免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)

免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)第1頁(yè)/共107頁(yè)一、免疫學(xué)檢驗(yàn)原理抗原-抗體反應(yīng)：指抗原與相應(yīng)抗體在體內(nèi)、外發(fā)生高度特異性結(jié)合反應(yīng)。由于實(shí)驗(yàn)所用的抗體存在于血清中，故又稱血清學(xué)反應(yīng)（serologicalreaction)應(yīng)用：用已知抗原檢測(cè)未知抗體；用已知抗體檢測(cè)未知抗原：定性或定量檢測(cè)體內(nèi)各種分子；用已知抗體檢測(cè)半抗原物質(zhì)。第2頁(yè)/共107頁(yè)1.特異性和交叉反應(yīng)

特異性：一種抗原通常僅能與由它刺激所產(chǎn)生的抗體結(jié)合。分子基礎(chǔ)：抗原表位與抗體分子高變區(qū)之間空間構(gòu)型的互補(bǔ)性。（一）抗原-抗體反應(yīng)的特點(diǎn)第3頁(yè)/共107頁(yè)交叉反應(yīng)（crossreaction）性：若兩種抗原分子有一個(gè)或數(shù)個(gè)相同（或相似）的決定基，則針對(duì)一種抗原的抗血清可與另一種抗原發(fā)生反應(yīng)。第4頁(yè)/共107頁(yè)

結(jié)合價(jià)：天然抗原分子表面一般含多種抗原決定基，可與多個(gè)抗體分子結(jié)合，為多價(jià)。單體形式的抗體分子有兩個(gè)Fab段，能結(jié)合兩個(gè)相同的抗原決定基，為兩價(jià)。

2.比例性第5頁(yè)/共107頁(yè)比例合適：若抗原、抗體的數(shù)量比例合適，抗體分子的兩個(gè)Fab段分別與兩個(gè)抗原決定基結(jié)合，相互交叉連接成網(wǎng)格狀復(fù)合體，則反應(yīng)體系中基本不存在游離的抗原或抗體，此時(shí)形成肉眼可見的反應(yīng)物（沉淀物或凝集物）。因此，確定反應(yīng)體系中抗原、抗體的最適比例十分重要。前帶現(xiàn)象（prozone）和后帶現(xiàn)象(postzone)

Ab過剩和Ag過?？乖涂贵w結(jié)合是否呈現(xiàn)可見的反應(yīng)現(xiàn)象，與兩者的濃度和比例密切相關(guān)第6頁(yè)/共107頁(yè)前帶現(xiàn)象（prozone）和后帶現(xiàn)象(postzone)Ab過剩和Ag過剩第7頁(yè)/共107頁(yè)網(wǎng)格學(xué)說（latticetheory）抗體過?？乖^剩抗體抗體比例合適抗原抗體第8頁(yè)/共107頁(yè)

抗原-抗體反應(yīng)為分子表面的非共價(jià)結(jié)合，結(jié)合雖穩(wěn)定但可逆。在一定條件下（如低pH、高濃度鹽、凍融等），抗原-抗體復(fù)合物可被解離。解離后的抗原和抗體仍保持原有理化特性和生物學(xué)活性。根據(jù)此特點(diǎn)，可借助親和層析法純化抗原或抗體。3.可逆性第9頁(yè)/共107頁(yè)4.階段性抗原抗體反應(yīng)可分為兩個(gè)階段

特異性結(jié)合階段：反應(yīng)快，不可見。

可見的反應(yīng)階段：反應(yīng)慢，出現(xiàn)凝集、沉淀和細(xì)胞溶解等現(xiàn)象。

第10頁(yè)/共107頁(yè)1.電解質(zhì)

抗原和抗體有對(duì)應(yīng)的極性基團(tuán)，能相互吸附并由親水性變?yōu)槭杷?。電解質(zhì)的存在使抗原-抗體復(fù)合物失去電荷而凝聚，出現(xiàn)可見反應(yīng)，故免疫學(xué)試驗(yàn)中多用生理鹽水稀釋抗原或抗體。（二）、抗原-抗體反應(yīng)的影響因素第11頁(yè)/共107頁(yè)2.酸堿度抗原抗體反應(yīng)的最適pH是6-8。3.溫度最適溫度為37℃。有些例外，如冷凝集素在4℃左右與紅細(xì)胞結(jié)合最好，20℃以上反而解離。第12頁(yè)/共107頁(yè)

4.抗原和抗體的性質(zhì)抗體的特異性和親和力是決定抗原-抗體反應(yīng)的關(guān)鍵因素。此外，抗原理化性質(zhì)、抗原決定基多寡和種類等均可影響抗原-抗體反應(yīng)。

第13頁(yè)/共107頁(yè)抗體分子上一個(gè)抗原結(jié)合點(diǎn)與對(duì)應(yīng)的抗原決定基之間的結(jié)合能力親和力(affinity)第14頁(yè)/共107頁(yè)

