血紅蛋白的分離和提取

關(guān)于血紅蛋白的分離和提取第一頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三思考：“課題1--DNA的粗提取與鑒定”實驗理想的材料是什么？“課題3--血紅蛋白的提取和分離”這實驗理想的材料又是什么？原因是？答：雞的紅細(xì)胞具有細(xì)胞核，含有DNA，便于進行DNA的提取，哺乳類動物成熟的紅細(xì)胞無細(xì)胞核，結(jié)構(gòu)簡單，血紅蛋白含量豐富便于提取血紅蛋白。第二頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三一、基礎(chǔ)知識：（一）蛋白質(zhì)分離原理

（二）蛋白質(zhì)分離的方法

1）凝膠色譜法：又稱分配色譜法

2）電泳法（三）緩沖液的作用第三頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三二、實驗操作－－實驗步驟

血液組成成分

（1）洗滌紅細(xì)胞

（2）釋放血紅蛋白

（3）分離血紅蛋白

（4）透析血紅蛋白1、樣品處理3、純化4、純度鑒定2、粗分離SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白純度凝膠色譜法進行純化注意事項第四頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三蛋白質(zhì)提取與分離的依據(jù)－－蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)差異：

1.分子的形狀、大小

2.電荷性質(zhì)和多少

3.溶解度

4.吸附性質(zhì)

5.對其他分子親和力

第五頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三1.凝膠色譜法

一些微小多孔的球體（內(nèi)含許多貫穿的通道，具多孔的凝膠就叫分子篩）根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的方法（2）概念：（1）凝膠第六頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三3、原理：當(dāng)不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時，（）的蛋白質(zhì)容易進入凝膠內(nèi)部的通道，路程（），移動速度（），而（）的蛋白質(zhì)無法進入凝膠內(nèi)部的通道，只能在（）移動，路程（），移動速度（），相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因此得以分離。相對分子質(zhì)量較小較長較慢相對分子質(zhì)量較大凝膠外部較短較快總結(jié)：大分子經(jīng)過路程短，流動快；小分子經(jīng)過路程長，流動慢。第七頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動?；旌衔锷现疵摯蠓肿恿鲃涌煨》肿恿鲃勇占蠓肿邮占》肿?/p>

4、具體過程第八頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三2．凝膠電泳法：1）原理：不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)（正電荷或負(fù)電荷）、電量、分子形狀和大小不同，在電場中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場中的運動方向和運動速度不同。2）影響蛋白質(zhì)分子運動速度的因素電泳：帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程第九頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三3）常用電泳方法

瓊脂糖凝膠電泳

聚丙酰胺凝膠電泳

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

在測定蛋白質(zhì)分子量時通常用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，使用時可選用一組已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白同時進行電泳做對照，根據(jù)兩者的電泳區(qū)帶位置，利用相關(guān)計算公式算出相對分子量

SDS帶負(fù)電荷多的，因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷的差別，使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。第十頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三影響蛋白質(zhì)分子運動速度的因素

決定運動方向決定運動速率電荷性質(zhì)電荷量分子形狀分子大小√√√√第十一頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三由弱酸和相應(yīng)的強堿鹽溶解于水中。如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等緩沖溶液－－洗脫劑

（1）作用：

（2）配制：抵制外界酸堿對溶液pH的干擾而保持pH穩(wěn)定。（3）在血紅蛋白的提取和分離實驗中用的緩沖液的原因？

目的是利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的PH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能。第十二頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三血液組成成分閱讀思考：血液由______和________兩部分組成。血細(xì)胞中________細(xì)胞數(shù)量最多，細(xì)胞的含量最高的化合物是_____________。該化合物是由_____________和____________構(gòu)成的，其中每個亞基中都含有一個能與O2和CO2結(jié)合的______________________基團。血漿血細(xì)胞紅細(xì)胞血紅蛋白2條α-肽鏈2條β-肽鏈

