13章基因治療原理與應(yīng)用研究

1根據(jù)靶細(xì)胞不同，基因治療分為：體細(xì)胞(somaticcell)基因治療生殖細(xì)胞(germline)基因治療只限于某一體細(xì)胞的基因的改變只限于某個(gè)體的當(dāng)代對(duì)缺陷的生殖細(xì)胞進(jìn)行矯正當(dāng)代及子代第一頁，共78頁。2基因治療的概念將某個(gè)遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細(xì)胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，以達(dá)到治療疾病目的方法。第二頁，共78頁。31.基因治療的策略

內(nèi)容提要2.基因轉(zhuǎn)移技術(shù)

3.基因干預(yù)4.基因治療的應(yīng)用研究5.基因治療的問題與展望第三頁，共78頁。4

第一節(jié)基因治療的策略第四頁，共78頁。5一、基因置換（genereplacement）

定義：將特定的目的基因?qū)胩囟?xì)胞，通過定位重組，導(dǎo)入的正?；蛑脫Q基因組內(nèi)原有的缺陷基因。

目的：將缺陷基因的異常序列進(jìn)行校正。

對(duì)缺陷基因的缺陷部位進(jìn)行精確的原位修復(fù)，不涉及基因組的任何改變。

第五頁，共78頁。6定向整合的條件:轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的載體與基因組DNA具有相同的序列。帶有目的基因的載體就能找到同源重組的位點(diǎn)，進(jìn)行部分基因序列的交換，使基因置換這一治療策略得以實(shí)現(xiàn)。又稱基因打靶(genetargeting）基因同源重組技術(shù)第六頁，共78頁。7缺陷基因正?；蛑亟M載體正?；蚨ㄎ恢亟M技術(shù)染色體第七頁，共78頁。8二、基因添加

(geneaugmentation)定義：通過導(dǎo)入外源基因使靶細(xì)胞表達(dá)其本身不表達(dá)的基因。類型：在有缺陷基因的細(xì)胞中導(dǎo)入相應(yīng)的正?；?，細(xì)胞內(nèi)的缺陷基因并未除去，通過導(dǎo)入正?；虻谋磉_(dá)產(chǎn)物，補(bǔ)償缺陷基因的功能；向靶細(xì)胞中導(dǎo)入靶細(xì)胞本來不表達(dá)的基因，利用其表達(dá)產(chǎn)物達(dá)到治療疾病的目的。第八頁，共78頁。9定義：采用特定的方式抑制某個(gè)基因的表達(dá)，或者通過破壞某個(gè)基因的結(jié)構(gòu)而使之不能表達(dá)，以達(dá)到治療疾病的目的。例如反義核酸、核酶或干擾RNA技術(shù)等。三、基因干預(yù)（geneinterference）第九頁，共78頁。10為惡性腫瘤基因治療的主要方法之一。原理:將“自殺”基因?qū)胨拗骷?xì)胞中，這種基因編碼的酶能使無毒性的藥物前體轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性代謝物，誘導(dǎo)靶細(xì)胞產(chǎn)生“自殺”效應(yīng)，從而達(dá)到清除腫瘤細(xì)胞的目的。四、自殺基因治療第十頁，共78頁。11自殺基因的作用機(jī)制

第十一頁，共78頁。12TK/GCV：?jiǎn)渭儼捳畈《荆╤erpssimplexvirus,HSV）Ⅰ型胸苷激酶（thymidinekinase,tk）基因編碼胸苷激酶，特異性地將無毒的核苷類似物丙氧鳥苷（ganciclovir,GCV）轉(zhuǎn)變成毒性GCV三磷酸核苷，抑制DNA聚合酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。（一）自殺基因系統(tǒng)第十二頁，共78頁。13CD/5-FC：大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶（cytosinedeaminase,CD）基因，在細(xì)胞內(nèi)將無毒性5-氟胞嘧啶（5-FC）轉(zhuǎn)變成毒性產(chǎn)物5-氟尿嘧啶（5-FU）。（一）自殺基因系統(tǒng)第十三頁，共78頁。14旁觀者效應(yīng)：“自殺基因”導(dǎo)入后，不僅使導(dǎo)入了“自殺基因”的腫瘤細(xì)胞在用藥后被殺死，而且與其相鄰或遠(yuǎn)處的未轉(zhuǎn)導(dǎo)“自殺基因”的腫瘤細(xì)胞也被殺死。增強(qiáng)了自殺基因的腫瘤殺傷作用。（二）旁觀者效應(yīng)第十四頁，共78頁。15五、基因免疫治療通過將抗癌免疫增強(qiáng)的細(xì)胞因子或MHC基因?qū)肽[瘤組織，以增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境中的抗癌免疫反應(yīng)。第十五頁，共78頁。16第二節(jié)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)

