù)目恒定。干細(xì)胞通過其特有的分裂方式維持自穩(wěn)定性。第六頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一干細(xì)胞的分裂方式干細(xì)胞有對稱與不對稱兩種分裂方式。不對稱分裂的結(jié)果使兩個子細(xì)胞一個成為早起祖細(xì)胞；另一個保持干細(xì)胞的特征。意義：①使機體對干細(xì)胞的調(diào)控更靈活，以適應(yīng)機體的生理變化。②要求機體對干細(xì)胞分裂的調(diào)控更精確，以保持干細(xì)胞數(shù)目恒定。第七頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一（一）按其分化潛能的大小，干細(xì)胞可分為三類：一是全能干細(xì)胞，二是多能干細(xì)胞，三是單能干細(xì)胞。二、干細(xì)胞的分化特征（1）全能干細(xì)胞（totipotentstemcells）指具有分化為組成生命個體所有類型細(xì)胞能力的細(xì)胞。如：胚胎干細(xì)胞（2）多能干細(xì)胞（pluripotentstemcell）指具有產(chǎn)生多種類型分化細(xì)胞的能力，但失去發(fā)育為完整個體的能力的一類干細(xì)胞，即只能分化成特定組織或器官等特定族群的細(xì)胞。如：骨髓造血干細(xì)胞第八頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一（3）單能干細(xì)胞（multipotentstemcell）也叫專能、偏能干細(xì)胞，指除了自我復(fù)制外，只能分化為一種類型子代類型的一類細(xì)胞。如肌肉中的成肌細(xì)胞等。第九頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一10全能干細(xì)胞多能干細(xì)胞單能干細(xì)胞第十頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一11胚胎（5-7天）受精卵胚胎胎組織成人第十一頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一（二）根據(jù)干細(xì)胞的來源，可分為胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞、其他誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。（1）來源于胚胎——胚胎干細(xì)胞ESC（EmbryonicStemCell）指來源于哺乳類動物胚胎發(fā)育早起囊胚期內(nèi)細(xì)胞團細(xì)胞，在體外培養(yǎng)條件下，具有體外無限復(fù)制和分化為體內(nèi)任何種類細(xì)胞的潛能。如：ES細(xì)胞、EG細(xì)胞、EC細(xì)胞等。第十二頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一（2）來源于成體——成體組織來源的干細(xì)胞ASC（AdultStemCell）是指那些分布在成體組織中尚未分化的、具有自我更新、并負(fù)有構(gòu)建和補充某種組織的各種類型細(xì)胞潛能的干細(xì)胞，又稱為組織特異性干細(xì)胞（Tissue-specificstemcell）。它們主要用于維持細(xì)胞功能的穩(wěn)定，具有修復(fù)和再生能力，能夠產(chǎn)生新的干細(xì)胞，或者能按一定的程序分化，形成新的功能細(xì)胞，使組織和器官保持生長和衰退的動態(tài)平衡。如：神經(jīng)干細(xì)胞，表皮干細(xì)胞。第十三頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一（3）誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（inducedpluripotentstemcell，iPSC）來源于終末分化的體細(xì)胞，通過重編程，逆向轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗄艿母杉?xì)胞。第十四頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一15第十五頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一第二節(jié)成體干細(xì)胞的分離培養(yǎng)第十六頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一一、成體干細(xì)胞的來源骨髓、血液、角膜、視網(wǎng)膜、腦、骨骼肌、牙髓、肝臟、皮膚、胃腸道上皮、胰腺和脂肪特點：多向分化、自我更新、可塑性第十七頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一第十八頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一成體干細(xì)胞的優(yōu)點：（1）獲取相對容易；（2）源于患者自身的成體干細(xì)胞在應(yīng)用時不存在組織性相容的問題，避免了移植排斥反應(yīng)和使用免疫抑制劑；（3）胚胎干細(xì)胞分化具有“非定位性”，目前，尚不能控制胚胎干細(xì)胞在特定部位分化成相應(yīng)的細(xì)胞，容易導(dǎo)致畸胎瘤。理論上，成體干細(xì)胞致瘤風(fēng)險低，所受倫理學(xué)爭議較少；（4）成體干細(xì)胞也具有類胚胎干細(xì)胞的多向分化潛能。第十九頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一造血干細(xì)胞（HematopoieticStemCells，HSC）指具有自我更新能力和多向分化潛能的最原始的造血細(xì)胞。造血干細(xì)胞的來源：骨髓、外周血、臍帶血、胎兒造血系統(tǒng)。一、造血干細(xì)胞第二十頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一不同來源造血干細(xì)胞的比較：第二十一頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一第二十二頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志人的造血干細(xì)胞表面標(biāo)志包括CD34+、CD38－、Lin－、Thy-1+、Sca-1+、HLA-DR+、LFA-1+、CD45RA－、CD71－等。人類造血干細(xì)胞還對5-氟脲嘧啶和4-氫過氧環(huán)磷酰胺有抗性。表面標(biāo)志比較多，臨床上應(yīng)用最多的是CD34。還可與激酶插入?yún)^(qū)域受體KDR(kinaseinsertdomainrecepter)配合鑒定造血干細(xì)胞和造血祖細(xì)胞。造血干細(xì)胞：CD34+KDR+造血祖細(xì)胞：CD34+KDR-第二十三頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一根據(jù)造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志，可通過免疫細(xì)胞化學(xué)、流式細(xì)胞儀、分子雜交和PCR等多種細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)手段來檢測造血干細(xì)胞?，F(xiàn)大多仍然基于對CD34+細(xì)胞的富集來篩選造血干細(xì)胞。方法：密度梯度離心、拒染和抗原標(biāo)志物進行密度梯度離心、流式細(xì)胞分選、免疫磁珠分離、平面黏附分離等造血干細(xì)胞的分離純化第二十四頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一（1）流式細(xì)胞分選流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytoMetry，F(xiàn)CM）是對懸液中的單細(xì)胞或其他生物粒子,通過檢測標(biāo)記的熒光信號，實現(xiàn)高速、逐一的細(xì)胞定量分析和分選的技術(shù)。原理：使懸浮在液體中分散的經(jīng)熒光標(biāo)記的細(xì)胞或微粒逐個通過樣品池，同時由熒光探測器捕獲熒光信號并轉(zhuǎn)換成分別代表前向散射角、側(cè)向散射角和不同熒光強度的電脈沖信號，經(jīng)計算機處理形成相應(yīng)的點圖，直方圖和加三維結(jié)構(gòu)圖像進行分析。第二十五頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一第二十六頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一第二十七頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一（2）免疫磁珠分離免疫磁珠法分離細(xì)胞是基于細(xì)胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結(jié)合，在外加磁場中，通過抗體與磁珠相連的細(xì)胞被吸附而滯留在磁場中，無該種表面抗原的細(xì)胞由于不能與連接著磁珠的特異性單抗結(jié)合而沒有磁性，不在磁場中停留，從而使細(xì)胞得以分離。第二十八頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一第二十九頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一免疫磁珠法分為陽性分離法和陰性分離法：陽性分離法－磁珠結(jié)合的細(xì)胞就是所要分離獲得的細(xì)胞陰性分離法－磁珠結(jié)合不需要的細(xì)胞，游離于磁場的細(xì)胞為所需細(xì)胞一般而言，陰性分離法的磁珠用量比陽性分離法的大，陽性分離法用行更多。第三十頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一造血干細(xì)胞的檢測方法

