基因編輯技術(shù)和原理

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什么是基因編輯技術(shù)？

基因編輯是指對基因組進(jìn)行定點(diǎn)修飾的一項(xiàng)新技術(shù)。利用該技術(shù)，可以精確地定位到基因組的某一位點(diǎn)上，在這位點(diǎn)上剪斷靶標(biāo)DNA片段并插入新的基因片段。此過程既模擬了基因的自然突變，又修改并編輯了原有的基因組，真正達(dá)成了“編輯基因”。第2頁/共23頁

基因編輯的研究背景

傳統(tǒng)的動物育種方法受到種源的限制，其程需要耗費(fèi)大量的人力、物力和財(cái)力，經(jīng)歷漫長的培育過程。而且不同種間的雜交很困難，育種成果很難取得突破性進(jìn)展。第3頁/共23頁基因編輯原理

現(xiàn)代基因組編輯技術(shù)的基本原理是相同的，即借助特異性DNA雙鏈斷裂激活細(xì)胞天然的修復(fù)機(jī)制，包括非同源末端連接和同源重組修復(fù)兩條途徑。第4頁/共23頁

1.非同源末端連接（NHEJ）是一種低保真度的修復(fù)過程，斷裂的DNA修復(fù)重連的過程中會發(fā)生堿基隨機(jī)的插入或丟失，造成移碼突變使基因失活,實(shí)現(xiàn)目的基因敲除。如果一個外源性供體基因序列存在，NHEJ機(jī)制會將其連入雙鏈斷裂DSB位點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)的基因敲入。

（

移碼突變：在正常DNA分子中，堿基缺失或增加3的倍數(shù)，造成這位置之后的一系列編碼發(fā)生移位錯誤的改變，這種現(xiàn)象稱移碼突變。）第5頁/共23頁

2.同源重組修復(fù)（HR）是一種相對高保真度的修復(fù)過程，在一個帶有同源臂的重組供體存在的情況下，供體中的外源目的基因會通過同源重組過程完整的整合到靶位點(diǎn)，不會出現(xiàn)隨機(jī)的堿基插入或丟失。如果在一個基因兩側(cè)同時產(chǎn)生DSB，在一個同源供體存在的情況下，可以進(jìn)行原基因的替換。第6頁/共23頁

基因編輯原理第7頁/共23頁基因編輯技術(shù)的種類目前主要有3種基因編輯技術(shù)，分別為：人工核酸酶介導(dǎo)的鋅指核酸酶(zinc-fingernucleases，ZFN)技術(shù)；轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornucleases，TALEN)技術(shù)；RNA引導(dǎo)的CRISPR-Cas核酸酶技術(shù)(CRISPR-Cas9）。第8頁/共23頁

1.ZFN基因組編輯技術(shù)ZFN技術(shù)是第一代基因組編輯技術(shù)，其功能的實(shí)現(xiàn)是基于具有獨(dú)特的DNA序列識別的鋅指蛋白發(fā)展起來的。1986年Diakun等首先在真核生物轉(zhuǎn)錄因子家族的DNA結(jié)合區(qū)域發(fā)現(xiàn)了Cys2-His2鋅指模塊，到1996年，Kim等首次人工連接了鋅指蛋白與核酸內(nèi)切酶。2005年，Urnov等發(fā)現(xiàn)一對由4個鋅指連接而成的ZFN可識別24bp的特異性序列，由此揭開了ZFN在基因組編輯中的應(yīng)用。第9頁/共23頁ZFN由鋅指蛋白(ZFP)和FokⅠ核酸內(nèi)切酶組成。其中，由ZFP構(gòu)成的DNA識別域能識別特異位點(diǎn)并與之結(jié)合，而由FokⅠ構(gòu)成的切割域能執(zhí)行剪切功能，兩者結(jié)合可使靶位點(diǎn)的雙鏈DNA斷裂(DSB)。于是，細(xì)胞可以通過同源重組(HR)修復(fù)機(jī)制和非同源末端連接(NHEJ)修復(fù)機(jī)制來修復(fù)DNA。HR修復(fù)有可能會對靶標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行恢復(fù)修飾或者插入修飾，而NHEJ修復(fù)極易發(fā)生插入突變或缺失突變。兩者都可造成移碼突變，因此達(dá)到基因敲除的目的。第10頁/共23頁ZFN誘導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)可應(yīng)用于很多物種及基因位點(diǎn)，具有較好的發(fā)展?jié)摿?。但是目前?個方面的缺陷制約了該技術(shù)的推廣:(1)以現(xiàn)有的策略設(shè)計(jì)高親和性的ZFN，需要投入大量的工作和時間;(2)在細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)ZFN對細(xì)胞有毒性;(3)雖然三聯(lián)體設(shè)計(jì)具有一定特異性，但仍然存在不同程度的脫靶效應(yīng)。第11頁/共23頁