第十六頁，共78頁。17基因轉(zhuǎn)移的兩種方式載體目的基因invivoexvivo靶細(xì)胞將目的基因直接輸入體內(nèi)將目的基因?qū)牖颊甙屑?xì)胞,體外培養(yǎng)將重組靶細(xì)胞回輸體內(nèi)第十七頁，共78頁。18基因治療轉(zhuǎn)移的方式1.直接體內(nèi)療法（invivo）是指將目的基因直接導(dǎo)入體內(nèi)有關(guān)的組織器官，使其進(jìn)入相應(yīng)的細(xì)胞并進(jìn)行表達(dá)。2.間接體內(nèi)療法（exvivo）在體外將目的基因?qū)氚屑?xì)胞，經(jīng)過篩選和增殖后將細(xì)胞回輸給患者，使該基因在體內(nèi)有效地表達(dá)相應(yīng)產(chǎn)物，以達(dá)到治療的目的。第十八頁，共78頁。19

一、病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)

病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移效率較高，是使用最多的基因治療載體。其中用得最多的是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。第十九頁，共78頁。20（一）逆轉(zhuǎn)錄病毒（Retrovirus）載體+ssRNA逆轉(zhuǎn)錄酶核心蛋白膜蛋白人類免疫缺陷病毒（HIV）

第二十頁，共78頁。21逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活周期Ⅰ第二十一頁，共78頁。22逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活周期Ⅱ第二十二頁，共78頁。23逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活周期Ⅲ第二十三頁，共78頁。24（1）兩端各有一長(zhǎng)末端重復(fù)序列LTR。

1.逆轉(zhuǎn)錄病毒前病毒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)（2）LTR由U3、R和U5三部分組成。U3內(nèi)有增強(qiáng)子和啟動(dòng)子；U3和U5兩端分別有病毒整合序列(IS)

；在R內(nèi)還有poly(A)加尾信號(hào)。

第二十四頁，共78頁。25

1.逆轉(zhuǎn)錄病毒前病毒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

（3）病毒有三個(gè)結(jié)構(gòu)基因：gag、pol和env基因（4）5ˊ端LTR下游有一段病毒包裝所必需的序列（ψ）及剪接供體位點(diǎn)(SD)和剪接受體位點(diǎn)(SA)。第二十五頁，共78頁。262.逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)

(1)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體保留病毒顆粒的包裝信號(hào)，而缺失病毒顆粒包裝蛋白基因；它可以克隆并表達(dá)外源基因，但不能自我包裝成有增殖能力的病毒顆粒。LTRtherapeuticgeneLTR第二十六頁，共78頁。272.逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)

(2)輔助細(xì)胞株

它由另一種缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒感染構(gòu)建而成。該細(xì)胞株能合成包裝蛋白，用于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝。由于缺乏包裝信號(hào)，本身不能被包裝成病毒顆粒。gagpolenv第二十七頁，共78頁。28Retroviralpackagingsystem第二十八頁，共78頁。29第二十九頁，共78頁。30逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)基因gag、env和pol的缺失不影響其他部分的活性。包裝好的假病毒顆粒易于分離制備。逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶的遺傳物質(zhì)高效地進(jìn)入靶細(xì)胞。前病毒通過LTR高效整合至靶細(xì)胞基因組中，有利于外源基因在靶細(xì)胞中的永久表達(dá)。

3.逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的特點(diǎn)

第三十頁，共78頁。31

4.

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的主要缺點(diǎn)

隨機(jī)整合，有插入突變、激活癌基因的潛在危險(xiǎn)；逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的容量較小，只能容納8kb以下的外源基因。第三十一頁，共78頁。32

（二）腺病毒(adenovirus，AV)載體第三十二頁，共78頁。33

（二）腺病毒(adenovirus，AV)載體腺病毒是一種大分子(36kb)雙鏈無包膜DNA病毒。它通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，然后腺病毒基因組轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，保持在染色體外，不整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組中。

第三十三頁，共78頁。34腺病毒的優(yōu)點(diǎn)1.基因?qū)胄矢撸?.宿主范圍廣；3.基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞分裂無關(guān)；4.重組腺病毒可通過口服經(jīng)腸道吸收、或噴霧吸入或氣管內(nèi)滴注；5.腺病毒載體容量較大，可插入7.5kb外源基因。第三十四頁，共78頁。35

腺病毒載體缺點(diǎn)2.宿主的免疫反應(yīng)導(dǎo)致腺病毒載體表達(dá)短暫。3.有兩個(gè)環(huán)節(jié)可能產(chǎn)生復(fù)制型腺病毒：載體與輔助細(xì)胞或患者體內(nèi)野生型病毒發(fā)生重組。4.靶向性差。

