海帶多糖的體外抗氧化活性研究

海帶多糖的體外抗氧化活性研究周娟，吳宏，劉青，捷明【內容摘要】目的研究海帶多糖體外抗氧化作用。方法采取體外實驗研究海帶多糖對羥自在基、超氧陰離子的去除作用以及對h2o2誘導的紅細胞氧化溶血和大鼠肝勻漿脂質過氧化的保衛(wèi)作用。結果海帶多糖體外可去除o-2·及·oh;抑制h2o2誘導的大鼠紅細胞氧化性溶血;抑制小鼠組織mda的生成。結論海帶多糖體外具有去除自在基及抗脂質過氧化的作用?！颈疚年P鍵詞語】海帶多糖;氧自在基;脂質過氧化;抗氧化abstract:objectivetostudytheantioxidativeactivitiesoflaminarininvitro.methodstheantioxidantcapacityoflaminarinwasinvestigatedbyinvitroassay.thescavengingeffectoflaminarinonoxygenradicalsanditsinhibitoryeffectonlipidperoxidationwerestudied.inaddition,inhibitingeffectoflaminarinonh2o2inducedhemolysisofraterythrocyteswasstudiedaswell.resultslaminarinexhibitedadosedependentinhibitoryeffectonthehydroxylfreeradicalandsuperoxideanionfreeradical.italsoshowedsubstantialantioxidantactivityinhomogenatesofthemiceliverandheartinadosedependentmanner.theautohaemolysisofmiceredbloodcellswasblockedbylaminarininadosedependentmanner.conclusionlaminarinshowsantioxidantactivityinexperimentsinvitro.keywords:laminarin;oxygenradical;lipidperoxide;antioxidation海帶屬海帶目海帶科，含有多種生物活性成分，其大部分生物活性與其中的多糖成分親密相關[1]。海帶多糖(laminarin)是從海帶中提取出來的多糖類化合物。梁桂林[2]等對海帶多糖進行體內抗氧化研究，結果表示清楚海帶多糖在體內具有抗氧化活性。本文對海帶多糖的體外抗氧化作用進行了討論。1材料與方法1.1材料海帶多糖的提取、純化及紙層析鑒定法按文獻[3]制備。將市售干海帶適度粉碎,用蒸餾水浸泡,加熱提取,冷卻離心,濃縮,濃縮液參加4倍體積的95%乙醇沉淀,沉淀物依次用無水乙醇、丙酮及乙醚洗滌,用蒸餾水復溶,透析,seveg法除蛋白,慣例枯燥得海帶多糖。紙層析分析表示清楚,海帶多糖由葡萄糖、半乳糖、木糖等構成。硫酸-苯酚法測多糖含量為85%，考馬司亮藍法測定總蛋白含量。硫代巴比妥酸購自國藥集團化學試劑(批號：20080925);肝素為萬邦醫(yī)藥(批號：0812111);抗壞血酸為福州海王福藥制藥產品(批號：0901042);硫酸亞鐵、過氧化氫、三氯乙酸等均為市售分析純試劑。752n紫外分光光度計(上海精致細密科學儀器);tdl60b臺式離心機(上海安亭科學儀器廠);bs124s分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng));hhs數顯恒溫水浴鍋(常州市國立試驗設備研究所);xhc旋渦混合器(常州市國立試驗設備研究所)。