根據(jù)抗原的性質(zhì)、結(jié)合反應(yīng)的現(xiàn)象、參與反應(yīng)的成分等因素分類：

1.凝集反應(yīng)

2.沉淀反應(yīng)

3.補(bǔ)體參加的反應(yīng)

4.免疫標(biāo)記技術(shù)（三）、免疫學(xué)檢驗(yàn)方法第15頁(yè)/共107頁(yè)

反應(yīng)類型實(shí)驗(yàn)技術(shù)非標(biāo)記凝集反應(yīng)直接凝集試驗(yàn)、間接凝集試驗(yàn)、間接抑制凝集試驗(yàn)、協(xié)同凝集試驗(yàn)沉淀反應(yīng)液相內(nèi)凝集試驗(yàn)、凝膠內(nèi)凝集試驗(yàn)補(bǔ)體參與的反應(yīng)補(bǔ)體溶血試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)中和反應(yīng)病毒中和試驗(yàn)、毒素中和試驗(yàn)標(biāo)記標(biāo)記免疫反應(yīng)熒光免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)發(fā)光免疫技術(shù)金免疫技術(shù)第16頁(yè)/共107頁(yè)

顆粒性抗原（細(xì)菌或細(xì)胞等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在一定條件下，出現(xiàn)肉眼可見的凝集物，稱為凝集反應(yīng)(agglutination)

。用于凝集反應(yīng)中的抗原稱凝集原(agglutinogen)。用于凝集反應(yīng)中的抗體稱凝集素（agglutinin)。

凝集反應(yīng)（AgglutinationTests）第17頁(yè)/共107頁(yè)1．直接凝集（directagglutination)

：

細(xì)菌或紅細(xì)胞與相應(yīng)抗體直接反應(yīng)，可出現(xiàn)細(xì)菌或紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。2．間接凝集（indirectorpassiveagglutination)：檢測(cè)針對(duì)可溶性Ag的Ab3．間接凝集抑制試驗(yàn)

(directagglutinationinhibitiontest)4.協(xié)同凝集試驗(yàn)（co-agglutinationtest）

載體為金葡菌，其細(xì)胞壁蛋白A與IgG的Fc結(jié)合，用于細(xì)菌、病毒的快速檢測(cè)。第18頁(yè)/共107頁(yè)第19頁(yè)/共107頁(yè)妊娠免疫診斷試驗(yàn)

孕婦尿中，絨毛膜促性腺激素（HCG）含量明顯增高。（HCG是可溶性抗原）反之，非孕婦尿中HCG含量甚微，不足以消耗掉抗HCG抗體。HCG檢測(cè)為間接凝集試驗(yàn)的應(yīng)用第20頁(yè)/共107頁(yè)Definition:可溶性抗原（血清蛋白、外毒素、細(xì)菌濾液等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在一定條件下，形成出現(xiàn)肉眼可見的沉淀物的現(xiàn)象稱為沉淀反應(yīng)。沉淀反應(yīng)（PrecipitationTests）用于沉淀反應(yīng)中的抗原稱沉淀原(precipitonogen)。用于沉淀反應(yīng)中的抗體稱沉淀素（precipitin)。

第21頁(yè)/共107頁(yè)大多沉淀反應(yīng)多用半固體瓊脂凝膠作為介質(zhì)進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散或免疫擴(kuò)散，即可溶性抗原與抗體在凝膠中擴(kuò)散，在比例合適處相遇即形成可見的白色沉淀。第22頁(yè)/共107頁(yè)1．單向免疫擴(kuò)散(singleimmunodiffusion)2．雙向免疫擴(kuò)散(doubleimmunodiffusion)沉淀反應(yīng)第23頁(yè)/共107頁(yè)單向免疫擴(kuò)散

(SingleImmunodiffusion)是將一定量已知抗體混于瓊脂凝膠中制瓊脂板，在適當(dāng)位置打孔后將抗原加入孔中擴(kuò)散?？乖跀U(kuò)散過程中與凝膠中的抗體相遇，形成以抗原孔為中心的沉淀環(huán)，環(huán)的直徑與抗原含量成正比相關(guān)。本法常用于測(cè)定血清IgG、IgM、IgA和C3等的含量。含抗體的凝膠沉淀環(huán)第24頁(yè)/共107頁(yè)雙向免疫擴(kuò)散

（DoubleImmunodiffusion)是將抗原與抗體分別加入瓊脂凝膠的小孔中，二者自由向周圍擴(kuò)散并相遇，在比例合適處形成沉淀線。如果反應(yīng)體系中含兩種以上的抗原抗體系統(tǒng)，則小孔間可出現(xiàn)兩條以上的沉淀線。本法常用于抗原或抗體的定性、組成和兩種抗原相關(guān)性分析的檢測(cè)。第25頁(yè)/共107頁(yè)第26頁(yè)/共107頁(yè)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（ComplementFixationtest,CFT)

