血管文章正文定題目非干細(xì)胞樣的肺腺癌可形成腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞

題目：非干細(xì)胞樣的肺細(xì)胞可形成腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)：：RongWang等研究表明，膠質(zhì)瘤樣干細(xì)胞能分化為內(nèi)皮細(xì)胞參與膠質(zhì)瘤血管的形成，而膠質(zhì)瘤細(xì)胞系卻不能形成內(nèi)皮細(xì)胞。然而，我們的研究表明，在ND/SCID小鼠身上接種非干細(xì)胞樣的肺腺癌細(xì)胞A549(C133/CD3/CD10)形成的腫瘤血管中有人的內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生。非干細(xì)胞樣的A549產(chǎn)生的肺癌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞均無干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記分子CD133和干細(xì)胞相關(guān)的mir（miA54在體外內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基條件下也能非干細(xì)胞樣的肺細(xì)胞能轉(zhuǎn)化成內(nèi)皮細(xì)胞這將提示腫瘤細(xì)胞非干細(xì)胞樣的A549(CD133-/CD31-/CD105-)是肺細(xì)胞克隆(CD133-源性和鼠源性EndoglinPCR產(chǎn)物片段分子量2產(chǎn)物進(jìn)序所得序列與genbank中人與小鼠的序列比對完全一致(序列見附件)。Westernblot結(jié)果顯示，NOD/SCID小鼠皮下接種A549成瘤組織中既有鼠CD105分子的表達(dá)也有人CD105分子的表達(dá)（圖3。進(jìn)一步采用免疫組織化學(xué)分析發(fā)現(xiàn)NOD/SCID小鼠皮下接種A549成瘤組織的血管中有人血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記分子4圖1流式結(jié)果檢查表明非干細(xì)胞樣的A549CD133，也

2EndoglinPCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖：1.MarkerI2.EndoglinPCR396bp;3.EndoglinPCR

3EndoglinWesternblot結(jié)果圖：1.MarkerI，2.liver:肝細(xì)胞作為對照，3.tumor:腫瘤組織，hCD105Endoglin蛋白，mCD105Endoglin圖4ASCID種植 圖4BSCID種植44AA5494BLLC成瘤組織為實驗對照組，顯示信號。為了進(jìn)一步弄清楚NOD/SCID小鼠皮下接種非干細(xì)胞樣的A549成瘤組織FISH核型驗證方法進(jìn)行分析。FISH檢測結(jié)果顯示，磁珠分選獲得的CD31+人血管內(nèi)皮細(xì)胞具有非干細(xì)胞樣的肺細(xì)胞系A(chǔ)549的核型，非干細(xì)胞樣的肺細(xì)胞A549和CD31+血管內(nèi)皮細(xì)胞均顯示非整倍體核型，EGFR、MYC和MDM2[2]（紅色信號）和其所在（綠色信號）都有不同程度的擴(kuò)增，對照組（正常人外周巴細(xì)胞）顯示二倍體核型（5NOD/SCID小鼠皮下接種非干細(xì)胞樣的A549A549細(xì)胞非干細(xì)胞樣的A549非干細(xì)胞樣的A549細(xì)胞株分選CD31+巴細(xì)胞圖 FISH核型驗證結(jié)果RongWang等研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中內(nèi)皮細(xì)胞可由膠質(zhì)瘤樣干細(xì)胞分化而來[3,4]。microRNA22ntRNA，在細(xì)胞的增殖、分化等方A549NOD/SCIDNOD/SCID小miR-302b[5-9]。非干細(xì)胞樣的A549細(xì)胞樣品標(biāo)記為A549；從荷瘤NOD/SCIDTumourTable1.TheprimersusingforreversetranscriptionreactionandtativeRT-RTForward6miR-302amiR-302bRPMI-1640培養(yǎng)基(standardmedium)在體CD31RPMI-1640CD31分子的表達(dá)(Figure7a)。細(xì)胞熒光染色實驗檢胞培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下具有形成血管管腔結(jié)構(gòu)的能力。(Figure7c，F(xiàn)igure7d)。