1.不能整合到靶細(xì)胞的基因組DNA中。治療基因表達(dá)時(shí)間相對(duì)較短。第三十五頁，共78頁。36

（三）腺相關(guān)病毒載體AAVVirusParticle腺相關(guān)病毒(adenovirusassociatedvirus，AAV)是一類單鏈線狀DNA缺陷型病毒。其基因組DNA小于5kb，無包膜，外形為裸露的20面體顆粒。AAV不能獨(dú)立復(fù)制，只有在輔助病毒存在時(shí)，才能進(jìn)行復(fù)制和溶細(xì)胞性感染，否則只能建立溶源性潛伏感染。第三十六頁，共78頁。37StructureofAAVVirusGenomicDNAREP:病毒復(fù)制基因,CAP:編碼衣殼蛋白的基因ITR：反向末端重復(fù)序列第三十七頁，共78頁。38AAV的特點(diǎn)●以潛伏感染為主；●AAV可以高效定點(diǎn)整合至人染色體中：可以避免隨機(jī)整合可能帶來的抑癌基因失活和原癌基因激活的潛在危險(xiǎn)性，而且外源基因可以持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)。第三十八頁，共78頁。39

AAV載體的缺陷：

AAV載體容量小，目前最多只能容納5kb外源DNA片段；感染效率比逆轉(zhuǎn)錄病毒載體低。在40%-80%的成人中存在過感染，可能會(huì)引起免疫排斥。第三十九頁，共78頁。40常用基因治療載體

整合特點(diǎn)安全性感染細(xì)胞克隆容量逆轉(zhuǎn)錄病毒載體隨機(jī)整合，效率高可能致病分裂細(xì)胞<8kb腺病毒載體不整合，可能丟失安全性較高分裂細(xì)胞、非分裂細(xì)胞

腺相關(guān)病毒載體定點(diǎn)整合安全性較高分裂細(xì)胞、非分裂細(xì)胞<5kb<7.5kb第四十頁，共78頁。41二、非病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)

（一）脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)

基本原理：利用陽離子脂質(zhì)體單體與DNA混合后，可以自動(dòng)形成包埋外源DNA的脂質(zhì)體，然后與細(xì)胞一起孵育，即可通過細(xì)胞內(nèi)吞作用將外源DNA（即目的基因）轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)，并進(jìn)行表達(dá)。第四十一頁，共78頁。42脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移示意圖第四十二頁，共78頁。43

（二）受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移技術(shù)

將DNA與細(xì)胞或組織親和性的配體偶聯(lián)，可使DNA具有靶向性。第四十三頁，共78頁。44受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移技術(shù)示意圖第四十四頁，共78頁。45

（三）基因直接注射技術(shù)

如：肌內(nèi)注射凝血因子Ⅸ基因，可產(chǎn)生血友病所需的凝血因子Ⅸ。第四十五頁，共78頁。46第三節(jié)基因干預(yù)一、反義RNA二、RNA干擾三、核酶第四十六頁，共78頁。47一、反義RNA

（一）反義RNA與基因表達(dá)調(diào)控

指能與特定基因mRNA互補(bǔ)結(jié)合的一類RNA,可抑制一些有害基因的翻譯。第四十七頁，共78頁。48

反義RNA的關(guān)鍵技術(shù)問題：?反義RNA進(jìn)入靶細(xì)胞前的降解問題?專一性轉(zhuǎn)移問題：

舉例:將脫唾液酸血清類粘蛋白（ASGP）與多聚賴氨酸（PL）共價(jià)連接，得到ASGP-PL復(fù)合物，成為運(yùn)載核酸的工具?？梢詫Ｒ恍缘厥狗戳xRNA特異進(jìn)入肝細(xì)胞。

第四十八頁，共78頁。49（二）受體介導(dǎo)反義RNA技術(shù)轉(zhuǎn)移①受體介導(dǎo)的RNA轉(zhuǎn)移十分專一，而且效率高；②被轉(zhuǎn)移的RNA是被保護(hù)的，與周圍環(huán)境之間存在多聚賴氨酸的保護(hù)層,可以抵抗環(huán)境中的核酸酶的降解作用。

借助前述的受體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移方法，可以實(shí)現(xiàn)受體介導(dǎo)的反義RNA轉(zhuǎn)移。第四十九頁，共78頁。50

（三）反義RNA的應(yīng)用前景

（l）安全性高（2）反義RNA設(shè)計(jì)和制備方便

（3）具有劑量調(diào)節(jié)效應(yīng)

（4）能直接作用于一些RNA病毒第五十頁，共78頁。51二、RNA干擾（RNAinterference，RNAi）由雙鏈RNA介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)特異性mRNA降解過程，導(dǎo)致靶基因的表達(dá)沉默。第五十一頁，共78頁。52（一）RNA干擾機(jī)制示意圖第五十二頁，共78頁。53（二）RNA干擾的應(yīng)用前景