敏感性和特異性均較高，但該試驗(yàn)影響因素較多，現(xiàn)在已有被其它新方法取代的趨勢(shì)。第27頁(yè)/共107頁(yè)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(complementfixationtest，CFT)

將免疫溶血作為指示系統(tǒng)，用以檢測(cè)另一反應(yīng)系統(tǒng)中抗原或抗體的傳統(tǒng)方法。第28頁(yè)/共107頁(yè)試驗(yàn)原理作用原理：利用補(bǔ)體的溶細(xì)胞作用進(jìn)行各種物理狀態(tài)的抗原抗體測(cè)定5種成分，3個(gè)系統(tǒng)反應(yīng)系統(tǒng)（溶菌系統(tǒng)）：已知抗原（或抗體）與待測(cè)抗體（或抗原）補(bǔ)體系統(tǒng)：指示系統(tǒng)（溶血系統(tǒng)）：SRBC與相應(yīng)溶血素。試驗(yàn)時(shí)常將其預(yù)先結(jié)合，成為致敏綿羊紅細(xì)胞（sensitizedsheepredbloodcell,SRBCS）。溶菌系統(tǒng)第29頁(yè)/共107頁(yè)反應(yīng)分兩步進(jìn)行

第一步:反應(yīng)系統(tǒng)與補(bǔ)體的作用

第二步:指示系統(tǒng)利用剩余補(bǔ)體的反應(yīng)不溶血為補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)陽(yáng)性，而溶血為試驗(yàn)陰性第30頁(yè)/共107頁(yè)已知抗原加入血清（檢測(cè)抗體）加入標(biāo)準(zhǔn)量補(bǔ)體加入包被抗體的紅細(xì)胞檢測(cè)紅細(xì)胞溶解情況AgYYPatient’sserum

YYYYYYYYAbNoAbAg第31頁(yè)/共107頁(yè)

用熒光素、酶、放射性核素或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等標(biāo)記抗體或抗原，進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)的檢測(cè)，是目前應(yīng)用最為廣泛的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)。標(biāo)記物與抗體或抗原連接后并不改變抗原抗體的免疫特性，具有靈敏度高、快速、可定性、定量、定位等優(yōu)點(diǎn)。免疫標(biāo)記技術(shù)（Immunolabellingtechnique）第32頁(yè)/共107頁(yè)

用熒光素與抗體連接成熒光抗體，再與待檢標(biāo)本中抗原反應(yīng)，置熒光顯微鏡下觀察，抗原-抗體復(fù)合物散發(fā)熒光，借此對(duì)抗原進(jìn)行定性或定位。

1．免疫熒光法(immunofluorescence,IF)第33頁(yè)/共107頁(yè)（1）直接熒光法：熒光素直接標(biāo)記抗體，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。該法優(yōu)點(diǎn)是特異性高，缺點(diǎn)是檢查任一抗原均須制備相應(yīng)熒光抗體。（2）間接熒光法：用一抗與標(biāo)本中抗原結(jié)合，再用熒光素標(biāo)記的二抗進(jìn)行檢測(cè)。該法優(yōu)點(diǎn)是敏感度比直接法高，制備一種熒光素標(biāo)記的二抗即可用于多種抗原的檢測(cè),但非特異性反應(yīng)亦增強(qiáng)。免疫熒光法分類第34頁(yè)/共107頁(yè)免疫熒光法圖示第35頁(yè)/共107頁(yè)

此法將抗原-抗體反應(yīng)的特異性與酶催化作用的高效性相結(jié)合，借助酶作用于底物的顯色反應(yīng)判定結(jié)果。應(yīng)用酶標(biāo)測(cè)定儀測(cè)定光密度（OD）值可反映抗原含量，靈敏度達(dá)ng/ml甚至pg/ml水平。常見的標(biāo)記物為：辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP）

２．酶免疫測(cè)定(enzymeimmunoassay,EIA)第36頁(yè)/共107頁(yè)常用的方法如下：（1）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)第37頁(yè)/共107頁(yè)1）ELISA是酶免疫測(cè)定中應(yīng)用最廣的技術(shù)，用于測(cè)定可溶性抗原或抗體。優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性強(qiáng)，可自動(dòng)化檢測(cè)，從而被廣泛用于檢測(cè)多種病原體抗原或抗體、血液及其他體液中微量蛋白成分、細(xì)胞因子等。第38頁(yè)/共107頁(yè)

分類：（1）放射免疫分析法(radioimmunoassay,RIA)（2）免疫放射分析法（immunoradiometricassay,IRMA）3．放射免疫技術(shù)第39頁(yè)/共107頁(yè)

乃用放射性核素標(biāo)記抗原或抗體進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)。該法兼有放射性核素的高靈敏度和抗原-抗體反應(yīng)的特異性，檢測(cè)靈敏度達(dá)pg水平。常用于標(biāo)記的放射性核素為125I和131I，分為液相和固相兩種方法。該法常用于測(cè)定微量物質(zhì)，如胰島素、生長(zhǎng)激素、甲狀腺素、孕酮等激素，嗎啡、地高辛、IgE等。放射免疫分析法(radioimmunoassay,RIA)第40頁(yè)/共107頁(yè)