確認(rèn)小鼠造血干細(xì)胞的唯一標(biāo)準(zhǔn)仍然是多年來一直沿用的長期體內(nèi)重建造血能力（Long-termrepopulation,LTR）檢測。綿羊子宮內(nèi)胎羊移植系統(tǒng)。該系統(tǒng)是在胎羊免疫系統(tǒng)發(fā)育前于子宮內(nèi)將造血細(xì)胞移植給胚胎羊，在小羊出生后，通過追蹤其體內(nèi)不同血細(xì)胞系的分布和比例來判斷移植的造血干細(xì)胞是否具有長期重建多系造血的能力第三十一頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一二、間充質(zhì)干細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymalstemcell，MSC）是指中胚層來源的具有多向分化潛能的一類多能型干細(xì)胞的統(tǒng)稱。來源：個體發(fā)育中的骨髓腔通過流式細(xì)胞儀分析，特異性表面抗原有：SH2、SH3、CD90、CD71、CD44等。第三十二頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一分化潛能間充質(zhì)干細(xì)胞可分化為多種間充質(zhì)組織第三十三頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一16MSC在低血清培養(yǎng)基中具貼壁優(yōu)勢特性，定期換液除去不貼壁細(xì)胞，可純化及擴增MSC差速貼壁法根據(jù)骨髓中各細(xì)胞成分比重的不同，分離單核細(xì)胞進行貼壁培養(yǎng)密度梯度離心法MSC的主要分離手段流式或磁珠分選后的細(xì)胞出現(xiàn)增殖緩慢，成本較高、技術(shù)難度較大，限制了這些方法的廣泛應(yīng)用流式細(xì)胞儀法、免疫磁珠法第三十四頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一35全骨髓標(biāo)本

分離方法培養(yǎng)

約24h后

未黏附細(xì)胞：造血干細(xì)胞、造血后代細(xì)胞黏附細(xì)胞：即為MSC呈紡錘形脂肪、皮膚骨髓抽提物取1.073/ml密度界面上的細(xì)胞，貼壁生長的細(xì)胞中95~98%為MSC。根據(jù)細(xì)胞表面抗原獲得MSC。（一）差速貼壁法第三十五頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一（二）密度梯度離心法利用不同顆粒之間存在沉降系數(shù)差時，在一定離心力作用下，顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同區(qū)域上形成區(qū)帶的方法。

第三十六頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一MSC的應(yīng)用

由于間充質(zhì)細(xì)胞在體外可以相對容易地誘導(dǎo)出骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞，可在骨損傷、先天性骨畸形有治療中有廣泛應(yīng)用。分離方便、擴增迅速?？裳芯吭诜只^程中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)、基因表達的差異等，為進一步闡明其中的分化機理奠定基礎(chǔ).第三十七頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一第三節(jié)干細(xì)胞的應(yīng)用研究第三十八頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一一、移植研究—恢復(fù)器官功能1．細(xì)胞治療。干細(xì)胞可恢復(fù)因重大疾病而損害的細(xì)胞，這是干細(xì)胞潛在的最大優(yōu)勢。由于喪失正常細(xì)胞功能的疾病都可以通過移植由胚胎干細(xì)胞分化來的特異組織細(xì)胞來治療。因為成年人的心臟和胰島幾乎沒有干細(xì)胞，無法靠自身得到修復(fù)?？梢杂萌梭w胚胎干細(xì)胞能直接分化成相應(yīng)細(xì)胞進行移植。第三十九頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一2．基因治療。即通過胚胎干細(xì)胞和基因工程技術(shù)，矯正缺陷基因。因干細(xì)胞能自我復(fù)制更新，是基因治療的理想靶細(xì)胞。將治療基因整合到干細(xì)胞，再將干細(xì)胞移植入人體中，能夠持久地發(fā)揮作用，而不擔(dān)心像分化的細(xì)胞那樣，在細(xì)胞更新中可能丟失治療基因的結(jié)果。