圖7：A549是在體外分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞檢測結(jié)果圖：U293T作為對照細(xì)胞，HMEC-1GFPA549為實驗組RongWang等研究表明膠質(zhì)瘤樣干細(xì)胞能分化為內(nèi)皮細(xì)胞參與膠質(zhì)瘤血管A549是從肺細(xì)胞系中篩選出來的非干細(xì)胞樣的細(xì)胞克隆，這些非干細(xì)胞樣的A549能分化為內(nèi)皮細(xì)胞參與肺癌血管的形成。我們的研究結(jié)果提示，一些非干腫瘤血管形成的一種新機(jī)制如能非干細(xì)胞樣的腫瘤細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化將本研究通過將常規(guī)培養(yǎng)的非干細(xì)胞樣的人肺癌細(xì)胞株9及小鼠肺癌細(xì)胞株C，分別接種于NOD/SCID小鼠右側(cè)腋下，獲得NOD/SCID小鼠成瘤動物模型.采用-R、免疫組織化學(xué)和esternblot方法檢測該成瘤組織中是否有人用FISH核型驗證方法進(jìn)行分析，獲得的原始經(jīng)過FISHprogress軟件處理。用流式細(xì)胞儀和熒光免疫組織化學(xué)方法檢測CD31+細(xì)胞，進(jìn)一步采用Dil-ac-BertoliniG,RozL,PeregoP,etal.HighlytumorigeniclungcancerCD133+cellsdisystem-likefeaturesandaresparedbycistintreatment.ProcNatlAcadSciUSA,2009,106(38):16281–6.BarbaraA.Weir,MicheleS.Woo,GadGetz,etal.Characterizingthecancergenomeinlungadenocarcinoma.Nature,2007,450:893-898.Tumourvascularizationviaendothelialdifferentiationofglioblastomastem-likecells.Nature,2010，468:824-828Glioblastomastem-likecellsgiverisetotumourendothelium.829-S.L.Lin,D.C.Chang,S.Chang-Lin,C.H.Lin,D.T.Wu,D.T.Chen,andS.Y.Ying,Mir-302reprogramshumanskincancercellsintoapluripotentES-cell-likestate.RNA14(2008)2115-24.S.L.Lin,D.C.Chang,C.H.Lin,S.Y.Ying,D.Leu,andD.T.Wu,Regulationofsomaticcellreprogrammingthroughinduciblemir-302expression.NucleicAcidsRes39(2011)1054-65. I.Lip,Y.Elkabetz,M.Hafner,R.Sheridan,A.Mihailovic,T.Tuschl,C.Sander,L.Studer,andD.Be,Genome-wideidentificationofmicroRNAtargetsinhumanEScellsrevealsaroleformiR-302inmodulatingBMPresponse.GenesDev25(2011)2173-86.D.Subramanyam,S.Lamouille,R.L.Judson,J.Y.Liu,N.Bucay,R.Derynck,R.Blelloch,MultipletargetsofmiR-302andmiR-372promotereprogrammingofhumanfibroblaststoinducedpluripotentstemcells.NatBiotechnol29(2011)443-M.Tanemura,K.Mimori,F.Tanaka,T.Saito,J.Nishimura,I.Takemasa,T.Mizushima,M.Ikeda,H.Yamamoto,M.Sekimoto,Y.Doki,andM.Mori,ReprogrammingofmouseandhumancellstopluripotencyusingmaturemicroRNAs.CellStemCell8(2011)633-8.常規(guī)培養(yǎng)人非干細(xì)胞樣的肺細(xì)胞A549及小鼠肺癌細(xì)胞株LLC，接種于含10％胎牛的DMEM培養(yǎng)基，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取指數(shù)生長期的A549的量接種于NOD/SCID小鼠右側(cè)腋下（實驗組。