屬于非競(jìng)爭(zhēng)性放射性配體結(jié)合分析技術(shù)。他與RIA為代表的競(jìng)爭(zhēng)性放射性配體分析技術(shù)的區(qū)別主要有兩點(diǎn)：一，放射性核素標(biāo)記的是抗體而不是抗原，其二是采用過量抗體而不是限量抗體。RIMA與RIA相比較，提高了檢測(cè)的靈敏度并使檢測(cè)范圍增寬，特異性和精確度進(jìn)一步提高。

免疫放射分析法（immunoradiometricassay,IRMA）

第41頁(yè)/共107頁(yè)免疫放射分析法有以下特點(diǎn)：1.以標(biāo)記抗體作為示蹤劑2.反應(yīng)動(dòng)力學(xué)：因標(biāo)記抗體是過量的，且反應(yīng)是非競(jìng)爭(zhēng)性的，抗原抗體是全量反應(yīng)，故反應(yīng)速度比RIA快。3.靈敏度明顯高于放射免疫分析，約為放射免疫分析的10～100倍。4.標(biāo)準(zhǔn)曲線工作范圍寬。5.特異性高。6.穩(wěn)定性好。第42頁(yè)/共107頁(yè)４．金標(biāo)記免疫技術(shù)

膠體金標(biāo)記技術(shù)(Immunogoldlabelingtechnique)是以膠體金作為示蹤標(biāo)記物，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)。第43頁(yè)/共107頁(yè)免疫膠乳試驗(yàn)應(yīng)用第44頁(yè)/共107頁(yè)膠乳凝集試驗(yàn)原理：

膠乳凝集試驗(yàn)是一種間接凝集試驗(yàn)，它是以聚苯乙烯膠乳微粒作為惰性載體。膠乳為人工合成的載體，因此其性能比生物來源的紅細(xì)胞穩(wěn)定，均一性好。但膠乳與蛋白質(zhì)的結(jié)合能力以及凝集性能不如紅細(xì)胞，因此作為間接凝集試驗(yàn)，膠乳試驗(yàn)的敏感度不及血凝試驗(yàn)。第45頁(yè)/共107頁(yè)膠乳凝集試驗(yàn)方法：傳統(tǒng)的膠乳凝集試驗(yàn)分試管法與玻片法。試管法先將受檢標(biāo)本在試管中以緩沖液作倍比稀釋，然后加入致敏的膠乳試劑，反應(yīng)后觀察膠乳凝集結(jié)果。玻片法操作簡(jiǎn)便，1滴受檢標(biāo)本和1滴致敏的膠乳試劑在玻片上混勻后，連續(xù)搖動(dòng)2～3min即可觀察結(jié)果。出現(xiàn)大顆粒凝集的為陽(yáng)性反應(yīng)，保持均勻乳液狀為陰性反應(yīng)。

第46頁(yè)/共107頁(yè)抗鏈球菌溶血素“O”（ASO）原理：膠乳凝集試驗(yàn)原理相同，在受檢者血清中，加入溶血素“O”,出現(xiàn)凝集顆粒，即為陽(yáng)性。參考值：

ASO≤250U/L第47頁(yè)/共107頁(yè)臨床意義：1.ASO測(cè)定對(duì)于診斷A族鏈球菌感染很有價(jià)值，其存在及含量可反映感染的嚴(yán)重程度。2.風(fēng)濕熱、急性腎小球腎炎、結(jié)節(jié)性紅斑、猩紅熱、急性扁桃體炎等ASO明顯升高。3.少數(shù)肝炎、結(jié)締組織病、結(jié)核病及多發(fā)性骨髓瘤病人亦可使ASO增高。4.當(dāng)效價(jià)>250U/L時(shí)，才被認(rèn)為有診斷價(jià)值。

抗鏈球菌溶血素“O”（ASO）第48頁(yè)/共107頁(yè)類風(fēng)濕因子（rheumatoidfactor,RF）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是由自身抗體免疫復(fù)合物引起的自身免疫性疾病。類風(fēng)濕因子是由于感染因子（細(xì)菌、病毒等）引起體內(nèi)產(chǎn)生的以變性IgG為抗原的一種抗體，故又稱抗抗體。

第49頁(yè)/共107頁(yè)原理：將變性IgG包被于聚苯乙烯膠乳顆粒上，這種致敏膠乳在與待測(cè)血清中的RF相遇時(shí)，即發(fā)生肉眼可見的凝集。參考值：正常人1：20稀釋血清為陰性。

類風(fēng)濕因子（rheumatoidfactor,RF）

第50頁(yè)/共107頁(yè)臨床意義：1.約90%類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）患者的RF呈陽(yáng)性。2.某些自身免疫病，如冷球蛋白血癥、進(jìn)行性全身性硬化癥、干燥綜合征、SLE等。3.一些其他疾病如血管炎、肝病、慢性感染也可出現(xiàn)RF。