2.TALEN基因組編輯技術(shù)

2009年，研究者在植物病原體黃單胞菌(Xanthomonas)中發(fā)現(xiàn)一種轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子，它的蛋白核酸結(jié)合域的氨基酸序列與其靶位點(diǎn)的核酸序列有較恒定的對應(yīng)關(guān)系。隨后，TALE特異識別DNA序列的特性被用來取代ZFN技術(shù)中的鋅指蛋白。它可設(shè)計(jì)性更強(qiáng)，不受上下游序列影響，具備比ZFN更廣闊的應(yīng)用潛力。第12頁/共23頁TALENs包含兩個TALEN蛋白,每個TALEN都是由TALEarray與FokⅠ融合而成.其中一個TALEN靶向正義鏈上靶標(biāo)位點(diǎn),另一個則靶向反義鏈上的靶標(biāo)位點(diǎn).然后FokⅠ形成二聚體,在靶向序列中間的spacer處切割DNA,造成雙鏈DNA斷裂,隨后細(xì)胞啟動DNA損傷修復(fù)機(jī)制.針對不同的TALEN骨架,其最適宜的spacer長度不同,其長度范圍一般為12~20bp.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,TALENs在靶向DNA時,第一個堿基為T時其結(jié)合效果更佳。第13頁/共23頁目前，TALEN已經(jīng)成功應(yīng)用于酵母、哺乳動物和植物的位點(diǎn)特異性基因打靶，與鋅指核酸酶系統(tǒng)相比有較大的應(yīng)用優(yōu)勢，但仍然有些問題需要解決，例如:脫靶效應(yīng)、TALEN與基因組進(jìn)行特異結(jié)合與染色體位置及鄰近序列有關(guān)等。3.CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)第14頁/共23頁1987年，Ishino等在K12大腸桿菌的堿性磷酸酶基因附近發(fā)現(xiàn)串聯(lián)間隔重復(fù)序列，隨后發(fā)現(xiàn)這種間隔重復(fù)序列廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌的基因組中。經(jīng)過幾十年的研究，在2007年終于證明這種重復(fù)序列與細(xì)菌獲得性免疫的關(guān)系。第15頁/共23頁CRISPR/Cas系統(tǒng)由Cas9核酸內(nèi)切酶與sgRNA構(gòu)成.轉(zhuǎn)錄的sgRNA折疊成特定的三維結(jié)構(gòu)后與Cas9蛋白形成復(fù)合體,指導(dǎo)Cas9核酸內(nèi)切酶識別特定靶標(biāo)位點(diǎn),在PAM序列上游處切割DNA造成雙鏈DNA斷裂,并啟動DNA損傷修復(fù)機(jī)制.從不同菌種中分離的CRISPR/Cas系統(tǒng),其CrRNA(或者是人工構(gòu)建的sgRNA)靶向序列的長度不同,PAM序列也可能不同。第16頁/共23頁在這個系統(tǒng)中，只憑借一段RNA便能識別外來基因并將其降解的功能蛋白引起了研究者的興趣。直到2012年，Jinek等第一次在體外系統(tǒng)中CRISPR/Cas9為一種可編輯的短RNA介導(dǎo)的DNA核酸內(nèi)切酶，標(biāo)志著CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)成功問世。第17頁/共23頁

三種不同技術(shù)的比較第18頁/共23頁第19頁/共23頁基因編輯的優(yōu)勢與傳統(tǒng)的以同源重組和胚胎干細(xì)胞技術(shù)為基礎(chǔ)的基因打靶技術(shù)相比，基因編輯新技術(shù)保留了可