亞鐵血紅素第十三頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三1.洗滌紅細(xì)胞閱讀思考：洗滌的目的是什么？洗滌的方法是什么？洗滌干凈的標(biāo)志是什么？血液100mL3g檸檬酸鈉低速短時間離心紅細(xì)胞血漿吸出血漿紅細(xì)胞5倍體積生理鹽水?dāng)嚢?0min重復(fù)洗滌3次，直至上清液沒有黃色第十四頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三2.釋放血紅蛋白閱讀思考：釋放血紅蛋白過程中，在洗滌好的紅細(xì)胞加入了哪些物質(zhì)，有什么用？目的分析：蒸餾水的作用是______________________________。加入甲苯的作用是____________________________。充分?jǐn)嚢璧哪康氖莀___________________________。使紅細(xì)胞大量吸水脹裂溶解紅細(xì)胞的細(xì)胞膜加速紅細(xì)胞的破裂第十五頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三濾紙過濾脂類物質(zhì)3.分離血紅蛋白分離過程紅細(xì)胞混合液高速離心10min離心管燒杯有機溶劑血紅蛋白第十六頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三20mmol/L磷酸緩沖液4.透析血紅蛋白透析的目的是什么？1mL1mL1mL去除血紅蛋白中的小分子雜質(zhì)第十七頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三純化－－凝膠色譜法1.凝膠色譜柱的制作：2.凝膠色譜柱的裝填：教材圖5－193.樣品的加入和洗脫第十八頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三注意：（1）凝膠顆粒＋蒸餾水→充分溶脹；凝膠裝填時盡量緊密；裝填時不能有氣泡存在：因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。

（2）裝完后，立即用緩沖液洗滌，使凝膠裝填緊密第十九頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三3.樣品的加入和洗脫

1.調(diào)液面2.加樣

4.洗脫5.收集緩沖液凝膠注意：洗脫過程不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象，否則重新填裝。3.再調(diào)液面

1.調(diào)液面2.加樣3.再調(diào)液面

4.洗脫、5.收集第二十頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三注意事項1.紅細(xì)胞的洗滌：

洗滌次數(shù)不能過少；低速、短時離心。2.凝膠的預(yù)處理：

沸水浴法，還能除去微生物和氣泡3.色譜柱的裝填：

裝填盡量緊密；無氣泡；洗脫液不能斷流。4.

色譜柱成功標(biāo)志：紅色區(qū)帶均勻一致地移動。Why？第二十一頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三知識總結(jié)血紅蛋白的提取和分離蛋白質(zhì)分子的差異性凝膠色譜法原理分離過程凝膠電泳法緩沖溶液組成作用蛋白質(zhì)的提取分離樣品處理粗分離純化純度鑒定第二十二頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三1、用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的過程中，關(guān)于蛋白質(zhì)的敘述，正確的是A、相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程大于相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)B、相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程小于相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)C、相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程等于相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)D、二者根本無法比較練習(xí)鞏固第二十三頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三2.相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)在凝膠中的進行過程可表示為圖中哪一個B第二十四頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三3.凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)時，凝膠的種類較多，但其作用的共同點是()

A.改變蛋白質(zhì)分子通過凝膠時的路徑

B.吸附一部分蛋白質(zhì)，從而影響蛋白質(zhì)分子的移動速度

C.將酶或細(xì)胞固定在凝膠中

D.與蛋白質(zhì)分子進行化學(xué)反應(yīng)，從而影響其移動速度4.在利用凝膠電泳法分離蛋白質(zhì)時，一定要加入緩沖液，其作用主要是()A.使酶的活性最高B.使蛋白質(zhì)的活性最高

C.維持蛋白質(zhì)所帶的電荷D.使蛋白質(zhì)帶上電荷AC第二十五頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三5、使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過程中，不同蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于A電荷的多少B分子的大小C肽鏈的多少D分子形狀的差異第二十六頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三6.下列是有關(guān)血紅蛋白提取和分離的相關(guān)操作，其中正確的是（）A．可采集豬血作為實驗材料B．用蒸餾水重復(fù)洗滌紅細(xì)胞C．血紅蛋白釋放后應(yīng)低速