類風(fēng)濕因子（rheumatoidfactor,RF）

第51頁(yè)/共107頁(yè)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）原理：使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)。第52頁(yè)/共107頁(yè)ELISA主要有以下幾種類型：1.雙抗體夾心法測(cè)抗原（常用）2.雙抗原夾心法測(cè)抗體3.間接法測(cè)抗體（常用）4.競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原5.競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體6.捕獲包被法測(cè)抗體7.親和素-生物素ELISA法第53頁(yè)/共107頁(yè)包被特異性抗體加入待測(cè)樣品加酶標(biāo)特異性抗體底物顯色洗滌孵育洗滌孵育雙抗體夾心法測(cè)抗原第54頁(yè)/共107頁(yè)第55頁(yè)/共107頁(yè)待測(cè)抗原須有兩個(gè)可以與抗體結(jié)合的部位，其一端與包被于固相載體上的抗體結(jié)合，另一端與酶標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合。此法適用于檢驗(yàn)各種二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。不能用于分子量小于5000的半抗原或小分子單價(jià)抗原的測(cè)定。第56頁(yè)/共107頁(yè)雙抗原夾心法測(cè)抗體反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物，以檢測(cè)相應(yīng)的抗體。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測(cè)定。乙肝標(biāo)志物中HBsAb的檢測(cè)常采用本法。關(guān)鍵在于根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同制備酶標(biāo)抗原。第57頁(yè)/共107頁(yè)第58頁(yè)/共107頁(yè)

間接法測(cè)抗體間接法是檢測(cè)抗體最常用的方法。原理：利用酶標(biāo)記的抗體檢測(cè)已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。

第59頁(yè)/共107頁(yè)操作步驟：

（1）將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原，洗滌。（2）加稀釋的受檢樣本，其中的特異抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物，孵育洗滌。（3）加酶標(biāo)抗體：與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合，從而使該抗體間接地標(biāo)記上酶，孵育洗滌。（4）加底物顯色：顏色深度代表標(biāo)本中受檢抗體的量。第60頁(yè)/共107頁(yè)間接法的特點(diǎn)本法主要用于對(duì)病原體抗體的檢測(cè)而進(jìn)行傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗體檢測(cè)相應(yīng)抗體。間接法成功的關(guān)鍵在于抗原的純度。特別應(yīng)注意除去能與一般健康人血清發(fā)生反應(yīng)的雜質(zhì)。若抗原中含有無關(guān)蛋白，也會(huì)因竟?fàn)幬蕉绊懓恍Ч?/p>

第61頁(yè)/共107頁(yè)競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原第62頁(yè)/共107頁(yè)

操作步驟：（1）將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體洗滌。（2）待測(cè)管中加受檢標(biāo)本和一定量酶標(biāo)抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應(yīng)，孵育洗滌。（3）加底物顯色：參考管中由于結(jié)合的酶標(biāo)抗原最多，故顏色最深。待測(cè)管顏色越淡，表示標(biāo)本中抗原含量越多。參考管顏色深度與待測(cè)管顏色深度之差，代表受檢標(biāo)本抗原的量。第63頁(yè)/共107頁(yè)競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時(shí)，可用此法檢測(cè)特異性抗體。標(biāo)本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)與固相抗原結(jié)合。標(biāo)本中抗體量越多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體愈少，因此陽(yáng)性反應(yīng)呈色淺于陰性反應(yīng)。

第64頁(yè)/共107頁(yè)捕獲包被法測(cè)抗體樣品中針對(duì)某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時(shí)存在，后者會(huì)干擾IgM抗體的測(cè)定。因此測(cè)定IgM抗本多用捕獲法。先將所有樣品IgM（包括特異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再測(cè)定特異性IgM。第65頁(yè)/共107頁(yè)

操作步驟：

（1）將抗IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗

IgM，洗滌。（2）加入稀釋的待測(cè)標(biāo)本：孵育后樣品中的IgM抗體被、固相抗體捕獲，洗滌。（3）加入特異性抗原試劑：其僅與固相上的特異性IgM

結(jié)合，洗滌。（4）加入針對(duì)抗原的酶標(biāo)抗體：使之與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)結(jié)合，洗滌。（5）加底物顯色：如有顏色顯示，則表示標(biāo)本中存在、特異性IgM抗體，是為陽(yáng)性反應(yīng)。第66頁(yè)/共107頁(yè)第67頁(yè)/共107頁(yè)親和素-生物素-ELISA法親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。每個(gè)分子由4個(gè)亞基組成，可以和4個(gè)生物素分子親密結(jié)合。生物素（biotin）又稱維生素H，存在于蛋黃中?？膳c蛋白質(zhì)、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產(chǎn)物。親和素與生物素的結(jié)合，雖不屬免疫反應(yīng)，但特異性強(qiáng)，親和力大，形成一種極為穩(wěn)定的復(fù)合體。把親和素和生物素與ELISA偶聯(lián)起來，就可大大提高ELISA的敏感度。