實驗動物為昆明種清潔級小鼠10只，體質量18～22g，雌雄各半，由福州海王福藥制藥提供，答應證號：scxk(閩)20050003。1.2方法1.2.1海帶多糖去除·oh效果的測定根據smirnoff等的方法改良[4]，用feso4+h2o2產生·oh，以·oh氧化水楊酸所得產品的吸光值表示·oh的多少，吸光值越大，·oh越多。4ml反應體系中含9mmol/lfeso41ml，8.8mmol/lh2o21ml，9mmol/l水楊酸1ml(用50%乙醇作溶劑)及1ml不同濃度的海帶多糖，最后加h2o2啟動反應，37℃溫浴1h，于510nm測吸光值?？瞻捉M以重蒸水代替水楊酸和海帶多糖，對照組以重蒸水代替海帶多糖。去除率以[a0-(ai-ai0)]/a0×100%計算，其中a0為對照，ai為海帶多糖某濃度時的吸光值，ai0為空白組的吸光值。1.2.2海帶多糖去除o-2效果的測定[5]每支試管加trishcl緩沖液(ph8.2)4.5ml，25℃預熱20min，加1ml不同濃度的海帶多糖，再加10mmol/l的鄰苯三酚0.4ml，立即搖勻，精確反應4min，立即參加8mol/lhcl0.1ml終止反應，325nm測吸光值。空白組以重蒸水代替鄰苯三酚和海帶多糖，對照組以重蒸水代替海帶多糖。去除率以(a0-ai)/(a0-ai0)×100%計算，其中a0為對照，ai為海帶多糖某濃度時的吸光值，ai0為空白組的吸光值。1.2.3海帶多糖對小鼠紅細胞h2o2所致溶血的影響[6]小鼠頸總動脈采血，肝素抗凝，4℃3000×g離心得紅細胞，冷生理鹽水洗3次，制成0.5%懸浮液。取紅細胞懸液1ml,加不同濃度的海帶多糖，最后加50mmol/lh2o20.5ml混勻，37℃溫浴1h，加生理鹽水4ml，3000r/min離心5min，取上清于415nm測定其吸光值。正常組以生理鹽水代替h2o2和海帶多糖，模型組以生理鹽水代替海帶多糖。以模型組為100%溶血，計算溶血度及抑制率。1.2.4海帶多糖對生成mda抑制造用的測定小鼠頸椎脫臼致死，迅速分離出肝組織和心組織，用冷的生理鹽水洗凈后稱重，冰浴下勻漿，制成含蛋白質0.5%的懸浮液。取5%肝/心勻漿懸浮液0.2ml，參加不同濃度海帶多糖溶液1ml，在37℃溫浴1h后，參加20%tca1ml終止反應,再加0.67%tba1ml，于沸水浴中顯色15min，冷卻后離心，測532nm上清液吸光度，以吸光度表示mda含量的多少。對照組以重蒸水代替海帶多糖，去除率以(a0-ai)/a0×100%計算，其中為a0為對照，ai為海帶多糖某濃度時的吸光值。1.2.5海帶多糖對fe2+h2o2誘導的小鼠肝線粒體中mda生成的影響肝組織于在冰浴下以生理鹽水制成10%勻漿，2000r/min離心20min，取上清液，以10000×g離心20min,沉淀用生理鹽水洗滌2次后,以生理鹽水配成吸光值在0.5～0.6的線粒體懸浮液[7]。取肝線粒體懸浮液2.5ml，參加不同濃度海帶多糖溶液0.4ml，再參加1mmol/lfeso40.1ml，1mmol/lh2o20.1ml，在37℃溫浴1h后，取0.1ml溫育后的各管溶液，參加20%tca1ml終止反應，再加0.67%tba1ml，于沸水浴中顯色15min，冷卻后離心，于532nm測上清液吸光值。對照組以重蒸水代替海帶多糖，去除率如“1.2.4〞計算。1.3統(tǒng)計學處理實驗結果以(±s)表示，進行組間t檢驗，以p0.05為差別有顯著性。2結果與分析2.1海帶多糖對·oh的去除作用·oh是活性氧中活性最高且造成損傷最大的一種，它能夠與生物體內的多種分子作用，造成糖類、蛋白質、核酸和脂類等物質的氧化性損傷，造成細胞壞死或突變。