1.研究基因功能的新工具

2.腫瘤的基因治療

3.病毒性疾病的基因治療第五十三頁，共78頁。54三、核酶(ribozyme)

具有酶活性的RNA，可降解特異的mRNA序列。與靶序列互補(bǔ)的區(qū)域保守區(qū)域（構(gòu)成酶活性的結(jié)構(gòu)域）第五十四頁，共78頁。55核酶的作用機(jī)制

第五十五頁，共78頁。56

（二）核酶的應(yīng)用

與一般的反義RNA相比，核酶具有較穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，不易受到RNA酶的攻擊。更重要的是，核酶在切斷mRNA后，又可從雜交鏈上解脫下來，重新結(jié)合和切割其它的mRNA分子。

第五十六頁，共78頁。57

第五節(jié)基因治療的應(yīng)用研究第五十七頁，共78頁。581．腺苷脫氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)缺乏癥2．珠蛋白生成障礙性貧血和血紅蛋白病3．血友病和其他血漿蛋白缺乏癥4．苯丙酮酸尿癥和其他先天性代謝缺陷病5．萊-納(Lesch-Nyhan)綜合征6．家族性高膽固醇血癥7．囊性纖維化病一、遺傳病的基因治療研究

第五十八頁，共78頁。59第一例基因治療

－腺苷脫氨酶缺乏癥生理：腺苷脫氨酶是一種細(xì)胞內(nèi)酶，在核酸代謝中起重要作用，使淋巴細(xì)胞中的脫氧腺苷脫氨成為脫氧肌苷，最后代謝為尿酸，排出體外。病理：腺苷脫氨酶缺乏－脫氧腺苷不能脫氨－脫氧腺細(xì)胞內(nèi)堆積－淋巴細(xì)胞死亡－機(jī)體免疫功能缺乏。第五十九頁，共78頁。60治療基礎(chǔ)腺苷脫氨酶基因位于20號(hào)染色體長(zhǎng)臂1983年腺苷脫氨酶基因被克隆應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒可將該基因送入缺乏腺苷脫氨酶基因的淋巴細(xì)胞新輸入的腺苷脫氨酶基因可在原來沒有此基因的淋巴細(xì)胞中表達(dá)

第六十頁，共78頁。61基因治療的臨床應(yīng)用AshantideSilvaAshantiwasthefirstpatienttobetreatedwithgenetherapy.Injectionsrepeated7timesinfirst10.5monthsADA:1%25%第六十一頁，共78頁。62

治療步驟抽取病人骨髓，分離淋巴細(xì)胞將病人淋巴細(xì)胞與攜帶腺苷脫氨酶基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體混合培養(yǎng)，使腺苷脫氨酶進(jìn)入淋巴細(xì)胞清洗淋巴細(xì)胞，去除多余病毒載體。應(yīng)用抗性基因等方法選擇陽性細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)外腺苷脫氨酶含量第六十二頁，共78頁。63

治療步驟確定腺苷脫氨酶在淋巴細(xì)胞有滿意表達(dá)后，將帶有此基因的淋巴細(xì)胞輸回患者體內(nèi)。密切觀察病人各項(xiàng)免疫指標(biāo)的變化，必要時(shí)加以調(diào)整和重復(fù)。經(jīng)如上治療后，患病女童免疫功能基本恢復(fù)。以后又連續(xù)進(jìn)行了多次輸入。第六十三頁，共78頁。64乙型血友病薛京倫(復(fù)旦大學(xué))1991,皮膚成纖維細(xì)胞FactorIX:5%第六十四頁，共78頁。65逆轉(zhuǎn)錄病毒載體+FⅨcDNA重組體

5’LTRFⅨneoSVPSOLTR3’①導(dǎo)入倉鼠細(xì)胞（CHO）→FⅨ表達(dá)；②導(dǎo)入乙型血友病患者皮膚成纖維細(xì)胞（體外培養(yǎng)）→FⅨ表達(dá)；③91年，導(dǎo)入乙型血友病患者皮膚成纖維細(xì)胞（體外培養(yǎng)）→回植病人皮下→FⅨ基因表達(dá)，F(xiàn)Ⅸ基表達(dá)水平達(dá)正常人的5%。是我國基因治療成功的例子。第六十五頁，共78頁。66二、惡性腫瘤基因治療研究

常用基因治療策略：基因添加基因干預(yù)技術(shù)自殺基因治療—分子化療腫瘤的免疫基因治療。提高化療效果的輔助基因治療：藥物增敏基因治療；耐藥基因治療。第六十六頁，共78頁。67三、病毒性疾病的基因治療研究

可用基因治療的策略1．調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答2.基因干預(yù)，抑制病毒復(fù)制

第六十七頁，共78頁。68第六節(jié)基因治療的問題與展望安全性問題

1999年首例基因治療失