第68頁(yè)/共107頁(yè)第69頁(yè)/共107頁(yè)乙型肝炎血清學(xué)檢驗(yàn)臨床意義

乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒（HBV）引起的、以肝臟炎性病變?yōu)橹?，并可引起多器官損害的一種疾病。乙肝廣泛流行于世界各國(guó)，主要侵犯兒童及青壯年，少數(shù)患者可轉(zhuǎn)化為肝硬化或肝癌。傳播途徑：血液傳播、性接觸傳播和母嬰傳播第70頁(yè)/共107頁(yè)HBV的抗原有3種：表面抗原（HBsAg）、核心抗原（HBcAg）和e抗原（HBeAg）。表面抗原大量存在于感染者血液中，是HBV感染以及檢測(cè)的主要標(biāo)志。核心抗原是乙肝病毒核心顆粒的唯一結(jié)構(gòu)蛋白。由于它存在于Dane顆粒核心結(jié)構(gòu)表面，被表面抗原覆蓋，故不易在血循環(huán)中檢出。可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗-HBc。e抗原為可溶性蛋白質(zhì)，在病理上認(rèn)為是HBV復(fù)制以具有強(qiáng)感染性的一個(gè)指標(biāo)。抗-HBe的出現(xiàn)，是預(yù)后良好的征象。第71頁(yè)/共107頁(yè)HBsAg抗-HBsHBeAg抗HBe抗-HBc臨床意義－－－－－過去和現(xiàn)在均未感染HBV－

－－－＋曾感染HBV，急性感染恢復(fù)期－－－＋＋過去和現(xiàn)在均已感染過HBV－＋－－－預(yù)防注射疫苗－＋－＋＋既往感染；急性HBV感染恢復(fù)期－＋－－＋既往感染；急性HBV感染已恢復(fù)＋－－－＋急性HBV感染；慢性HBsAg攜帶者第72頁(yè)/共107頁(yè)HBsAg抗-HBsHBeAg抗HBe抗-HBc臨床意義＋－－＋＋急性HBV感染趨向恢復(fù)；慢性HBsAg

攜帶者，傳染性弱；長(zhǎng)期持續(xù)易癌變

＋－＋－＋急性或慢性乙肝，傳染性極強(qiáng)

＋－－－－急性HBV感染早期，HBsAg攜帶者

＋－＋－－急性HBV感染早期，傳染性強(qiáng)

－－＋＋＋急性感染中期

＋－＋＋＋急性感染趨向恢復(fù)；慢性攜帶者

＋－－＋－急性感染趨向恢復(fù)

－－－＋－急性感染趨向恢復(fù)

第73頁(yè)/共107頁(yè)艾滋病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)

艾滋病是一種危害性極大的傳染病，由感染艾滋病病毒（HIV病毒）引起。HIV是一種能攻擊人體免疫系統(tǒng)的病毒。它把人體免疫系統(tǒng)中最重要的T淋巴細(xì)胞作為主要攻擊目標(biāo)，大量破壞該細(xì)胞，使人體喪失免疫功能，HIV在人體內(nèi)的潛伏期平均為8～9年。第74頁(yè)/共107頁(yè)艾滋病從感染到發(fā)病的一般過程感染分期臨床分期維持時(shí)間感染標(biāo)志物傳染性原發(fā)感染潛伏期潛伏期2-4周抗體陰性

(窗口期)傳染危險(xiǎn)性高原發(fā)感染癥狀期急性HIV感染1-2周傳染危險(xiǎn)性高慢性感染潛伏期無癥狀HIV感染2－15年(平均8-10年)抗體陽(yáng)性有傳染性臨床發(fā)病期艾滋病0－3年(平均1-2

年)抗體陽(yáng)性抗原陽(yáng)性傳染性強(qiáng)第75頁(yè)/共107頁(yè)艾滋病檢測(cè)的方法檢驗(yàn)標(biāo)志物檢驗(yàn)?zāi)康臋z驗(yàn)方法HIV(1+2)抗體篩查試驗(yàn)金標(biāo)法、硒標(biāo)法

快速診斷試驗(yàn)明膠顆粒凝集試驗(yàn)(PA)

微孔板法酶聯(lián)免疫試驗(yàn)（ELISA）

第三代：雙抗原夾心法

第四代：增加檢測(cè)P24抗原確證試驗(yàn)免疫印跡法(WB)

手工/儀器第76頁(yè)/共107頁(yè)HIV抗體篩查試驗(yàn)第77頁(yè)/共107頁(yè)明膠顆粒凝集試驗(yàn)的操作和結(jié)果判斷第78頁(yè)/共107頁(yè)5