相同方法將LLC細(xì)胞接種于（Invivoexperiments.StudiesinvolvinganimalswereapprovedbythemitteeoftheCatholicUniversitySchoolofMedicineinRome.athymicandSCIDmice(female,4–5weeksofage;CharlesRiver)wereused.Forsubcutaneousxenografts,cellswereresuspended1×106in0.1mlofcoldPBS,mixedwithanequalvolumeofcoldMatrigel(BDBioscience),andinjectedintotheflanksofnudemice.Forintracranialxenografts,2×105cellsin5μlofPBSwereinjectedstereotacticallyontothestriatum.Micewerekilledby16–20weeksaftergraftingtocollecttumourxenografts.Onganciclovirtreatment,nomajortoxicitywasobservedinvitalorgans.）2GFP蛋白的非干細(xì)胞樣的肺A549按照說明書利用脂轉(zhuǎn)染技術(shù)將質(zhì)粒pEGFP-N1轉(zhuǎn)入人非干細(xì)胞樣的肺A54948hG418GFP蛋白的非干細(xì)胞樣的肺細(xì)胞A549。取保存于液氮中的人A549細(xì)胞NOD/SCID小鼠皮射的成瘤組織約100mgTTGGA-3’Endoglin5’-CTGGGTTGTATGGGAGAAGAGG-3’,672min,721min6次；941min，642min,721min6次；態(tài)大腸桿菌DH5a，篩選單克隆菌落擴(kuò)增培養(yǎng)，用TAKARAMiniBESTsmidPurificationKitVer.2.0提取質(zhì)粒，陽性質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列測定（英駿生物EndoglinEndogin4、WesternBlotCD105使用Trizol試劑按操作說明對瘤組織標(biāo)本中總蛋白質(zhì)進(jìn)行提取，SDS-膜泡封閉液中室溫下孵育1小時，用TBS/T3次，每次5分鐘。把膜泡在mg/ml，5TBS/TLLC成瘤組織為對照組。6、腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞分離純化：Glioblastomaneurosphereisolationandcharacterization.Isolationandcultureofhumanglioblastomamicrovascularendothelialcells.處死種植與腋下腫瘤的NOD/SCID小鼠，把NOD/SCID小鼠浸泡在中2分ReageneVortex2min20μlCD31MicroBeads45min1ml5min1ml1640下離心5min。吸走上清液，用1ml不完全1640培養(yǎng)基混勻。在1ml1640EP3ml164033ml16403ml1640CD31+CD31-12006minPBSCD31+7、FISH核型驗證FISHoncellnucleiextractedfromtumour乙醇20℃，依次放置兩分鐘10μLFISH探針，玻片，洗片（快速將玻片轉(zhuǎn)移到46℃預(yù)熱的2XSSC的Coplin缸中，放置至少10分鐘，不要抖動。再將玻片轉(zhuǎn)移到裝有2XSSC/0.1%NP40的Coplin缸中，放置5片，獲得的原始經(jīng)過FISHprogress軟件處理。8、腫瘤干細(xì)胞相關(guān)miRNA表達(dá)的檢測Geneexpressionysisandtativereal-timePCRforsortedcellpopulations.進(jìn)行消化去除組DNA。分別使用分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳的方法對RNA樣品進(jìn)行定量。2μl,0.1MDTT2μl,dNTP(Takara)1μl,M-MLV（Invitrogen）(5U/μl)0.5μl,RNaseInhibitor(Promega)0.5U/μl)0.25μl,U6(50nM終濃度2μl,miRNA反轉(zhuǎn)錄引物(50nM終濃度)2μl,TotalRNA（400ng）xμl,H2O10.75-xμl,程序：1630min,371hour7515min,4℃。20微升體系的相對定量PCR反應(yīng)：2×TransStartEcoGreenqPCRSuperMix(TransGen)10μl,50×PassiveReferenceDye0.2μl,ForwardPrimer(10μM)0.4μl,ReversePrimer(10μM)0.4μl,cDNAofmiRNA(1:5dilution)1μl，H2O9μl。程序：953min，955sec，601min，1s（40個循環(huán)），60~95℃熔解曲線，End。內(nèi)參為U6，計算使用2?ΔΔCT的方法。miRNAPCRRefChen,C.etal.Real-timeficationofmicroRNAsbystem-loopRT-PCR.NucleicAcidsRes33,e179(2005).Chen,X.etal.CharacterizationofmicroRNAsinserumanovelclassofbiomarkersfordiagnosisofcancerandotherdiseases.CellRes18,