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文檔簡介

實(shí)驗原理原代細(xì)胞培養(yǎng)保持了原來正常細(xì)胞的主要特性，經(jīng)常用于許多病毒的首次分離。本試驗以雞胚成纖維細(xì)胞制備和培養(yǎng)為例，介紹一下原代細(xì)胞的培養(yǎng)過程。實(shí)驗器材試劑器材：倒置顯微鏡、超凈工作臺、培養(yǎng)箱、水浴鍋、照蛋器等試劑：培養(yǎng)基（生長液+維持液）（含血清）PBS緩沖溶液消化液（0.25%胰酶）實(shí)驗方法細(xì)胞原代培養(yǎng)的步驟（1）取胚及剪碎取9-11日齡的雞胚，用照蛋器觀察后，將胚蛋氣室端向上，用酒精消毒氣室，以鑷子擊碎卵殼。沿氣室周圍剪去卵殼，撕去殼膜和絨毛尿囊膜，取出胚胎于滅菌平皿中。剪去頭部、翅爪及內(nèi)臟，以緩沖溶液沖洗體表數(shù)次，移入滅菌小瓶中，再用剪刀剪成小塊，約1mm3大小的碎塊，以緩沖液沖洗體表數(shù)次。實(shí)驗方法（2）消化加37℃預(yù)熱的0.25%胰酶適量，（一個雞胚約需5ml胰酶），37℃水浴消化15-20min，其間，每5min輕搖一次，至液體變得渾濁粘稠。此時，再輕搖可見組織塊懸浮在液體內(nèi)而不易下降時，則終止消化，棄去胰酶，再以緩沖溶液沖洗三次。實(shí)驗方法（3）吹打和過濾以培養(yǎng)液懸浮沉淀細(xì)胞，經(jīng)大口吸管反復(fù)吹打數(shù)次，使細(xì)胞分散。經(jīng)8層紗布過濾，收集濾液后離心，再加入培養(yǎng)液，制備細(xì)胞懸液。實(shí)驗方法（4）細(xì)胞計數(shù)取上述細(xì)胞懸液0.5ml加入0.1%的結(jié)晶紫-檸檬酸鹽溶液，室溫染色5-10min。用微量移液器吸取滴入細(xì)胞計數(shù)板內(nèi)，在顯微鏡下計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至106個/ml。（5）分裝培養(yǎng)將細(xì)胞懸液分裝于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。24h-36h長成單層的細(xì)胞，此時可吸去培養(yǎng)液，更換維持液。注意事項細(xì)胞培養(yǎng)所用的各種器皿必須嚴(yán)格消毒滅菌，所有的溶液都要用三蒸水配置。組織消化的時間要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗，摸索消化的最佳條件。細(xì)胞培養(yǎng)瓶放入二氧化碳培養(yǎng)箱時，瓶蓋不要擰得太緊，保證氣體能進(jìn)出。各步驟嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作，防止

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