450/630nm下測(cè)定OD值混勻，加蓋，37℃溫育

洗板3

加入底物第二次特異性結(jié)合4

加入終止液1

加入樣品

洗板2

加入酶標(biāo)記物

加蓋，37℃溫育加蓋，37℃溫育第一次特異性結(jié)合酶聯(lián)免疫分析ELISA

（雙抗原夾心、兩步法）第79頁(yè)/共107頁(yè)HIV抗體檢測(cè)結(jié)果處理規(guī)范檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果檢驗(yàn)報(bào)告處理篩查試驗(yàn)陰性HIV抗體陰性陰性告知陽(yáng)性HIV抗體待復(fù)查上送確證確證試驗(yàn)陰性HIV抗體陰性（-）陰性告知陽(yáng)性HIV抗體陽(yáng)性（+）陽(yáng)性告知，個(gè)案調(diào)查不確定HIV抗體不確定（±）告知，3個(gè)月后復(fù)查共2次第80頁(yè)/共107頁(yè)樣品初篩檢測(cè)陽(yáng)性反應(yīng)陰性反應(yīng)篩查試劑復(fù)查原有試劑加另一種篩選試劑均陽(yáng)性反應(yīng)一陰一陽(yáng)均陰性反應(yīng)送確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)報(bào)告陰性第81頁(yè)/共107頁(yè)HIV抗體確證試驗(yàn)WesternBlot免疫印跡法■針對(duì)各種病毒蛋白的特異抗體■區(qū)分ELISA真陽(yáng)性與假陽(yáng)性■檢測(cè)HIV-1和HIV-2第82頁(yè)/共107頁(yè)全自動(dòng)免疫印跡儀第83頁(yè)/共107頁(yè)腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)的臨床應(yīng)用腫瘤標(biāo)志物的定義腫瘤標(biāo)志物（tumormarker，TM）是指在腫瘤的發(fā)生和增殖過程中，由腫瘤細(xì)胞本身所產(chǎn)生的或者是由機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞反應(yīng)而產(chǎn)生的，反映腫瘤存在和生長(zhǎng)的一類物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、激素、酶（同工酶）、多胺等?？稍谀[瘤患者血液或體液中檢測(cè)到腫瘤標(biāo)志物。第84頁(yè)/共107頁(yè)腫瘤標(biāo)志物的分類癌胚抗原類標(biāo)志物糖類抗原標(biāo)記物酶類標(biāo)志物激素類標(biāo)志物蛋白類標(biāo)志物第85頁(yè)/共107頁(yè)胚胎抗原類標(biāo)志物1、甲胎蛋白AFP

胎兒發(fā)育早期，由肝臟和卵黃囊合成的一種血清糖蛋白，電泳時(shí)位于白蛋白和α1球蛋白之間，胎兒出生后不久即逐漸消失。成人血清中含量甚微。參考值：AFP<25ug/L（ELISA）

第86頁(yè)/共107頁(yè)

臨床意義（1）原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者血清中AFP濃度明顯升高，約77.1%的患者AFP>300ng/mL，但也有18%的病人AFP并不升高。（2）良性肝病，如病毒性肝炎、肝硬化患者AFP濃度有不同程度的升高，但其水平通常低于100ng/mL。其升高原因主要是由于受損傷的肝細(xì)胞再生而形成幼稚化細(xì)胞，幼稚化的肝細(xì)胞具有產(chǎn)生AFP的能力。但隨著受損肝細(xì)胞的修復(fù)，AFP逐漸恢復(fù)正常。（3）生殖腺胚胎性腫瘤患者血清中AFP濃度可見升高。（4）婦女妊娠3個(gè)月后，血清AFP濃度開始升高，7~8個(gè)月時(shí)達(dá)到高峰，一般在400μg/L以下，分娩后3周恢復(fù)正常。若孕婦血清中AFP異常升高，應(yīng)考慮胎兒神經(jīng)管缺損畸形的可能性。第87頁(yè)/共107頁(yè)2、癌胚抗原CEA

是一種可溶性糖蛋白，胚胎期主要存在于胎兒的胃腸管、胰腺和肝臟。胃腸道惡性腫瘤時(shí)可見血清CEA升高，在乳腺癌、肺癌及其他惡性腫瘤中也可出現(xiàn)表達(dá)，并分泌于體液中。

參考值：CEA<5ug/L（ELISA）

第88頁(yè)/共107頁(yè)（1）血清CEA升高主要見于結(jié)腸癌、直腸癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌，其他惡性腫瘤也有不同程度的陽(yáng)性率。（2）隨著臨床應(yīng)用的發(fā)展，CEA變得越來越廣譜。主要用于連續(xù)的隨訪檢測(cè)，可用于惡性腫瘤手術(shù)后的療效觀察及預(yù)后判斷，也可用于對(duì)化療病人的療效觀察。（3）某些良性疾病，如直腸息肉、結(jié)腸炎、肝硬化、肝炎和肺部疾病也有不同程度的升高，但陽(yáng)性率較低。（4）98%的非吸煙者CEA<5ng/mL，吸煙者中約有3.9%的人CEA>5ng/mL