羥自在基去除率是反映藥物抗氧化作用的主要指標。本實驗結果表示清楚，海帶多糖對·oh有去除作用，且其去除率隨海帶多糖的劑量的增長而增大，呈一定的量效關系(表1)。表1海帶多糖對·oh的去除作用2.2海帶多糖對o-2的去除作用o-2是活性氧的一種，在體內由過氧化物歧化酶去除，假如體內過氧化物歧化酶活力下降或o-2產生過量都會給機體造成危害。本實驗結果顯示，海帶多糖對o-2的去除作用與海帶多糖的劑量呈一定的量效關系，當海帶多糖的濃度為10.00mg/ml時，能夠顯著抑制o-2的產生(表2)。表2海帶多糖對o-2的去除作用2.3海帶多糖對小鼠紅細胞溶血的影響h2o2為強氧化劑，能夠毀壞紅細胞膜而導致血紅蛋白溢出出現溶血，本實驗觀察了海帶多糖對h2o2誘導的紅細胞氧化溶血的影響。結果顯示，海帶多糖對h2o2誘導的紅細胞溶血具有明顯的抑制效果(表3)。表3海帶多糖對紅細胞氧化溶血的影響2.4海帶多糖對小鼠心、肝及肝線粒體脂質過氧化產品生成的影響mda為脂質過氧化產品，其生成的多少能夠反映出組織細胞的受損水平，本實驗測定了海帶多糖對小鼠心、肝勻漿及肝線粒體中mda生成的影響。結果顯示，海帶多糖能夠有效抑制小鼠心臟、肝臟組織勻漿及肝亞細胞脂質過氧化的發(fā)生，且mda的抑制率隨海帶多糖濃度的增長而提升(表4～6)。表4海帶多糖對小鼠心mda生成的影響表5海帶多糖對小鼠肝勻漿中mda生成的影響表6海帶多糖對小鼠肝線粒體中mda生成的影響3討論活性氧自在基(reactiveoxygenspecies，ros)包含h2o2、·oh、o-2等是在人體內新陳代謝的中間產品。一般來說，在人的正常新陳代謝中，ros的產生和去除堅持著動態(tài)平衡[8]。當機體內的誘導物誘導氧化能力跨越抗氧化物抗氧化能力時，就會引發(fā)細胞死亡并導致組織的損害。當前發(fā)現ros與人類多種疾病的發(fā)病機理相關，如癌癥、衰老和動脈慢性病[9]。因而，醫(yī)藥領域一直在不斷探尋求索和利用抗氧化物質來去除ros來阻攔氧化損害，而天然的抗氧化物質具有低毒的特點，一直是學者研究的熱門。本實驗研究表示清楚,海帶多糖體外可去除o-2及·oh，抵抗小鼠紅細胞的氧化性溶血，抑制小鼠心、肝及肝線粒體中mda的生成，具有去除自在基及抗脂質過氧化的作用,是一種天然抗氧化劑。我們國家海域遼闊，海帶資源特別豐富，收集和養(yǎng)殖工藝簡單。本試驗對于海帶多糖的研究、開發(fā)、利用提供了實驗根據?！疽韵聻閰⒖嘉墨I】[1]鄧長江,朱希強,郭學平.海帶多糖藥理作用的研究進展[j].食品與藥品,2006,8(4):30-32.[2]梁桂寧,謝露,胡世鳳，等.海帶多糖對應激小鼠腎組織抗氧化能力的影響[j].現代醫(yī)藥衛(wèi)生,2006,(18):2783-2784.[3]高夢祥,葉森.海帶多糖的提取工藝研究[j].長江大學學報:天然科學版,2005,2(5):73-76.[4]smirnoffn,cumbesq.hydroxylradicalscavengingactivityofcompatiblesolutes[j].phytochemistry,1989,28(4):1057-1060.[5]王書芳,王勤,潘靜.吡咯啉氮氧自在基及衍生物抗大鼠不同組織脂質過氧化損傷[j].中國藥理學通報,2001,17(4):424-427.[6]田京偉,楊建.白藜醇苷體外抗氧化活性[j].中草藥,2001,32(10):978-980.[7]曹煒,尉亞輝,楊建雄.蜂膠對氧自在基和四氧嘧啶致小鼠肝臟損傷的保衛(wèi)作用[j].中藥材,2001,32(11):1013-1015.[8]p