臨床意義第89頁(yè)/共107頁(yè)糖類抗原腫瘤標(biāo)志物1、糖類抗原12-5（CA12-5）是卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌的腫瘤標(biāo)志物分子量為20萬的糖蛋白可被單克隆抗體OC125所識(shí)別在卵巢腫瘤上皮和Mullerian副腎管來源的病理和正常組織中表達(dá)，其生物學(xué)功能不明。

參考值：CA12-5<3.5萬U/L（ELISA）

第90頁(yè)/共107頁(yè)（1）卵巢癌病人血清中CA125水平明顯升高。手術(shù)和化療后期水平很快下降。當(dāng)復(fù)發(fā)時(shí)，在臨床確診前幾個(gè)月便可呈現(xiàn)CA125增高，尤其卵巢癌轉(zhuǎn)移患者的血清CA125更明顯高于正常參考值。（2）其他非卵巢惡性腫瘤也有一定陽(yáng)性率，如乳腺癌40%，胰腺癌50%，胃癌47%，肺癌41.4%，結(jié)腸直腸癌34.2%，其他婦科腫瘤43%。（3）非惡性腫瘤，如子宮內(nèi)膜異位癥、盆腔炎、卵巢囊腫、胰腺炎、肝炎、肝硬化等疾病也有不同程度升高，但陽(yáng)性率較低，診斷時(shí)應(yīng)注意鑒別。（4）在許多良性和惡性胸腹水中發(fā)現(xiàn)有CA125升高，羊水中也能檢出較高濃度的CA125。（5）早期妊娠的頭3個(gè)月內(nèi)，也有CA125升高的可能。

臨床意義第91頁(yè)/共107頁(yè)2、糖類抗原15-3（CA15-3）

CA15-3是乳腺癌的最重要的特異性標(biāo)志物。30%-50%的乳腺癌患者的CA15-3明顯升高，是乳腺癌患者診斷和監(jiān)測(cè)術(shù)后復(fù)發(fā)、觀察療效的最佳指標(biāo)。參考值：CA12-5<2.5萬U/L（ELISA）第92頁(yè)/共107頁(yè)（1）乳腺癌患者常有CA15-3升高，但在乳腺癌的初期敏感性較低，約為60%，轉(zhuǎn)移性乳腺癌陽(yáng)性率可達(dá)80%。CA15-3可以作為原發(fā)性乳腺癌的輔助診斷指標(biāo)，也可以作為手術(shù)后隨訪，監(jiān)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的指標(biāo)。（2）其他惡性腫瘤，如肺癌、腎癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、原發(fā)性肝癌等也有不同程度的陽(yáng)性率。（3）肝臟、胃腸道、肺、乳腺、卵巢等非惡性腫瘤疾病，陽(yáng)性率一般低于10%。

臨床意義第93頁(yè)/共107頁(yè)3、糖類抗原19-9（CA19-9）

CA19-9是胰腺、胃、膽囊和腸癌的標(biāo)記物。參考值：CA19-9<3.7萬U/L（ELISA）第94頁(yè)/共107頁(yè)（1）胰腺癌、膽囊癌、膽管壺腹癌患者血清CA19-9水平明顯升高，尤其是胰腺癌晚期病人，血清CA19-9濃度可達(dá)40萬U/mL，陽(yáng)性率約為74.9%，是重要的輔助診斷指標(biāo)。（2）胃癌陽(yáng)性率約為50%，結(jié)腸癌陽(yáng)性率約為60%，肝癌陽(yáng)性率約為64.6%。（3）急性胰腺炎、膽囊炎、膽汁淤積性膽管炎、肝硬化、肝炎等疾病，CA19-9也有不同程度的升高，應(yīng)注意鑒別。

臨床意義第95頁(yè)/共107頁(yè)酶類腫瘤標(biāo)志物前列腺特異性抗原（PSA）PSA是前列腺的特異性標(biāo)記物 屬于器官特異性抗原，不具備腫瘤特異性

PSA屬于酶類腫瘤標(biāo)記物，具有糜蛋白酶樣和胰蛋酶的活性

PSA在正常男性含量小于4g/L

參考值：血清t-PSA<4.0ug/L（ELISA）

f-PSA<0.8ug/Lt-PSA/f-PSA>0.2第96頁(yè)/共107頁(yè)（1）PSA是前列腺癌標(biāo)志物。隨著年齡的增大，血清PSA會(huì)逐漸增加。（2）前列腺肥大、前列腺炎、腎脹和泌尿生殖系統(tǒng)的疾病患者，也可見t-PSA和f-PSA水平輕度升高，必須結(jié)合其他檢查進(jìn)行鑒別。（3）單獨(dú)使用t-PSA和f-PSA升高來診斷前列腺癌時(shí)很難排除前列腺肥大對(duì)前列腺癌診斷的影響，特別是當(dāng)t-PSA在5ng/mL~20ng/mL時(shí)。此時(shí)應(yīng)用f-PSA/t-PSA來判斷。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道